Name: La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Impara a quantificare i puncta di F-actina nei neuroni corticali di ratto per studiare l'integrità sinaptica e la plasticità. Questo metodo combina coltura neuronale primaria, immunocitochimica e analisi di imaging.

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Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIH DA013137, DA031604 e HD043680. Un supporto parziale è stato fornito da una borsa di formazione NIH T32 in scienze biomediche-comportamentali.

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali presso la University of South Carolina (numero garanzia: A3049-01). 1. a bassa densità neuronale embrionale Cultura <ol><li> La preparazione per la cultura neuroni corticali primarie <ol><li> soluzioni: <ol><li> Preparare soluzione stock Poly-L-lisina sciogliendo 5 mg di poli-L-lisina in 10 ml di tampone borato. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro diluendo 1 ml Poly-L-lisina Archivio in 49 ml tampone borato. </li><li> Preparare borato Buffer, pH 8.4 partendo da 395 ml di dH 2 O e quindi l&#39;aggiunta di tutti gli ingredienti (1,24 g di acido borico + 1,9 g di borace). Regolare il pH a 8,4 con 1 M NaOH. Regolare a 400 ml e filtrare con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li><li> Preparare la soluzione HBSS, pH 7,2 iniziando con 445 ml di dH 2 O e l&#39;aggiunta di tutti gli altri ingredienti (50 ml 10X HBSS archivio + 1,2 g HEPES). Regolare il pH a 7,2 con 1 N HCl, bring a 500 ml e filtrare con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li><li> Preparare mezzo di placcatura: DMEM / F12 con il 10% di siero fetale bovino. Filtro con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li><li> Preparare terreno di coltura completo: a 50 ml di mezzo Neurobasal, aggiungere i supplementi (500 microlitri Glutamax (100X) + 500 ml di glucosio + 1 ml di B-27 (50X) + 500 ml di soluzione di antibiotici contro funghi (100X) + 100 ml 7,5% Bicarbonato di sodio. filtro con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li></ol></li><li> Due giorni prima della cultura: <ol><li> Coat dodici 35 mm piatti con fondo di vetro con 2 ml di soluzione di lavoro Poli-L-lisina, e tenere sotto il cofano O / N. </li></ol></li><li> Un giorno prima della cultura: <ol><li> Vuoto agente di rivestimento dai piatti e risciacquare con DDH 2 O. Lasciare asciugare i piatti per un&#39;ora sotto il cofano. </li><li> Preparare mezzo di placcatura (DMEM / F12 con siero fetale bovino 10% (10% di soluzione totale). Pipettare 2 ml di mezzo inogni piatto, e incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO 2. Nota: È importante evitare piatti di plastica coltura durante la coltura. L&#39;utilizzo di piatti con fondo di vetro (per microscopi invertiti) o vetrini (per microscopi verticali) produce immagini chiare e nitide. Rispetto ad un piatto di plastica-basso, il piatto fondo di vetro consente di evitare riflessi indesiderati o abbagliamento durante la microscopia a fluorescenza. </li></ol></li></ol></li><li> Protocollo Colture cellulari: <ol><li> Messo in frigorifero HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm di Petri piatti, pinze, forbici, provette da 50 ml e 15 ml tubi sotto la luce UV a cappuccio. </li><li> Euthanize ratto in gravidanza con l&#39;inalazione letale di 5% sevoflurano sotto il cofano al di fuori della stanza della cultura. </li><li> Sterilizzare con il 70% EtOH, tenda la pelle del basso addome con pinze durante il taglio della coda fino a metà del addominale cavity.Open l&#39;utero con le forbici per esporre la placenta. </li><li> Rimuovere 8-10 feti E18. PlaCe 8-10 feti in capsule di Petri contenenti soluzione HBSS. </li><li> Tenere la parte posteriore della testa del feto con una pinza, quindi utilizzare le forbici per tagliare la testa dal corpo. Mettere in un altro capsula di Petri riempite con 5-7 ml di HBSS. Trasferimento piatto a cappuccio. </li><li> Riempire due ulteriori capsula di Petri 100 mm con HBSS freddo. </li><li> Peel parte del cranio, il cervello e scoop in una nuova capsula di Petri riempite con HBSS. </li><li> Utilizzare pinze curve taglienti, cervelletto e tronco cerebrale separata dal cervello, poi il trasferimento cervello a una nuova capsula di Petri con HBSS freddo in esso. </li><li> Utilizzare le pinzette per fissare, separare gli emisferi con una pinza curve. Rimuovere meningi; isolare corteccia frontale e pezzi di trasferimento in provette da 15 ml centrifuga segnati. </li><li> Riempire il tubo da 15 ml con il fresco 2 ml HBSS e aggiungere 20 microlitri tripsina EDTA (10x miscela concentrata con 0,5% tripsina e EDTA 5,3 mm.) Ad ogni provetta 15 ml. </li><li> Incubare 10-15 minuti a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente tubo ogni pochi minuti, non consentono di stabilirsi. </li><li> After 10-15 minuti, l&#39;uso pipetta di vetro per rimuovere vecchia HBSS e lavare due volte con HBSS nuova. </li><li> Immergere in inibitore della tripsina (1 mg / ml, 2 mg di inibitore della tripsina in 2 ml HBSS), mescolare bene e lasciate riposare 5 minuti. Lavare due volte con HBSS fresco. </li><li> Uso pipetta di vetro con bulbo di gomma, pezzi cerebrali Triturare 10-15 volte molto lentamente in modo da evitare bubbles.Triturate nuovamente utilizzando una pipetta calibrata e una punta sterile con una punta di diametro ridotto molto lentamente fino ad omogeneità. </li><li> Trasferimento dissociato cellule a densità desiderata di pre-preparati piatti della cultura rivestiti (50 cellule / mm2). Incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO2. </li><li> Dopo 24 ore, sostituire medio DMEM / F12 con il mezzo privo di siero Neurobasal completa crescita appena fatto. </li><li> Mantenere le cellule in ogni momento in un CO 2/95% incubatore umidificato aria ambiente 5% per almeno 12-14 giorni prima della sperimentazione. Supplemento cellule ogni 5-6 giorni con terreno fresco Neurobasal sostituzione circa il 50% del vecchio mezzo. </li></ol></li></ol> 2. fluorescenti etichettatura e Immunocitochimica Nota: L&#39;etichettatura immunofluorescenza di colture cellulari primarie corticali stata effettuata in vetro piatti di coltura cellulare fondo 35 mm con un volume di lavoro di 1 ml. <ol><li> Lavare il piatto fondo di vetro due volte con tampone fosfato salina pH 7.4 (PBS). </li><li> Fissare cellule con 4% paraformaldeide per 15 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS e permeabilize con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min. </li><li> Trattare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente con una macchia specifica F-actina, AlexaFluor 488 falloidina (1:40, 25 ml di falloidina in 1 ml di PBS). </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS e bloccare con il 10% di siero normale di capra a temperatura ambiente per 1-2 ore. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo pollo policlonale anti-MAP2 (1: 2.500) in PBS con il 2% di siero normale di capra e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare in PBS due volte. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario (Alexa REd 594 coniugato capra anti-IgG di pollo (1: 500) con il 2% di siero normale di capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare con PBS e aggiungere 10 ml / piatto di colorante Hoescht. </li><li> Incubare 3 minuti a temperatura ambiente e lavare con PBS due volte. Nota: Le cellule marcate ora pronto per il passaggio 3 (F-actina conteggio puncta). </li><li> Conserva campione di cellule con 100 ml di antifade reattivo come agente coprioggetto e mantenerlo a 4 ° C al buio per la conservazione a lungo termine. Nota: falloidina è relativamente stabile in PBS a 4 ° C al buio fino a 1 settimana e la fluorescenza può essere conservato con antifade reagenti copertura dei vetrini. Tuttavia, per ottenere immagini ottimali da 1-3 giorni dopo la colorazione da falloidina può iniziare a diffondere con stoccaggio prolungato. </li></ol> 3. F-actina Puncta conteggio <ol><li> Accendere microscopio a fluorescenza e passare a 20 × obiettivo. Aprire il software microscopio, e impostare il programma a 1280 × 960 pixel di dimensioni dell&#39;immagine, e 0,1risoluzione dell&#39;immagine / pixel 7 micron a 1 ×. </li><li> Acquisire le immagini di co-marcato F-actina / neuroni MAP2 in verde (495 nm) / rosso (613 nm) canali fluorescenti. </li><li> Scegli 5 Green (F-actina) / Red (MAP2) immunolabeled / blu (Hoescht) immagini fluorescenti di singolo neurone con pergole dendritiche chiaramente definiti. </li><li> Identificare i F-actina strutture ricche di secondo ordine segmento dendritiche (intervallo di lunghezza 25-75 micron), con continui immunofluorescenza MAP2. </li><li> Ruotare la regione selezionata di immagini a un livello orizzontale. Copia e incolla come nuova immagine. </li><li> Sottrarre il fondo delle immagini, utilizzando un aggiustamenti coerenti per ogni piatto. </li><li> Contare il brillante puncta F-actina verde e tracciare la lunghezza del segmento dendritiche selezionato manualmente da osservatori indipendenti addestrati. Esportare i dati in un file foglio di calcolo. </li><li> Calcolare la densità dividendo totale F-actina puncta marcato (N) per la lunghezza (L) della MAP2 etichettato dendriti. i dati espressi come numero di F-acpuncta latta per 10 micron di dendriti Nota: Puncta (dimensioni ≤1.5 micron) della fluorescenza F-actina con una intensità di picco di almeno 50% rispetto all&#39;intensità media della colorazione nel pozzo dendritica sono stati inclusi in ciascun segmento dendritica selezionato. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

In questo protocollo, si descrive la coltura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare dendriti dei singoli neuroni. Avanti, usiamo falloidina e MAP2 colorazione per rilevare i cambiamenti dendritiche. Poi, abbiamo utilizzato un software specializzato per quantificare i cambiamenti in puncta F-actina. Per determinare le variazioni di puncta F-actina tutta la rete neuronale di un singolo neurone deve essere chiaramente vi...

L&#39;obiettivo primario di questo studio è quello di sviluppare un metodo affidabile di misura (stima) di integrità sinaptica della rete dendritica neuronale. Qui si descrive la quantificazione di puncta F-actina in primari di ratto neuroni in coltura utilizzando una combinazione di falloidina colorazione e rilevamento immunocitochimica (ICC) di dendriti con successiva analisi utilizzando software specializzati (NIS-Elements). Phallotoxins etichettati hanno un&#39;affinità simile per grandi e piccoli filamenti (F-actina), ma non si legano al monomero globulare actina (G-actina), a differenza di alcuni anticorpi actina 1. Legame non specifico di falloidina è trascurabile, fornendo in tal modo sfondo minima durante l&#39;imaging cellulare. Falloidina è molto più piccolo di anticorpi che viene in genere utilizzato per etichettare proteine ​​cellulari per microscopia a fluorescenza, che consente molto più intenso etichettatura di F-actina by falloidina. Così, immagini dettagliate di localizzazione F-actina nei neuroni possono essereottenuto attraverso l&#39;uso di etichetta falloidina. Falloidina (F-actina) colorazione dei dendriti neuronali genera discreti &quot;punti caldi&quot; o &quot;puncta&quot; luminosa, che rappresentano una varietà di strutture dendritiche, tra cui spine mature, le sinapsi non spinosi 2 e spine immature. Spine immature includono filopodi sottili e alcune forme di patch di morfologia, e possono rappresentare l&#39;avvio di spinogenesis 3. Spine immature e patch non spinosi mancano PSD95 4. Cambiamenti nella produzione di piombo F-actina alle successive variazioni non solo spine ma anche strutture dendritiche aggiuntivi, rendendo così falloidina uno strumento importante per indagare l&#39;integrità synaptodendritic 5-7. In generale, il numero di falloidina-positivi (F-actina) puncta riflettono un equilibrio tra le sinapsi attive (eccitatori e inibitori), le dinamiche di actina e la stabilità sinapsi 8. Anche se è importante studiare specifica tipi di sinapsi (cioè, spine eccitatorie), quando la destinazione di un trattamento non è nota, è necessario stimare prima l&#39;integrità generale di una varietà di strutture dendritiche. Dal momento che F-actina è una componente importante di spine dendritiche e altre strutture, tra cui sinapsi inibitorie, un numero alterato di puncta F-actina può indicare una synaptopathy. Questo synaptopathy può quindi essere studiata ulteriormente per le modifiche più specifiche. Il nostro metodo di quantificazione per il rilevamento di più sinaptici tipi / strutture produce una stima complessiva del dendritiche alterazioni sinaptiche (aumenti e le diminuzioni) a seguito di vari trattamenti sperimentali.

<table><tbody><tr><td>Piatti con fondo in vetro da 35 mm n. 1,5 vetro di copertura</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borace</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasale medio</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 integratore</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico soluzione</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forcipe</td><td>World Strumenti di precisione</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Falloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo normale</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Pollo policlonale anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-capra coniugata anti-pollo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Colorazione per cellule vive Reagente ReadyProbes Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Pacchetto software NIS-Elements</td><td>Nikon Instruments Nikon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE2000-E microscopio fluorescente invertito controllato da computer&nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Filtro a membrana in nylon Nalgene</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

la quantificazione di filamentosa actina (f-actina) puncta nel ratto neuroni corticali

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentosa proteine ​​actina (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesis, plasticità sinaptica, e la stabilità sinaptica. Cambiamenti nelle strutture ricche dendritiche F-actina suggeriscono alterazioni nella integrità sinaptica e la connettività. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di ratto primario neuroni corticali, Colorazione falloidina per puncta F-actina, e successive tecniche di quantificazione. Innanzitutto, la corteccia frontale di embrioni di ratto E18 sono dissociato in coltura cellulare a bassa densità, allora i neuroni coltivati ​​in vitro per almeno 12-14 giorni. Dopo il trattamento sperimentale, i neuroni corticali sono macchiati con AlexaFluor 488 falloidina (per etichettare il puncta F-actina dendritiche) e map2 (MAP2, per convalidare le cellule neuronali e l&#39;integrità dendritiche). Infine, il software specializzato è utilizzato per analizzare e quantificare dendriti neuronali selezionati in modo casuale. F-actina strutture ricche sono identificati sul secondo ordine rami dendritiche (range 25-75 lunghezza &amp;# 181; m) con continui immunofluorescenza MAP2. Il protocollo presentato qui sarà un metodo utile per studiare i cambiamenti nelle strutture sinapsi dendritiche successivi trattamenti sperimentali.

Nelle attuali metodi, in primo luogo abbiamo la cultura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare i dendriti dei singoli neuroni. Nella figura 1, il contrasto di interferenza differenziale (DIC) immagini mostrano le variazioni morfologiche nello sviluppo fetale di ratto neuroni corticali nei giorni 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Si noti che la lunghezza e il numero di dendriti aumentano con...

L'actina filamentosa (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesi, nella plasticità sinaptica e nella stabilità sinaptica. La quantificazione dei F-actina puncta è quindi uno strumento utile per studiare l'integrità delle strutture sinaptiche. Questo protocollo descrive le procedure di quantificazione dei punti F-actina marcati con falloidina in colture neuronali corticali primarie a bassa densità.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

L'obiettivo generale di questa quantificazione delle punte di actina filamentosa (F-actina) nei neuroni in coltura è presentare un metodo utile per lo studio dell'integrità e della funzionalità cognitiva delle strutture sinaptiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze riguardo alla spinogenesi, alla plasticità sinaptica e alla stabilità sinaptica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un protocollo dettagliato per la coltura primaria di neuroni, seguito dall'identificazione e dalla quantificazione delle punte di F-actina.Quando l'obiettivo da raggiungere è sconosciuto, è necessario stimare l'integrità generale delle strutture retiniche fondamentali. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo mentre studiavamo i danni neuronali indotti da sostanze d'abuso come la cocaina e da proteine tossiche dell'HIV come tat e JP 120. Due giorni prima dell'allestimento della coltura, ricoprire 12 piatti da 35 millimetri con fondo in vetro con due millilitri di soluzione lavorativa di poli-L-lisina. Conservare i piatti nel flusso laminare durante la notte per mantenerne la sterilità.Il giorno successivo, scartare l'agente di rivestimento e risciacquare le piastre con acqua doppio-distillata. Lasciare asciugare le piastre per un'ora sotto cappa. Successivamente, trasferire due millilitri di mezzo di semina in ciascuna piastra.E incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica. Nel giorno della coltura, posizionare il cervello raccolto in una piastra di Petri contenente HBSS freddo. Quindi, tenendo saldamente il cervello con pinzette, utilizzare le pinze curve per separare gli emisferi e rimuovere le meningi.Isoletto le cortecce frontali e trasferisco i pezzi in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri. Aggiungo due millilitri di HBSS fresco e 20 microlitri di tripsina EDTA al tubo, quindi incubo i tessuti neurali per 10-15 minuti a temperatura ambiente, agitando delicatamente ogni pochi minuti.Alla fine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare tutto il vecchio HBSS. Sciacquare quindi le cortici due volte con HBSS fresco. Dopo il secondo lavaggio, immergere il tessuto nell'inibitore della tripsina.Mescolare bene e lasciare riposare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare i tessuti due volte con HBSS fresco. Ora utilizzare una pipetta di vetro con una bolla di gomma per triturare molto lentamente i pezzi di cervello da 10 a 15 volte.Quindi, utilizzando una pipetta calibrata dotata di un'ugello sterile con diametro ridotto, triturare molto lentamente la sospensione tissutale una seconda volta. Quando la soluzione risulta omogenea, seminare le cellule alla densità appropriata nelle piastre per colture precedentemente rivestite, per un'incubazione notturna nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di semina con un mezzo basale privo di siero, completo e appena preparato.E rimettere le cellule nell'incubatrice per colture cellulari per almeno 12-14 giorni. L'allestimento a bassa densità è importante per visualizzare i singoli neuroni. Inoltre, il mezzo basale per neuroni è fondamentale per ridurre al minimo la perforazione degli astrociti all'interno delle colture cellulari.Per etichettare le cellule per l'immunocitochimica, lavare prima la piastra per colture cellulari con fondo in vetro due volte con PBS. Quindi fissare le cellule con paraformaldeide al quattro percento per 15 minuti a temperatura ambiente. Seguire con due lavaggi con PBS.Successivamente, permeabilizzare le cellule con il 0,1 percento di Triton X-100 in PBS per cinque minuti e marcarle con un colorante specifico per l'F-actina a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, risciacquare le cellule due volte con PBS e bloccare qualsiasi marcatura superficiale non specifica utilizzando siero di capra normale al 10%. Al termine dell'incubazione, marcare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius con un anticorpo policlonale di origine avicola anti-map2.Il mattino seguente, lavare le cellule due volte con PBS ed etichettarle con l'anticorpo secondario appropriato. Dopo due ore a temperatura ambiente, risciacquare nuovamente le cellule con PBS ed etichettarle con 10 microlitri di huxs per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le cellule altre due volte con PBS e conservarle con 100 microlitri di reagente anti-sfaldamento.Entro tre giorni dalla colorazione, accendere il microscopio a fluorescenza e selezionare l'obiettivo 20 X. Successivamente, nel software del microscopio, impostare la dimensione dell'immagine in pixel a 1600 per 1200 e la risoluzione dell'immagine di 0,17 micron per pixel al livello di ingrandimento 1 X. Trasferire la piastra con le cellule sullo stage del microscopio.E acquisire immagini delle mappe di neuroni F-actina e MAP2 marcati in modo congiunto nei canali fluorescenti verde e rosso. Una volta ottenute tutte le immagini, scegliere cinque immagini di neuroni singoli nei canali verde, rosso e blu con arborizzazioni dendritiche ben definite. E utilizzare l'immunofluorescenza continua per MAP2 per identificare le strutture ricche di F-actina nei dendriti di secondo ordine.Ruotare orizzontalmente la regione selezionata di immagini. Copiare e incollare la regione come nuova immagine. Successivamente, sottrarre la fluorescenza di fondo dell'immagine e utilizzare il software per contare il numero di puntini brillanti verdi di F-actina.Utilizzare osservatori indipendenti addestrati per misurare la lunghezza dei segmenti dendritici selezionati. Successivamente, esportare i numeri delle puncta e i dati sulla lunghezza dei segmenti dendritici in un file di foglio di calcolo. Assicurarsi che gli osservatori includano le puncta di F-actina con un'intensità di fluorescenza rosa pari almeno al 50% superiore all'intensità media della colorazione nel tratto dendritico in ciascun segmento selezionato.Infine, calcolare la densità secondo la formula, esprimendo i dati come numero di punti di F-actina per dieci micron di dendrite. Qui, le immagini a contrasto di interferenza differenziale mostrano i cambiamenti morfologici osservati nei neuroni corticali fetali di ratto in via di sviluppo ai giorni 4-27 in vitro. Si noti l'aumento della lunghezza e del numero dei dendriti man mano che i neuroni primari di ratto in coltura maturano.Dato che l'etichettatura della F-actina con falloidina è molto rapida, è possibile stimare visivamente l'integrità della rete sinapto-dendritica prima di procedere con l'etichettatura immunocitochimica mediante anticorpi. Map2 colora i dendriti integri, confermando che le punteggiature di F-actina si trovano sui dendriti neuronali e non sono localizzate in altre cellule, come ad esempio gli astrociti. In immagini ad alta risoluzione, è possibile osservare strutture ricche di F-actina contenenti filopodi phi, protrusioni spineali e chiazze di F-actina.In questo esperimento volto a valutare il danno sinapto-dendritico indotto da HIV 1 tat, la colorazione per Map2 ha rivelato un minor numero di rami dendritici e una riduzione dell'F-actina nei neuroni corticali di ratto dopo il trattamento con HIV 1 tat. Effettivamente, il numero di punti di F-actina aumenta o diminuisce in risposta al trattamento sperimentale. Ad esempio, in questo esperimento, quando i neuroni in coltura sono stati trattati con l'antagonista non competitivo del recettore NMDA, memantina, i punti positivi per F-actina hanno mostrato un significativo aumento della densità.Al contrario, il trattamento con una combinazione di metanfetamina e HIV1 tat ha determinato una significativa perdita dei punti di F-actina. Dopo aver acquisito immagini ad alta risoluzione dei neuroni Map2 con F-actina marcati, ricordare di far sì che due osservatori esperti selezionino segmenti delle dendriti di secondo ordine per l'analisi delle densità dei punti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca neuroscientifica.Non solo per il monitoraggio delle sinaptopatie acute, ma anche per lo studio della ripresa sinaptica e dei processi sperimentali di ripristino neuronale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare un metodo affidabile per misurare l'integrità sinaptica della rete dendritica neuronale.

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Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.

L&#39;etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

Questo video mostra la procedura per colorare in modo fluorescente i neuroni corticali di ratto per la microscopia. Si rivolge alla F-actina e alle proteine dendritiche per analizzare l'integrità strutturale e calcolare la densità della F-actina, che è fondamentale per studiare la funzione e la salute neuronale.

Quantificazione dell'actina puntina filamentosa nei neuroni corticali di ratto

Presentiamo una soluzione software per il monitoraggio semi-automatico della concentrazione proteica relativa lungo la lunghezza delle protuberanze cellulari dinamiche.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

DetectSyn è un saggio fluorescente rapido e imparziale che misura i cambiamenti nel numero relativo di sinapsi (impegno pre e postsinaptico) tra trattamenti o stati patologici. Questa tecnica utilizza una tecnica di legatura di prossimità che può essere utilizzata sia nei neuroni in coltura che nei tessuti fissi.

DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

Il presente protocollo descrive un metodo per visualizzare e misurare gli anelli di actina e altri componenti dello scheletro periodico di membrana del segmento iniziale dell'assone utilizzando neuroni ippocampali di ratto in coltura e microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM).

Misurazione delle proprietà dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone mediante microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM)

Impara a quantificare i puncta di F-actina nei neuroni corticali di ratto per studiare l'integrità sinaptica e la plasticità. Questo metodo combina coltura neuronale primaria, immunocitochimica e analisi di imaging.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

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