In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare i film proteici adsorbiti in soluzioni acquose, utilizzando il sistema per l'analisi all'interfaccia del vuoto liquido e la spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle biomolecole e sulla biointerfaccia. Ad esempio, caratterizzazione di proteine adsorbite su una superficie solida.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che le biomolecole possono essere avviate in situ nell'ambiente liquido e in combinazione con la mappatura molecolare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle biomolecole all'interfaccia solido-liquido, può essere applicato anche ad altri sistemi, tra cui l'indagine su singole cellule tumorali, le interazioni farmacologiche e l'attaccamento di biofilm. In una siringa da cinque millilitri, aspirare due millilitri di una soluzione di etanolo al 70%.

Collegare la siringa all'estremità di ingresso del dispositivo SALVI e iniettare lentamente un millilitro di liquido nel corso di 10 minuti. Al termine dell'iniezione, rimuovere la siringa e collegare l'ingresso e l'uscita del SALVI utilizzando un raccordo polietere-etere-chetone. Mantenere il microcanale SALVI riempito con la soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per quattro ore.

Quindi, riempire una seconda siringa con acqua deionizzata sterile. Collegarlo all'ingresso del SALVI e iniettare lentamente l'acqua deionizzata nel dispositivo nel corso di 10 minuti. Rimuovere la siringa e ricollegare l'ingresso e l'uscita del dispositivo.

Per immobilizzare un film proteico, iniziare aspirando due millilitri di soluzione di fibronectina in una siringa. Collegare la siringa all'ingresso del dispositivo SALVI e iniettare lentamente un millilitro di liquido nel corso di 10 minuti. Quindi, rimuovere la siringa e ricollegare nuovamente l'ingresso e l'uscita.

Incubare il preparato in un piatto di coltura pulito a temperatura ambiente per 12 ore. Dopo l'incubazione, iniettare lentamente un millilitro di acqua deionizzata sterile nel corso di 10 minuti, quindi ricollegare l'ingresso all'uscita. Per iniziare, appoggiare il tavolino ToF-SIMS su una superficie piana e pulita.

Posizionare il dispositivo SALVI sul tavolino con il wafer di silicio e la membrana in nitruro di silicio rivolti verso l'alto. Fissare il dispositivo SALVI al tavolino utilizzando quattro pezzi di bloccaggio in metallo e avvitare i pezzi di metallo che fissano l'angolo del dispositivo nella piastra metallica con quattro viti. Quindi, arrotolare delicatamente il tubo PFTE collegato al canale microfluidico.

Usa quattro pezzi di metallo e quattro viti per tenere ferma la parte rigida. Assicurarsi che il dispositivo sia posizionato nello spazio aperto del tavolino, in modo che non interferisca con il fascio di ioni primari durante l'analisi. Quindi, montare la tazza di Faraday sul tavolino utilizzando una vite.

Quindi, aprire lo sportello del blocco del carico ToF-SIMS e posizionare il tavolino orizzontalmente sulla piattaforma di carico prima di chiudere lo sportello. Accendere la pompa del vuoto e lasciare che la camera di blocco del carico scenda a circa 10 fino al meno sesto millibar. Quindi, spostare il dispositivo SALVI nella camera principale dopo circa 30 minuti, una volta stabilizzato il vuoto.

Regolare il fascio di ioni primari e l'analizzatore del ToF-SIMS per acquisire una risoluzione spaziale di circa 400 nanometri seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Quindi, trova il canale microfluidico usando il microscopio ottico. Utilizzare il centro dell'immagine ottica come riferimento e allinearlo in modo che sia coerente con il centro dell'immagine ionica secondaria.

La dimostrazione visiva di questo passaggio è fondamentale, poiché è difficile da imparare, perché il campione è più spesso dei normali campioni solidi ed è difficile regolare le impostazioni per trovare la migliore messa a fuoco del canale. Prima di ogni misurazione, utilizzare un fascio di ossigeno da un kiloelettronvolt per eseguire la scansione sulla finestra di nitruro di silicio per circa 15 secondi per rimuovere la contaminazione superficiale. Inoltre, utilizzare una pistola a inondazione elettronica per compensare la carica superficiale durante tutte le misurazioni.

Quindi, selezionare la modalità positiva o negativa prima di avviare l'acquisizione dei dati. Utilizzare il bismuto tre plus da 25 kiloelettronvolt come fascio ionico primario in tutte le misurazioni. Per la profilazione della profondità, eseguire la scansione del fascio di ioni primari su un'area rotonda con un diametro di circa due micrometri con una risoluzione di 32 pixel per 32 pixel.

Per ridurre al minimo il tempo necessario per perforare la membrana in nitruro di silicio, utilizzare un fascio di ioni primari a larghezza di impulso lungo. Dopo il punch-through della membrana in nitruro di silicio, mantenere la stessa corrente per circa 200 secondi per ottenere dati sufficienti per le ricostruzioni bidimensionali delle immagini. Per la raccolta dei dati, ridurre l'ampiezza dell'impulso a 80 nanosecondi per acquisire spettri con una migliore risoluzione di massa.

Continuare l'acquisizione per altri 200 secondi circa. Utilizzando l'interfaccia microfluidica SALVI, il fascio di ioni primari può bombardare direttamente il film di fibronectina idrata. Un certo numero di ammassi d'acqua e frammenti di amminoacidi sono indicati dai dati di spettrometria di massa ToF-SIMS.

Ciò fornisce una prova diretta della proprietà delle molecole d'acqua che circondano e all'interno delle molecole proteiche idratate. Qui si possono vedere le serie temporali del profilo di profondità del film di fibronectina idrata e dell'acqua deionizzata. Le intensità dei secondi ioni selezionati sono trascurabili prima che la membrana in nitruro di silicio venga perforata.

Una volta che la membrana in nitruro di silicio viene perforata, le intensità degli ioni secondari aumentano in modo significativo. Il processo a larghezza di impulso corto viene utilizzato per ottenere dati con una migliore risoluzione di massa per le ricostruzioni di immagini e spettri. Le immagini 2D del film di fibronectina idrata e dell'acqua deionizzata rappresentano i conteggi degli ioni secondari selezionati dal campione.

Più luminosa è l'immagine, maggiore è il numero di ioni secondari. Queste immagini intuitive forniscono un chiaro confronto degli ioni secondari selezionati tra diversi campioni, utile nell'analisi dei dati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che un microreattore deve essere privo di perdite prima di essere installato nella camera a vuoto.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia e delle biointerfacce per esplorare l'adsorbimento delle proteine, l'attaccamento del biofilm, i monostrati assemblati in superficie e molti altri fenomeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare vari campioni liquidi utilizzando SALVI e il ToF-SIMS liquido.