In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

L'obiettivo generale dell'imaging bioluminescente è quello di visualizzare in vivo il transitorio funzionale del calcio, un proxy per l'attività, per periodi più lunghi e nelle strutture cerebrali profonde. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come ad esempio l'aspetto dell'attività basale del cervello del moscerino durante il sonno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede l'eccitazione con il laser.

Ciò consente di visualizzare il transitorio del calcio più in profondità nel tessuto e per un periodo di tempo più lungo senza il fotosbiancamento e la tossicità, rispetto all'imaging classico del calcio. Questo metodo può fornire informazioni sull'attività cerebrale basale nella drosofila e può essere utilizzato anche con altri organismi modello, come il topo. Per iniziare, preparare la linea di interesse di drosophila melanogaster e le soluzioni sperimentali, come descritto nel protocollo di testo allegato.

Quindi, anestetizzare con il ghiaccio una singola drosofila trasferendola in una fiala di vetro su ghiaccio per due minuti. Quindi, sposta la mosca in una capsula di Petri refrigerata e usa un paio di pinze per posizionare delicatamente la mosca all'interno di una punta per pipetta da 1000 microlitri, tagliata in modo che la punta sia ad un angolo di circa 35 gradi. Usando un pennello, spingi e allinea delicatamente ogni mosca in modo che la testa sia completamente oltre il bordo della punta e la regione dorsale sia parzialmente esposta.

Quindi, applicare la colla dentale preparata dalla testa al bordo della punta della pipetta. Prestare particolare attenzione per evitare la sommità della testa. L'incollaggio della testa è fondamentale perché fissarla nella posizione corretta è essenziale per il successo della dissezione e dell'imaging.

Inoltre, un incollaggio scadente porterà alla fuoriuscita della soluzione del ringer e alla morte del campione prima dell'imaging. Quindi, posizionare la punta della pipetta, con la patta attaccata, attraverso il foro nella camera di registrazione e premere delicatamente per fissarla in posizione. Quindi utilizzare una colla siliconica preparata per fissare il lato piatto della camera nel punto in cui incontra la punta della pipetta al fine di evitare perdite.

Applicare un pezzo di rubinetto sul canale di profusione, il bordo corto e estendendolo fino al retro della camera. Quindi, posiziona la camera con la mosca sotto il microscopio e accendi la lampada fluorescente. Quindi, pipettare un millilitro di soluzione di ringer nella camera.

Usando un bisturi sottile, praticare incisioni parallele dalla parte posteriore della testa della mosca alla regione antenale su entrambi i lati. Quindi, taglia lungo il bordo dell'occhio e fai un'incisione perpendicolare sopra l'antenna che collega le incisioni precedenti. Fai un'incisione finale nella parte posteriore della testa, quindi usa un paio di pinze sottili e affilate per rimuovere la cuticola.

Afferrare delicatamente e rimuovere il tessuto respiratorio esposto fino a quando il cervello e il corpo del fungo fluorescente non sono chiaramente visualizzati. Successivamente, usa una pinza ultra affilata per afferrare e pizzicare con cura il tessuto dell'epitelio neurale che copre il cervello per rimuoverlo e consentire la permeazione della celenterazina. Utilizzando una pipetta, lavare il fazzoletto due volte con un millilitro di soluzione ringer per rimuovere eventuali detriti rimasti dalla dissezione, quindi posizionare il campione in una scatola scura.

Quindi, pipettare nella camera un millilitro di soluzione di ringer, contenente cinque micromolari di benzil-celeterazina. Chiudere la scatola e incubare il campione a temperatura ambiente per un minimo di due ore. Inizia accendendo il microscopio nel computer.

Inoltre, raffreddare la fotocamera a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Successivamente, imposta il sistema di drenaggio e regola i controlli ambientali a 20 gradi Celsius. Quindi, apri l'imager fotonico, crea una nuova cartella e assegna un nome alla prima registrazione.

Quindi, impostare il sistema di profusione aggiungendo la soluzione di cloruro di potassio, nicotina e ringer ai rispettivi serbatoi. Regolare il flusso in modo che ogni soluzione si scarichi a due millilitri al minuto. Quindi, posizionare il campione sulla montatura sotto il microscopio e regolare l'ingrandimento su 5X.

Quindi, inserire il tubo di profusione nel canale attraverso la puntura. Impostare il microscopio in modalità fluorescente, quindi centrare e mettere a fuoco i corpi dei funghi. Una volta che i corpi dei funghi sono a fuoco, cambia l'ingrandimento a 20X.

Centra nuovamente l'immagine e regola la messa a fuoco. Quindi, posizionare l'apparato di drenaggio sopra la piscina di drenaggio e regolare l'altezza dello shunt di drenaggio, in modo che la punta si trovi appena sopra la piscina di drenaggio. Quindi, sciacquare il campione con una soluzione ringer per 30 secondi per verificare l'adeguato drenaggio.

Infine, abbassare lo schermo per sigillare l'apparecchio da qualsiasi luce esterna. Utilizzando il sistema automatizzato nel programma imager a fotoni, effettuare regolazioni fini della messa a fuoco e acquisire un'immagine fluorescente di riferimento dei corpi dei funghi. Regola la velocità del fotone alla velocità di registrazione desiderata, che dovrebbe essere compresa tra un'immagine ogni 50 millisecondi fino a una ogni secondo o più.

Quindi, seleziona la modalità fotone e apri l'otturatore. Quindi, inserisci il genotipo, il sesso, l'età e il numero del campione nelle voci del registro. Regola la posizione delle caselle della regione di interesse sopra il calice, i corpi cellulari e i lobi mediali, facendo clic sulle caselle e trascinandole in posizione tenendo premuto il controllo.

Ora, registra i valori di base per circa 5-10 minuti. Quindi, accendi l'interruttore per iniziare il flusso di nicotina. Allo stesso tempo, premi invio e aggiungi una nota per indicare che il flusso di nicotina è iniziato.

Dopo un minuto, interrompere il flusso e inserire un'altra nota nel registro che indica che il flusso è stato interrotto. Quindi, lavare il campione con una soluzione di suoneria per cinque minuti. Mentre il campione si riprende, spegnere il lavaggio, impostare il timer per altri cinque minuti e prepararsi ad avviare il flusso di cloruro di potassio.

Quando si è pronti per iniziare, avviare il flusso di cloruro di potassio e inserire 100 millimolari di cloruro di potassio nel registro del campione. Dopo un minuto, interrompere il flusso e inserire il cloruro di potassio spento nel registro del campione. Quindi, lavare il campione con la soluzione ringer per un minuto e passare il microscopio alla modalità fluorescente.

Scattare un'ultima immagine fluorescente, quindi spegnere la soluzione della suoneria e rimuovere il campione. Nel programma di analisi, apri il primo file, seleziona la scheda "controllo del display" e fai clic su ROI. Quindi, tieni premuto il controllo e seleziona una regione di interesse.

Quindi, regola le dimensioni, l'orientamento e la forma delle ROI per comprendere il calice illuminato GFP e i corpi cellulari e i lobi mediali. Una volta aggiunte tutte le regioni di interesse, seleziona la scheda "film" per riprodurre il video fotonico. Regolare la seconda larghezza e i secondi passaggi come desiderato.

Quindi regola nuovamente il posizionamento del ROI se necessario, in modo che rimanga all'interno delle regioni attive del video. Seleziona alcuni screenshot rappresentativi della fluorescenza GFP, della risposta alla nicotina e della risposta al cloruro di potassio. Quindi ritaglia gli screenshot e incolla le immagini rappresentative in una diapositiva di presentazione per un'analisi e un confronto tardivi.

Regola sia la seconda larghezza che il secondo passaggio alla velocità di registrazione in secondi. Inoltre, selezionare la lunghezza dell'analisi spostando gli indicatori grigi nel pannello superiore nell'area tra parentesi, prima dell'inizio dello stimolo e subito dopo la fine della risposta. Quindi, seleziona sospendi visualizzazioni"durante la riproduzione, quindi premi il pulsante di riavvolgimento per ripristinare la riproduzione del video all'inizio, seguito dal pulsante di riproduzione.

Quindi, seleziona il grafico del tasso di conteggio delle schede"per regolare le unità e regolare anche il colore delle regioni di interesse, nonché i colori delle linee come desiderato. Al termine dell'analisi, selezionare Esporta dati sulla frequenza di conteggio. Quindi, seleziona le registrazioni combinate del calice e dei corpi cellulari, nonché quelle delle regioni del lobo mediale su ciascun lato e incolla quelle immagini in un vetrino con le immagini di risposta.

Uno dei modi più semplici per stimolare i corpi dei funghi è attraverso l'attivazione dei recettori nicotinici ionotropici dell'acetilcolina. La risposta tipica alla nicotina 25 micromolari, mostrata qui, inizia con la rapida attivazione sia del calice che dei corpi cellulari e dei lobi mediali, e utilizza il costrutto GFP-equorina fusa, che si lega al calcio ed emette luce. Generalmente, la risposta nel calice e nei corpi cellulari dura più a lungo e mostra una maggiore risposta bioluminescente rispetto ai lobi, come mostrato nei pannelli sequenziali della risposta.

Un campione di registrazione della risposta bioluminescente all'attivazione nicotinica nel tempo è descritto da questo grafico, dove il numero di fotoni nella regione di interesse contenente il calice e i corpi cellulari è rappresentato graficamente in nero e il numero di fotoni all'interno della regione del lobo mediale è mostrato in rosso. Da questo grafico è possibile determinare la lunghezza della risposta, il valore del fotone di picco durante la risposta e l'area totale sotto ciascuna curva. Una volta padroneggiata, la fase di preparazione dovrebbe richiedere solo due ore prima dell'incubazione, a seconda del numero di mosche.

Inoltre, ogni registrazione può essere completata in soli venti minuti, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di invecchiare correttamente e conservare i volatili da mosca per garantire la riproducibilità tra i campioni. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori test comportamentali per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quale influenza ha l'attività della struttura sul comportamento specifico.

Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare l'attività neurale a lungo termine nel cervello della drosofila. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni per l'imaging bioluminescente nel cervello del moscerino. Non dimenticare che la nicotina può essere pericolosa per la salute.

Precauzioni come i guanti devono essere prese quando si preparano soluzioni o si pulisce da questa procedura.