Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

L'obiettivo generale di questa dimostrazione è quello di descrivere come marcare gli insetti con le proteine per la ricerca sulla dispersione o sulla migrazione. Inclusi in questa dimostrazione sono i metodi su come rilevare i segni mediante un sandwich o un test di immunoassorbimento enzimatico indiretto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla dispersione degli insetti.

Può essere utilizzato per studiare i modelli di migrazione degli insetti, le preferenze delle piante ospiti degli insetti e la diffusione delle specie invasive. I vantaggi di questa tecnica sono che il metodo di rilevamento è semplice ed economico. Adatto per un'elevata produttività e gli animali possono essere facilmente marcati direttamente nel loro habitat naturale.

Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché sembra più difficile di quanto non sia, perché la maggior parte dei ricercatori sul campo non ha l'esperienza con questa semplice tecnica. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta nel 1989. Allevavamo predatori di insetti dagli occhi grandi con una dieta artificiale.

Eravamo preoccupati che questi insetti non sarebbero stati predatori efficaci di un parassita Lygus dopo essere stati allevati in cattività per molto tempo con una dieta innaturale. In altre parole, sarebbero stati addomesticati. Avevamo bisogno di un metodo sicuro, efficace ed economico per distinguerli dopo il loro rilascio sul campo dalle loro controparti autoctone.

Nessuno degli attuali metodi di marcatura soddisfa questi criteri. Una precedente esperienza che ho avuto utilizzando la procedura ELISA per condurre analisi del contenuto intestinale del predatore alla ricerca di resti proteici specifici di Lygus, mi ha dato l'idea di applicare un marchio di proteina estranea sul predatore allevato in laboratorio. A sua volta, abbiamo potuto analizzare il campo raccolto per i resti di Lygus e per i resti di proteine estranee.

Per iniziare, raccogli circa 100 insetti di interesse da una colonia di laboratorio o dal campo e dividili in due contenitori di allevamento puliti. Caricare un contenitore con una normale bustina di dieta da 20 millilitri, per fungere da controllo negativo. Per l'altro, allaccia un pacchetto dietetico con un milligrammo di IgG-IgY di pollo.

Aggiungere un millilitro di soluzione e mescolare accuratamente. Se necessario, utilizzare qualsiasi insetti venga normalmente somministrato al posto della confezione. Dopo 24 ore dall'allevamento con questi pacchetti dietetici, fornire a entrambi i gruppi di insetti cibo normale non contrassegnato.

Agli intervalli di tempo desiderati, raccogli 20 singoli insetti da ogni coorte. Congelali a meno 20 gradi Celsius, fino a quando tutte le coorti richieste sono raccolte per l'esperimento. Per preparare una piastra da 96 pozzetti per l'ELISA, a ciascun pozzetto aggiungere 50 microlitri di anticorpo primario IgY anti-pollo di coniglio diluito uno su 500 in soluzione salina tamponata Tris, o TBS.

Lasciare incubare la piastra caricata per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, svuotare i pozzetti e aggiungere 300 microlitri di soluzione in blocchi a ciascun pozzetto. Questa è una soluzione di latte in polvere scremato all'uno per cento.

Lasciare incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione a blocchi, trasferire i singoli insetti congelati in provette da microcentrifuga caricate con un millilitro di TBS. Quindi, omogeneizza accuratamente ogni insetto con un pestello pulito.

Quando la piastra è pronta, caricare ogni pozzetto con 100 microlitri di un campione di insetto omogeneizzato. Ogni piastra a 96 pozzetti può ospitare 80 campioni. Lasciare vuote la prima e l'ultima colonna della targa per i controlli.

Nella prima colonna, caricare sette aliquote da 100 microlitri di TBS da solo e caricare un pozzetto con 100 microlitri di TBS con controllo positivo dell'albume. Nell'ultima colonna, caricare 100 microlitri di otto singoli preparati di insetti non contrassegnati. Lasciare incubare i campioni a temperatura ambiente per almeno un'ora.

Dopo l'incubazione, lavare accuratamente i pozzetti tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS-Tween. Attraverso la nostra esperienza abbiamo imparato che la maggior parte degli errori si verifica durante le fasi di lavaggio. Gli schizzi possono portare a un'elevata frequenza di reazioni false positive, quindi fai attenzione.

Dopo i lavaggi, aggiungere 50 microlitri di IgG-IgY anti-pollo di coniglio coniugato alla perossidasi di rafano e diluito da uno a 10.000 in una soluzione di latte all'uno per cento. Lasciare incubare la soluzione nei pozzetti per almeno un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare la piastra tre volte con PBS-Tween come prima.

Quindi, caricare i pozzetti con 50 microlitri di substrato TMB. Potresti iniziare a vedere subito un cambiamento di colore. Lasciare incubare la piastra per 10 minuti prima di leggerla con uno spettrofotometro per micropiastre.

Leggere la lastra a 650 nanometri e registrare i valori. Per marcare esternamente gli insetti, prepara bottiglie di plastica da un litro con fori di accesso e dividi 100 insetti in due bottiglie. Quindi, spruzzare gli insetti in un contenitore con un millilitro di acqua distillata, che funge da controllo negativo.

Quindi, collegare un nebulizzatore medico a un'uscita dell'aria e regolare il flusso d'aria in modo che il nebulizzatore produca vapore. Spruzzare gli altri insetti con un millilitro di soluzione di albume d'uovo di gallina al cinque percento. Il processo di spruzzatura dovrebbe richiedere dai due ai cinque minuti per essere completato.

Quindi, tappare i fori e lasciare asciugare completamente la soluzione a temperatura ambiente. Una volta essiccati, trasferire gli insetti nei loro normali contenitori di allevamento, con la loro dieta standard e mantenerli come al solito. Successivamente, raccogli gli insetti a intervalli di tempo predeterminati per il test.

Per controllare la ritenzione del segno esterno, utilizzare una procedura identica al test ELISA per testare il mantenimento del segno interno, con piccole modifiche. Dopo che gli insetti sono stati trasferiti in provette da microcentrifuga con TBS, lasciarli in ammollo su uno shaker orbitale a 120 giri/min per un'ora, invece di omogeneizzarli. Dopo aver immerso gli insetti, pipettare 100 microlitri di soluzione nei pozzetti della piastra e lasciare incubare la piastra per almeno un'ora.

Dopo aver lavato i campioni di insetti, aggiungere 300 microlitri di PBS con l'uno per cento di BSA a ciascun pozzetto. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, lavare i pozzetti due volte con PBS-Tween. Quindi, ad ogni pozzetto, aggiungere 50 microlitri di anticorpo primario anti-uovo albumina di coniglio, diluiti uno su ottomila in silhouette PBS-BSA.

Incubare la piastra per almeno un'ora e lavare i pozzetti come prima. Quindi, ad ogni pozzetto, aggiungere 50 microlitri di IgG anti-coniglio di capra coniugate alla perossidasi di rafano, e diluite una su duemila, in silhouette PBS-BSA. Lasciare incubare la piastra per almeno un'ora, a temperatura ambiente e poi procedere con il protocollo come precedentemente descritto.

La conservazione del marchio interno è stata testata in quattro punti temporali. Nel complesso, gli insetti trattati senza proteine hanno prodotto valori ELISA costantemente bassi. Considerando che, tutti gli insetti alimentati con la dieta arricchita di proteine hanno prodotto valori ELISA costantemente forti.

Anche i voti esterni sono stati testati in quattro punti temporali. Gli insetti che sono stati marcati localmente con albume d'uovo hanno prodotto valori costantemente forti. Com'era prevedibile, i controlli negativi spruzzati con acqua hanno registrato valori ELISA molto bassi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come contrassegnare gli insetti e analizzarli per la presenza del segno. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore e 30 minuti se eseguita correttamente. Nel corso di una giornata, è possibile elaborare 16 piastre di analisi con oltre 1000 campioni.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il test è estremamente sensibile. Pertanto, è imperativo che tutte le superfici, i contenitori e le attrezzature siano privi di contaminazione proteica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare i modelli di dispersione degli insetti a livello locale e di area in habitat agricoli, urbani, forestali e altri habitat naturali.

Abbiamo dimostrato su piccola scala l'esempio qui, tuttavia, la tecnica è stata utilizzata su scala molto più ampia per etichettare gli insetti direttamente nel loro habitat naturale utilizzando attrezzature spray commerciali. Siamo rimasti stupiti dalle applicazioni creative dei nostri collaboratori.