Name: Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo In-Vitro Ischemia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri come isolare e coltivare astrociti ippocampali sesso-specifici da topi neonati per studiare le risposte all'ischemia ipossica in vitro. Questo metodo consente di analizzare le differenze sessuali nella reattività degli astrociti.

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Programma di premi per le scienze cliniche e traslazionali di NCATS UL1 TR0000427 e KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 all'UW ICTR da NIH/NCATS e fondi da Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 da NINDS (Cengiz P) e NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Vorremmo ringraziare Albee Messing, PhD, per averci fornito i topi knockout GFAP.

NOTA: Questo studio è stato condotto in conformità con la raccomandazione della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institute of Health. Il protocollo animale è stato approvato dalla University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e del Comitato Usa. Primaria protocollo cultura astrociti che viene qui presentata è adottato dai protocolli presentati da Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Con alcune modifiche. 1. ippocampale dissezione e la cultura astrociti <ol><li> Preparare tutti i reagenti e materiali necessari, tra cui forbici chirurgiche, una pinza sottile liscia, pinze punta piatti, tovaglioli di carta, il sacchetto dei rifiuti, il 70% di etanolo e 2 piatti dissezione (3,5 centimetri di diametro) sul ghiaccio riempito con 2 Soluzione di ml Hank salina bilanciata (HBSS) ogni . Assicurarsi che il apparecchi chirurgici sono sterili (autoclave) prima procedura e usare tutti gli altri materiali (astrociti placcatura media: siero DMEM + 5% di cavallo +1% di penicillina-streptomicina, siero di cavallo, HBSS, 0,25% tripsina, vetrini, piastre di Petri, 15/50 mL, fiasche T25, etc.) come pre-sterile. </li><li> Delicatamente tenere e spruzzare la testa e il collo del cucciolo del mouse con il 70% di etanolo e decapitare con le forbici sterili affilate [Figura 1 (1)]. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana da posteriore ad anteriore cranio con piccole forbici lungo il cuoio capelluto per esporre il cervello [Figura 1 (2-3)]. </li><li> Tagliare il cranio con cura dal collo al naso con piccole forbici. Poi tagliare cranio anteriore ai bulbi olfattivi e inferiore al cervelletto per scollegare il cranio dalla base del cranio. </li><li> Fai una piccola incisione alla base del cranio e tagliare lungo la linea mediana. Utilizzare sterili pinze a punta piatta a staccarsi il cranio. Rimuovere il tronco cerebrale con l&#39;aiuto di una pinza curve. Rimuovere il cervello dal cranio e posto in primo piatto dissezione [Figura 1 (4-9)] 21. </li><li> Utilizzando una pinza curva, capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale del cervello è rivolto verso l&#39;alto e poi separare entrambi gli emisferi con una lama chirurgica sterile tagliente [Figura 1 (10,11)] </li><li> Staccare gli emisferi cerebrali e rimuovere con attenzione il tessuto mesencefalo e del talamo sporgenti con una sterile pinze curve piatte a rivelare l&#39;ippocampo, una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale [Figura 1 (12-14)]. </li><li> Rimuovere entrambi i lobi dell&#39;ippocampo [Figura 1 (15,16)] e sezionare con attenzione le meningi dai lobi tirando con le belle pinze. Questo passaggio consente di evitare la contaminazione della cultura finale astrociti dalle cellule meningee e fibroblasti. </li><li> Trasferire i lobi dell&#39;ippocampo preparati nel secondo piatto pieno di HBSS e riportarlo sul ghiaccio [Figura 1 (17,18)]. Pool sia dell&#39;ippocampo lobi da un singolo mouse (P0 - P2) per la preparazione di Ipponaculture Campal astrociti. Questo dà la giusta densità astrociti. Tritare lobi dell&#39;ippocampo usando una lama affilata chirurgico sterile (circa 4 volte). </li><li> Aspirare HBSS da piatto con una punta sterile, collegato a un mL pipetta 1 e aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina, mescolare, trasferire in un tubo conico sterili 15 ml e incubare il tessuto a 37 ° C per 20 minuti agitando delicatamente. </li><li> tubo Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante con cura utilizzando una pipetta di vetro sterile, collegato a una linea di vuoto. Aggiungere 10 ml astrociti placcatura medio e triturare (20 - 30 volte) utilizzando un incendio lucidato pipetta di vetro fino a pezzi di tessuto omogeneizzare. </li><li> tubo Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 2 ml di mezzi astrociti placcatura preriscaldata fresco. Passare cellule attraverso un filtro a maglia 70 micron (colino cella) in un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> intera sospensione cellulare piastra su un pallone di coltura T25 sterile Poly-D-lisina / laminina rivestito contenente 3 mL dimezzi astrociti placcatura, poi incubare il pallone a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Aspirare tutta la media al giorno- I n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e sostituirlo con 2 ml di mezzi freschi astrociti placcatura. Osservare la progressione e la confluenza astrocitari sotto microscopio ottico ogni volta che durante la sostituzione del supporto astrociti placcatura. NOTA: A DIV 1, tutti gli astrociti vitali sono attaccati alla superficie del pallone di coltura e le cellule morte o morenti che includono i neuroni sono galleggianti nel supernatante. A DIV 3, le cellule attaccate iniziano a dividersi per formare lo strato di cellule astrociti. In assenza di condizioni favorevoli, cultura è quasi privo di crescita neuronale. A DIV 7, strato astrociti è circa 80 - 90% confluenti e pochi microglia e cellule precursori degli oligodendrociti sono presenti sulla parte superiore dello strato di astrociti. </li><li> Aspirare il mezzo di placcatura dal pallone, aggiungere 2 ml di preriscaldata astrociti placcatura mezzo fresco, sciacquare unND rimuovere di nuovo a DIV 11, quando gli astrociti sono confluenti e pronti per sub coltura. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina, delicatamente ruotare il pallone un paio di volte e aspirare tripsina usando una pipetta di vetro sterile. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e lasciare che il pallone sedersi nella cappa coltura di tessuti per 4-5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la tripsina e mantenere il matraccio a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 10 min. Aggiungere 5 ml preriscaldata astrociti placcatura medio e staccare lo strato di astrociti toccando il pallone contro il palmo della mano (3 - 4 volte), seguito da dolce triturazione per ottenere completo distacco e raccogliere i astrociti in un tubo da 15 ml. </li><li> provetta da centrifuga a 300 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di media astrociti fresco placcatura. </li><li> Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare per un emocitometro e contare le cellule nella grande area centrale reticolata (1 mm 2) usando un microscopio a contrasto di fase invertita (obiettivo 10X). Multiply da 10 4 per stimare il numero di cellule per ml. Un pallone T25 produrrà ~ 1 x 10 6 cellule totali dissociato. Seed ~ 1 x 10 5 cellule in 2 ml astrociti medio placcatura in 12 mm di diametro Poly-D-lisina coprioggetto vetro preverniciato nel pozzo di un piatto della cultura 24 pozzetti. </li><li> Incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Eseguire OGD / Reox a DIV 12 - 14 (sezione 2). </li><li> Trattare le colture di astrociti in DIV 3 con 5 mM estere metilico (LME) cloridrato L-leucina fino DIV 11 se si desiderano culture ippocampali privi di microglia. Dopo LME incubazione, culture soggetti a agitazione (300 rpm per 1 ora) per rimuovere la contaminazione microglia. NOTA: LME è un agente citotossico microglia che è stato ampiamente utilizzato come metodo per eliminare proliferanti microglia 22. </li></ol> 2. OGD / Trattamento Reox <ol><li> supporti Aspirare dal vetrino contenenti cultura astrociti aderente (DIV 12 - 14) e risciacquare 3 volteruotando delicatamente la cultura piatto 24 pozzetti tenendo il vetrino un paio di volte con 1 mL di soluzione isotonica OGD (pH 7,4) contenente (in mm): 0 di glucosio, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl 2, e 0,81 MgSO 4. </li><li> Aggiungere 0,2 mL di soluzione OGD per bene per coprire il vetrino e incubare per 2 ore in un incubatore ipossico contenente il 94% N 2, 1% O 2 e il 5% di CO 2. Mescolare delicatamente con un agitatore orbitale (50 rpm) per i primi 30 min di ipossia per facilitare lo scambio di gas. </li><li> Incubare le cellule di controllo normossiche per 2 h in 5% CO 2 e aria atmosferica in un buffer identica alla soluzione OGD eccetto per l&#39;aggiunta di 5,5 mM di glucosio. </li><li> Per Reox, aspirare la soluzione OGD e aggiungere 2 ml di astrociti placcatura media. Incubare in 5% CO 2 e aria atmosferica a 37 ° C per 5 ore. </li></ol> 3. Immunocytochemical colorazione &lt;/ P&gt; <ol><li> Aspirare il terreno di coltura usando una pipetta di vetro sterile, collegato a una linea di vuoto e sciacquare rapidamente vetrino una volta con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (154 mM NaCl, 16 mm Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) al pozzo. Aspirare e aggiungere 2 ml di 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato (PBS). Incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Aspirare e aggiungere 1 ml di 0,1 M TBS, poi posto su un agitatore a dondolo per 2 minuti. Ripetere 3 volte. Aggiungere 1 mL soluzione bloccante (10% siero di capra, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) e incubare per 30 min a 37 ° C su un agitatore dondolo. </li><li> Aspirare soluzione bloccante e aggiungere monoclonale primario del mouse anticorpo anti-GFAP (0,2 mL di una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante) e policlonali di coniglio anti-S100B (1: 500) o policlonale di coniglio anti-HIF1α (1: 200) per 60 min a 37 ° C su un agitatore dondolo. </li><li> In alternativa, alcuni astrociti vengono incubate con policlonale di coniglio anti-Iba1 (1: 200) e mon il mouseoclonal anti-MAP2 di accedere alla cultura purezza. </li><li> Aspirare anticorpo primario e risciacquare vetrino con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,1 M TBS e mettendo su un agitatore a dondolo per 2 minuti e poi aspirare. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di una diluizione 1: 200 di capra anti-coniglio secondaria 488-coniugati e anti-topo anticorpi 568 coniugati nel bloccare soluzione per 60 min a 37 ° C su un agitatore dondolo. </li><li> Aspirare anticorpo secondario e risciacquare vetrino con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,1 M TBS e posto su un agitatore a dondolo per 2 minuti e poi aspirare. Ripetere due volte. </li><li> Rimuovere vetrino da ben asciutta e mettendo su una diapositiva posizionato su una slide-asciugatrice. Monte vetrino su una nuova diapositiva invertendo su una sola goccia di Vectashield hardset mezzo di montaggio con DAPI (1,5 ng / mL). </li><li> coprioggetto di immagine su un microscopio confocale utilizzando 20X obiettivo olio secco o 60X. Acquisire le immagini (512 x 512) per DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 tagged anticorpi GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Mantenere parametri di acquisizione costanti all&#39;interno del 20X e 60X gruppi. </li></ol> 4. determinazione del sesso Usando PCR <ol><li> Calore pup punta o ritagli di barretta a 95 ° C per 45 min a 50 mM NaOH e neutralizzare con pari volume di 1 M Tris, pH 6,8. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di DNA estratto da 19 ml della seguente miscela: 5 pmoli di primer per i geni Myog e Sry, tampone di reazione 1x, 0,2 millimetri ogni deossinucleotide e 8 U Taq polimerasi. </li><li> Utilizzare primer sequenze; Sry 5&#39;TCATGAGACTGCCAACCACAG3 &#39;, 5&#39;CATGACCACCACCACCACCAA3&#39; e Myog 5&#39;TTACGTCCATCGTGGACAGC3 &#39;, 5&#39;TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3&#39; 23. </li><li> Eseguire il seguente protocollo PCR: 95 ° C per 3 min quindi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 15 s, ricottura a 58 ° C per 15 s, e l&#39;allungamento a 72 ° C per 1 min. Dopo questi 30 cicli, la reazione si conclude con un finale C elongazione 72 ° per 1 min. </li><li> PC separatoR prodotti elettroforesi su gel di agarosio etidio bromuro contenente 2% e visualizzare sotto illuminazione UV. (Figura 2A.) ATTENZIONE! Etidio bromuro è un potenziale cancerogeno e deve essere maneggiata con cura e smaltito correttamente come da regolamento dell&#39;istituzione. </li></ol>

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<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).</li>
</ol>

Nessuno degli autori sono in competizione o interessi in conflitto.

Al fine di studiare le differenze di sesso nelle proprietà e la funzione degli astrociti in condizioni fisiologiche e patologiche, la preparazione degli astrociti primari sessuati in coltura cellulare è uno strumento importante da utilizzare. Nel presente studio riportiamo un altamente efficiente e un metodo riproducibile per la cultura di una popolazione omogenea altamente arricchito di astrociti dell&#39;ippocampo sessuati da neonato (P0-P2) C57Bl / 6 (wild type) o K19F (GFAP null) cuccioli di topo in vitro. ...

Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). crescente corpo di evidenze indicano che i ruoli di astrociti sono più di sostegno neuronale. Infatti, i ruoli di astrociti in condizioni fisiologiche possono essere molto complessa, come guidare la migrazione degli assoni sviluppo 1, regolazione del flusso sanguigno CNS 2, mantenendo l&#39;omeostasi pH della sinaptica liquido interstiziale 3, e partecipando la barriera ematoencefalica 4 e 5 la trasmissione sinaptica. In condizioni patologiche, astrociti rispondono al danno con un processo chiamato astrogliosis reattiva in cui la morfologia, numero, la posizione, la topografia (rispetto alla distanza da insulto) e funzione delle astrociti possono cambiare in modo eterogeneo 6,7. Astrogliosis visto seguente neonatale encefalopatia ischemica ipossica forse contribuire alla morbilità e la mortalità dei neonati <sup&gt; 8. studi clinici e sperimentali recenti indicano che la gravità del danno cerebrale sembra essere il sesso-dipendente e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto a femmine con lesioni cerebrali paragonabili 9-11. Sebbene la localizzazione della lesione dipende dall&#39;età gestazionale e la durata e la gravità dell&#39;insulto, ippocampo è una delle regioni più comunemente effettuata nel SNC dopo termine neonatale HI, e aumentato astrogliosis ippocampo è stato confermato da up-regolazione Protein fibrillare gliale acida (GFAP) 3 d dopo la HI neonatale 7,10,12,13. Differenze di genere nella funzione degli astrociti sono stati mostrati in entrambi i neonati e nei roditori adulti dopo ischemia cerebrale 14,15. Inoltre, maschio suscettibilità astrociti di ischemia in vitro è stato dimostrato da un aumento cell morte rispetto ai astrociti corticali femminili nella cultura 16. Differenze di sesso iniziano in utero e continuare fino alla morte 17. Negli ultimi dieci anni, l&#39;importanza di includere i sessi in condizioni sperimentali in coltura cellulare e in vivo studi sono stati l&#39;enfasi dell &#39;Istituto di Medicina e NIH di cercare la conoscenza fondamentale nelle differenze di sesso visto in condizioni fisiologiche e patologiche 17,18 . Sviluppo di metodi affidabili di isolare e mantenere popolazioni di sessuato astrociti dell&#39;ippocampo è essenziale per comprendere le basi cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. Il presente studio è stato progettato per fornire le tecniche per preparare culture dell&#39;ippocampo astrociti sesso-specifici arricchito da topi appena nati al fine di valutare il ruolo degli astrociti GFAP-immunoreattive seguenti ossigeno / glucosio Deprivation (OGD) e riossigenazione (Reox), inducendoHI in ambiente di coltura cellulare. Questa tecnica può essere utilizzata per testare qualsiasi ipotesi di pertinenza astrociti dell&#39;ippocampo nei maschi e nelle femmine neonatali in condizioni normossiche e ischemiche.

<table><tbody><tr><td>Terreni di coltura per astrociti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, cellula ad alto glucosiogro</td><td></td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>Concentrazione finale: 10%</td></tr> <tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td>Concentrazione finale: 1%</td></tr><tr><td>L-Leucina metil estere cloridrato</td><td>Aldrich</td><td>L1002-25G</td><td>Concentrazione finale: 5 mM</td></tr><tr><td>Soluzione per la digestione del tessuto cerebrale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>cellgro</td><td>25-050-CI</td><td>Concentrazione finale: 0,25% </td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% (vol/vol) etanolo</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina (PDL) 12 mm rotondo vetrini&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Grado per colture cellulari</td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Grado per colture cellulari</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro cellulare sterile&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 3,5 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pinze, fine&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>2-1032; 2-1033</td><td># 3c; # 5</td></tr><tr><td>Pinze, punta piatta</td><td>KLS Martin</td><td>12-120-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche da 13 cm</td><td>Aesculap</td><td>BC-140-R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>A1RSi&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5805000.017</td><td>5804R</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE 4450-1CE</td><td>MaxQ 4450&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Coniglio monoclonale</td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Sigma</td><td>M2320</td><td>Topo monoclonale</td></tr><tr><td>Anti-HIF1alpha</td><td>abcam</td><td>ab179483</td><td>Coniglio monoclonale</td></tr><tr><td>Anti-S100B</td><td>Sigma</td><td>HPA015768</td><td>Coniglio policlonale</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (cocktail)</td><td>Biolegend</td><td>837602</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (Coniglio IgG)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6101</td><td>contiene 4 reagenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Capra Anti Coniglio Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>Capra Anti Topo Alexa-Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr></tbody></table>

le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo<em&gt; in-vitro</em&gt; ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis seguente ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related svolge un ruolo in un aumento della morbilità e mortalità nei neonati. Recenti studi clinici indicano che la gravità della lesione cerebrale sembrano essere il sesso dipendente, e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di lesioni cerebrali HI-correlati, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto alle femmine con lesioni cerebrali simili. Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere le popolazioni altamente arricchito di sessuato astrociti dell&#39;ippocampo è essenziale per comprendere la base cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. In questo studio, si descrive un metodo per la creazione di specifiche culture astrociti dell&#39;ippocampo di sesso che sono sottoposti a un modello di ischemia in vitro, deprivazione di ossigeno e glucosio, seguito da riossigenazione. Successivamente astrogliosi reattiva è stata esaminata dal immunostaining per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e S100B. Questo metodo fornisce un utile strumento per studiare il ruolo del maschio e astrociti dell&#39;ippocampo femminili seguente neonatale HI, separatamente.

La comprensione dei ruoli delle funzioni astrociti sessuati in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche sono stati immensamente chiarito coltivando queste cellule in condizioni in vitro. L&#39;aspetto importante di eseguire coltura sessuato è quello di determinare il sesso del cucciolo del mouse prima del suo utilizzo. Abbiamo determinato il sesso del topo geneticamente mediante PCR e dalla valutazione visiva (Figura 2) 16. La metodologia di determi...

Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). Qui, stiamo riportando un metodo pratico di sessuato dell&#39;ippocampo protocollo cultura astrociti al fine di studiare i meccanismi alla base della funzione degli astrociti in cuccioli di neonato maschio e femmina dopo ischemia in vitro.

Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo<em&gt; In-Vitro</em&gt; Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è preparare colture arricchite di astrociti ippocampali specifiche per sesso da topi neonati, come strumento per studiare i ruoli specifici per sesso degli astrociti in seguito a deprivazione di ossigeno e glucosio e successiva reossigenazione, al fine di riprodurre in vitro l'ischemia ipossica in un ambiente di coltura cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave di natura meccanicistica e traslazionale relative al ruolo specifico per sesso degli astrociti ippocampali dopo ischemia ipossica nei cervelli in sviluppo di maschi e femmine. Dissezionare il cervello dalla testa di un topo neonato utilizzando piccole forbici per praticare un'incisione mediana da posteriore ad anteriore attraverso la cute, esponendo così il cranio.Tagliare con attenzione la linea mediana del cranio dal collo fino al naso. Utilizzare pinze sterili con punta piatta per rimuovere il cranio. Rimuovere il bulbo con l'aiuto di pinze curve e posizionare il cervello rimanente in una bacinella per dissezioni.Utilizzando pinze curve, capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso l'alto, quindi separare gli emisferi con una l

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Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi gialla di Lucifero. J. Vis. Exp. (2019).  Questo video dimostra l'uso della ionoforesi con colorante fluorescente per studiare la morfologia degli astrociti in fette di cervello fisse. Descrive in dettaglio la perforazione del soma degli astrociti con un elettrodo per rilasciare un colorante anionico e idrofilo nel citoplasma sotto una corrente a bassa tensione, consentendo al colorante di...

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi con colorante fluorescente in una fetta di cervello di topo fissa

Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Le colture neuronali dell'ippocampo embrionale primario dissociate sono utili per studiare i meccanismi di segnalazione coinvolti nella morte dei neuroni. Il sessaggio degli embrioni prima dell'isolamento e della dissociazione dell'ippocampo consente la preparazione di colture maschili e femminili separate, che consentono al ricercatore di identificare e studiare la segnalazione cellulare sesso-specifica.

Colture neuronali stratificate per sesso per studiare le vie di morte delle cellule ischemiche

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Abbiamo effettuato l'occlusione unilaterale dell'arteria carotica postnatale giorno 7-10 CD-1 del mouse cuccioli per creare un modello di (HI) hypoxic-ischemica neonatale e studiato gli effetti del trauma cranico HI. Abbiamo studiato le funzioni neurobehavioral in questi topi rispetto ai topi normali non azionato.

Valutazioni di neurobehavioral in un modello murino di ferita di cervello Hypoxic-ischemica neonatale

Il presente manoscritto descrive come isolare le arteriole e i capillari ippocampali dal cervello del topo e come pressurizzarli per la miografia a pressione, l'immunofluorescenza, la biochimica e gli studi molecolari.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Questo protocollo descrive i metodi per il sezionamento, la colorazione e l'imaging di sezioni di tessuto fluttuanti del cervello del topo, seguito da una descrizione dettagliata dell'analisi del volume del territorio degli astrociti e della sovrapposizione o della piastrellatura del territorio degli astrociti.

Analisi del volume e della piastrellatura del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto fluttuanti spesse

Il protocollo descrive una lieve lesione cerebrale traumatica in un modello murino. In particolare, viene spiegato un protocollo passo-passo per indurre un lieve trauma cranico chiuso della linea mediana e la caratterizzazione del modello animale.

Modello elettromagnetico controllato a testa chiusa di lieve lesione cerebrale traumatica nei topi

Questo protocollo descrive l'espressione ectopica mediata da virus di Neurod1 in seguito a ictus ischemico corticale. Neurod1 viene somministrato (1) utilizzando il sistema Cre-Flex AAV in topi wild-type durante la fase subacuta post-ictus (7 giorni) e (2) utilizzando un singolo vettore AAV in topi reporter condizionali durante la fase cronica post-ictus (21 giorni).

Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dell'espressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'ipossia nei topi neonatali somministrandoli in ambienti controllati con concentrazioni di ossigeno variabili. I modelli murini sottoposti a variazioni di ossigeno alla nascita hanno variato durevolmente l'espressione dei miRNA coinvolti nell'induzione di cambiamenti fenotipici comportamentali come l'autismo.

L'ipossia altera i livelli di miRNA coinvolti nell'ereditarietà non mendeliana del disturbo dello spettro autistico nei topi

Scopri come isolare e coltivare astrociti ippocampali sesso-specifici da topi neonati per studiare le risposte all'ischemia ipossica in vitro. Questo metodo consente di analizzare le differenze sessuali nella reattività degli astrociti.

Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo

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