Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo In-Vitro Ischemia
25 ottobre 2016
Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). Qui, stiamo riportando un metodo pratico di sessuato dell'ippocampo protocollo cultura astrociti al fine di studiare i meccanismi alla base della funzione degli astrociti in cuccioli di neonato maschio e femmina dopo ischemia in vitro.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di preparare colture arricchite di astrociti ippocampali sesso-specifici da topi neonati come strumento per studiare i ruoli sesso-specifici degli astrociti dopo la privazione e la riossigenazione di ossigeno e glucosio al fine di imitare l'ischemia ipossica in vivo in un ambiente di coltura cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande meccanicistiche e traslazionali chiave relative al ruolo sesso-specifico degli astrociti ippocampali dopo l'ischemia ipossica nello sviluppo di cervelli maschili e femminili. Seziona il cervello dalla testa di un cucciolo di topo appena nato usando piccole forbici per creare un'incisione della linea mediana posteriore e anteriore attraverso la pelle per esporre il cranio.
Tagliare con cura la linea mediana del cranio dal collo al naso. Usa una pinza sterile a punta piatta per staccare il cranio. Rimuovere il tronco encefalico con l'aiuto di una pinza curva e posizionare il cervello rimanente in un piatto da dissezione.
Usando una pinza curva, capovolgi il cervello in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso l'alto e poi separa gli emisferi con una lama chirurgica affilata e sterile. Con una pinza curva piatta, staccare gli emisferi cerebrali e rimuovere con cura il mesencefalo sporgente e il tessuto talamico per rivelare l'ippocampo, una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale. Rimuovere entrambi i lobi dell'ippocampo e pulire accuratamente le meningi e i fibroblasti dalla superficie dei lobi tirando con una pinza fine.
Trasferisci entrambi i lobi dell'ippocampo da un singolo topo in un secondo piatto riempito con circa 5 millilitri di HBSS e mettili sul ghiaccio. Tritare i lobi circa 4 volte utilizzando una lama chirurgica sterile affilata. Utilizzare una pipetta sterile da 1 millilitro per trasferire l'HBSS e il tessuto in una provetta conica sterile da 50 millilitri, quindi centrifugare a 300 volte G per 5 minuti.
Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante. Aggiungere 3 millilitri di tripsina allo 0,25%, mescolare e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 20 minuti agitando delicatamente. Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta a 300 volte G per 5 minuti.
Dopo la centrifuga, utilizzare una pipetta di vetro sterile per aspirare accuratamente il surnatante e quindi aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura per astrociti preriscaldato. Triturare da 20 a 30 volte utilizzando una pipetta di vetro lucidata a fuoco. Dopo un'altra centrifugazione di 5 minuti a 300 volte G, aspirare il surnatante e aggiungere 2 millilitri di terreno di placcatura per astrociti.
Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro a maglie da 70 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere l'intera sospensione cellulare a un pallone di coltura T-25 sterile rivestito contenente 3 millilitri di terreno di coltura per astrociti. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, osservare la progressione della confluenza astrocitaria al microscopio ottico, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 millilitri di terreno di placcatura astrocitario fresco. Circa 11 giorni in vitro, raccogliere gli astrociti confluenti aspirando il terreno e quindi aggiungendo 2 millilitri di tripsina allo 0,25%. Ruotare delicatamente il pallone alcune volte e poi aspirare la tripsina utilizzando una pipetta di vetro sterile.
Aggiungere altri 2 millilitri di tripsina allo 0,25% e lasciare riposare il pallone a temperatura ambiente per 4-5 minuti. Dopo aver rimosso la tripsina, posizionare il pallone a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di CO2 per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 5 millilitri di terreno di placcatura per astrociti e staccare lo strato astrocitario battendo il pallone 3 o 4 volte.
Triturare delicatamente la sospensione cellulare sul fondo del pallone per ottenere il distacco completo e quindi raccogliere gli astrociti in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare la provetta a 300 volte G per 5 minuti. Aspirare il surnatante e quindi aggiungere 1 millilitro di terreno di placcatura per astrociti fresco.
Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a un emocitometro e utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito con un obiettivo 10x per contare le cellule nell'ampia area centrale a griglia. Diluire le cellule a circa 1 volta da 10 a 5 cellule per 2 millilitri di terreno di placcatura degli astrociti. Pipettare 2 millilitri di sospensione cellulare su un vetrino coprioggetti rivestito di poli-D lisina nel pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti.
Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica. Per iniziare la privazione di ossigeno e glucosio, aspirare il terreno dal vetrino coprioggetti contenente gli astrociti aderenti e risciacquare una volta con 1 millilitro di soluzione isotonica di OGD. Aggiungere 0,2 millilitri di soluzione OGD al pozzetto e metterlo in un'incubatrice ipossica.
Mescolare delicatamente con uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min per i primi 30 minuti di ipossia. Per la riossigenazione, sostituire la soluzione OGD con 2 millilitri di terreno di placcatura per astrociti e incubare in anidride carbonica al 5% e aria atmosferica a 37 gradi Celsius per 5 ore. Questa immagine in immunofluorescenza mostra la purezza della coltura primaria di astrociti dell'ippocampo di topo.
La coltura degli astrociti è stata immunocolorata per mostrare il marcatore dei dendriti neuronali, MAP2, in rosso, e il marcatore della microglia, IBA1, in verde. I nuclei sono colorati con DAPI che appare blu. La freccia indica la contaminazione da microglia.
Questa immagine rappresentativa in immunofluorescenza di astrociti ippocampali in coltura in condizioni normossiche, mostra l'immunoreattività GFAP in rosso e la marcatura HIF1-alfa in verde. Anche in questo caso, i nuclei sono colorati con DAPI che appare blu. La freccia indica una bassa espressione di HIF1-alfa.
Dopo 2 ore di privazione di ossigeno e glucosio e 5 ore di riossigenazione, l'espressione di HIF1-alfa è risultata aumentata negli astrociti ippocampali in coltura, come indicato dalla punta di freccia che indica un'elevata espressione nucleare di HIF1-alfa. L'espressione di GFAP e l'espressione di S100b sono risultate sovraregolate in colture di astrociti ippocampali di topi maschi in seguito a privazione di ossigeno e glucosio e rexoygenation. L'upregolazione di S100b e GFAP è stata osservata anche negli astrociti ottenuti da topi femmine.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR quantitativa, il western blotting, il siRNA e le colorazioni immunoistochimiche per rispondere a ulteriori domande come i cambiamenti specifici del sesso in alcune espressioni geniche e proteiche a seguito di ischemia in vitro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare gli effetti e le conseguenze dell'ictus nell'ippocampo studiando gli astrociti in coltura.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di astrociti ippocampali con specificità sessuale da topi neonati, al fine di studiarne le risposte alla privazione di ossigeno e glucosio (OGD) e alla reossigenazione, modellando in vitro il danno cerebrale ipossico-ischemico (HI). Il metodo consente di indagare le differenze dipendenti dal sesso nella reattività degli astrociti, aspetto rilevante per comprendere la base cellulare del danno cerebrale HI neonatale e la sua maggiore gravità nei maschi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Danno Cerebrale Neonatale
Sfondo
- L'astrogliosi dopo un danno cerebrale correlato all'ischemia-ipossia contribuisce alla morbilità e alla mortalità nei neonati.
- Studi clinici mostrano che i neonati di sesso maschile sono più suscettibili agli esiti neurologici gravi da lesione ischemica-ipossica rispetto alle femmine.
- Comprendere le differenze sessuali a livello cellulare richiede metodi affidabili per isolare popolazioni di astrociti classificati per sesso.
- La reattività degli astrociti viene comunemente valutata mediante marcatori come GFAP e S100B.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la preparazione di colture arricchite di astrociti ippocampali specifiche per sesso da topi neonati.
- Modellare in vitro l'ischemia utilizzando la deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) e la reossigenazione in queste colture.
- Esaminare le risposte specifiche per sesso degli astrociti a lesioni simili a quelle da ischemia-ipossia (HI).
Metodi Utilizzati
- Dissotomia degli ippocampi da cervelli di topi neonati, separati per sesso.
- Dissociazione enzimatica e triturazione meccanica per ottenere sospensioni cellulari singole.
- Coltura di astrociti su coprislip rivestiti con poli-D-lisina e mantenimento in mezzo di semina per astrociti.
- Induzione di OGD seguita da reossigenazione per mimare un danno ischemico-ipossico.
- Immunomarcatura per marcatori degli astrociti (GFAP, S100B), neuronali (MAP2) e microgliali (IBA1), e per l'espressione di HIF1-alpha.
Risultati principali
- Cultura altamente arricchita di astrociti ippocampali specifici per sesso, stabilita con successo.
- L'immunomarcatura ha confermato la purezza degli astrociti e identificato una lieve contaminazione da microglia.
- L'OGD e la riossigenazione hanno aumentato l'espressione nucleare di HIF1-alpha negli astrociti.
- Entrambe le colture di astrociti maschili e femminili hanno mostrato un aumento di GFAP e S100B dopo OGD/riossigenazione, con differenze specifiche per sesso osservate.
Conclusioni
- Questo protocollo consente lo studio delle risposte astrocitiche specifiche per sesso a lesioni simili all'ischemia-ipossia (HI) in vitro.
- Fornisce uno strumento prezioso per indagare i meccanismi cellulari alla base delle differenze di sesso nelle lesioni cerebrali neonatali.
- Il metodo permette ulteriori analisi molecolari, come qPCR e western blotting, per esplorare i cambiamenti nell'espressione genica e proteica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento e la caratterizzazione affidabili di astrociti ippocampali specifici del sesso dopo un'ischemia in vitro colmano una lacuna fondamentale nella comprensione dei meccanismi dipendenti dal sesso alla base del danno cerebrale ipossico-ischemico neonatale. Questa capacità consente una riduzione del rischio meccanicistica e una maggiore affidabilità predittiva per i programmi di scoperta precoce mirati alla neuroprotezione mediata dagli astrociti. Il metodo favorisce la continuità traslazionale fornendo una piattaforma per la valutazione quantitativa delle differenze di sesso nelle risposte cellulari al danno ischemico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della reattività astrocitaria dipendente dal sesso nei confronti del danno ischemico a livello cellulare.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando il contributo degli astrociti alla neuropatologia di genere-specifica.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli per interventi modulanti gli astrociti nel danno cerebrale neonatale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce colture di astrociti validate, specifiche per sesso, per saggi molecolari e farmacologici successivi.
- Consente una quantificazione riproducibile dei marcatori degli astrociti (GFAP, S100B) dopo lesione, per la standardizzazione dei saggi.
- Permette lo screening di composti candidati per effetti differenziali sulle risposte degli astrociti maschili rispetto a quelli femminili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati in vitro alle osservazioni cliniche sulla gravità del danno cerebrale neonatale dipendente dal sesso.
- Consente lo sviluppo di strategie neuroprotettive aggiustate per il rischio, con profili di efficacia specifici per sesso.
- Supporta la scoperta di biomarcatori per studi traslazionali in modelli preclinici di danno ipossico-ischemico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica permettendo la verifica delle ipotesi, la validazione dei bersagli e la valutazione quantitativa delle risposte astrocitarie specifiche per sesso nei confronti di un insulto ischemico.
- Biologia della scoperta: Supporta studi meccanicistici sui percorsi di danno mediati dagli astrociti e sulle differenze di sesso.
- Screening: Fornisce una piattaforma per letture riproducibili e quantitative dei marcatori di attivazione astrogliale.
- Analisi: Consente la misurazione dell'espressione di GFAP, S100B e HIF1-alpha per analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei risultati ottenuti in vitro con esiti clinici dipendenti dal sesso.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro riutilizzabile per diverse indagini molecolari e farmacologiche in neurobiologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulla neuroprotezione di genere.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento degli astrociti e la modellizzazione delle lesioni per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione delle strategie neuroprotettive mirate al sesso e la priorità all'interno del portafoglio di ricerca.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento degli asset proporzionato al rischio, affrontando esiti neurologici dipendenti dal sesso.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione del cervello neonatale e nelle tecniche di coltura cellulare primaria.
- Richiede l'accesso a strumentazione specializzata per la modellizzazione dell'ipossia e per l'immunomarcatura.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi dei protocolli di isolamento cellulare, induzione del danno e quantificazione dei marcatori.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per altre regioni cerebrali o stadi di sviluppo.
- Le limitazioni potenziali includono una lieve contaminazione da microglia e variabilità nel rendimento degli astrociti.
