La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

L'obiettivo generale di questa Quantificazione dell'Actina Punta Filamentosa in Neuroni in Colture è quello di introdurre un metodo utile per studiare l'integrità e la cognitività delle strutture sinaptiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze sulla spinogenesi, la plasticità sinaptica e la stabilità sinaptica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un protocollo dettagliato per la coltura neuronale primaria, dopo l'identificazione e la quantificazione dei punti F-actina.

Quando l'obiettivo del raggiungimento è sconosciuto, è necessario stimare l'integrità generale delle strutture ratia fundantric. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo studiando il danno neuronale indotto da droghe d'abuso come la cocaina e proteine tossiche per l'HIV come, tat e JP 120 Due giorni prima di impostare il rivestimento di coltura 12, piastre con fondo di vetro da 35 millimetri, con due millilitri di soluzione di lavoro di poli-L lisina. E conserva i piatti nella cappa durante la notte per mantenerne la sterilità.

Il giorno successivo, scartare l'agente di rivestimento e sciacquare le stoviglie con acqua distillata doppia. Lasciare asciugare i piatti per un'ora sotto la cappa. Quindi trasferire due millilitri di terreno di placcatura su ogni piatto.

E incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica. Il giorno della coltura, metti il cervello raccolto in una capsula di Petri contenente HBSS freddo. Quindi, fissando un cervello con una pinzetta, usa la pinza curva per separare gli emisferi e rimuovere le meningi.

Isolare le cortecce frontali e trasferire i pezzi in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri. Aggiungere due millilitri di HBSS fresco e 20 microlitri di tripsina EDTA alla provetta e incubare i tessuti neurali per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Con un leggero vortice ogni pochi minuti.

Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare tutto il vecchio HBSS. E risciacquare le cortecce due volte con HBSS fresco. Dopo il secondo lavaggio, immergere il tessuto nell'inibitore della tripsina.

Mescolare bene e lasciare riposare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare i fazzoletti due volte con HBSS fresco. Ora usa una pipetta di vetro con un bulbo di gomma per triturare molto lentamente i pezzi di cervello da 10 a 15 volte.

Quindi, utilizzando una pipetta calibrata dotata di puntale sterile di diametro ridotto, triturare nuovamente molto lentamente il liquame tissutale. Quando la soluzione è omogenea, piastrate le cellule alla densità appropriata nelle piastre di coltura pre-rivestite per un'incubazione notturna nell'incubatore di coltura cellulare. Dopo 24 ore, sostituire il terreno di placcatura con un terreno basale stretto privo di siero di crescita completo appena preparato.

E rimetti le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per almeno 12-14 giorni. La placcatura a bassa densità è importante per visualizzare i singoli neuroni. E il mezzo basale neuronale è fondamentale per ridurre al minimo la perforazione dell'astrocisi all'interno delle colture cellulari.

Per etichettare le cellule per l'immunocitochimica, lavare prima due volte la piastra di coltura cellulare con fondo di vetro con PBS. Quindi fissare le cellule con il quattro percento di paraformaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente. Seguito da due lavaggi PBS.

Successivamente, permeabilizzare le cellule con lo 0,1% di Triton X 100 in PBS per cinque minuti ed etichettarle con un colorante specifico per F-actina a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, sciacquare le cellule due volte con PBS e bloccare qualsiasi colorazione non specifica della superficie cellulare con siero di capra normale al 10%. Al termine dell'incubazione, etichettare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius con anticorpo policlonale anti-map due di pollo.

La mattina successiva, sciacquare le cellule due volte con PBS ed etichettarle con un anticorpo secondario appropriato. Dopo due ore a temperatura ambiente, sciacquare nuovamente le cellule con PBS ed etichettarle con 10 microlitri di huxs per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le cellule due volte con PBS e conservarle con 100 microlitri di reagente anti-sbiadimento.

Entro tre giorni da questa colorazione, accendere il microscopio fluorescente e selezionare l'obiettivo 20 X. Successivamente, nel software del microscopio, impostare la dimensione dell'immagine in pixel su 1600 per 1200 e la risoluzione dell'immagine di 0,17 micron per pixel su zoom 1X. Trasferire il piatto di cellule sul tavolino del microscopio.

E acquisire immagini dei neuroni della mappa F-actina 2 co-marcati sotto i canali fluorescenti verde e rosso. Quando tutte le immagini sono state ottenute, scegli cinque immagini di singoli neuroni nei canali verde, rosso e blu con pergole dendritiche chiaramente definite. E utilizzare l'immunofluorescenza a mappa continua due per identificare le strutture ricche di F-actina nei segmenti dendritici del secondo ordine.

Ruota orizzontalmente l'area selezionata delle immagini. E copia e incolla la regione come una nuova immagine. Quindi sottrarre la fluorescenza dello sfondo dell'immagine e utilizzare il software per contare il numero di punti F-actina verde brillante.

Utilizzare osservatori indipendenti addestrati per misurare la lunghezza dei segmenti dendritici selezionati. E poi esporta i numeri dei punti e i dati sulla lunghezza del segmento dendritico in un file di foglio di calcolo. Assicurarsi che gli osservatori includano i punti di postura F-actina con un'intensità di fluorescenza rosa di almeno il 50% sopra l'intensità media di colorazione nell'asta dendritica in ciascun segmento selezionato.

Infine, calcola la densità secondo la formula, esprimendo i dati come il numero di F-actina puncta per dieci micron di dendrite. Qui, le immagini di contrasto interferenziale differenziale dimostrano i cambiamenti morfologici osservati nello sviluppo dei neuroni corticali fetali di ratto ai giorni da 4 a 27 in vitro. Si noti l'aumento della lunghezza e del numero dei dendriti man mano che i neuroni primari del ratto coltivato maturano.

Poiché la marcatura della F-actina con falloidina è molto rapida, è possibile stimare visivamente l'integrità della rete sinapto-dendritica prima di procedere con la marcatura immunocitochimica degli anticorpi. Map2 colora i dendriti intatti, confermando che i punti F-actina si trovano sui dendriti neuronali e non sono localizzati in altre cellule, come gli astrociti. Nelle immagini ad alta risoluzione, si possono osservare strutture ricche di F-actina contenenti filopodi, sporgenze della colonna vertebrale e chiazze di F-actina.

In questo esperimento per valutare il danno sinapto-dendritico indotto da HIV 1 tat, la colorazione Map2 ha rivelato un minor numero di rami dendritici e una diminuzione della F-actina nei neuroni corticali di ratto dopo il trattamento con HIV 1 tat. Infatti, i punti F-actina aumentano o diminuiscono in risposta al trattamento sperimentale. Ad esempio, in questo esperimento, quando i neuroni in coltura sono stati trattati con l'antagonista non competitivo del recettore NMDA, la memantina, i puncta positivi alla F-actina hanno sperimentato un aumento significativo della densità.

Al contrario, il trattamento con combinazione di metanfetamina e HIV1 ha provocato una significativa perdita della F-actina puncta. Dopo aver acquisito immagini ad alta risoluzione dei neuroni Map2 marcati con F-actina del carbone, ricordarsi di avere due osservatori addestrati che selezionino segmenti dei dendriti di secondo ordine per l'analisi delle densità dei punti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca neuroscientifica.

Non solo per il monitoraggio della sinaptopatia acuta, ma anche per lo studio del recupero sinaptico e dei processi sperimentali di ripristino neurale. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un metodo affidabile che misuri l'integrità sinaptica della rete dendritica neurale.