Name: Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri nuovi parametri per caratterizzare l'allungamento embrionale nel nematode Caenorhabditis elegans. Questo metodo consente di identificare geni che regolano le fasi iniziali e tardive dello sviluppo.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada e della Canada Foundation for Innovation. Grazie al dottor Paul Mains (Università di Calgary, Calgary, Canada) per il ceppo let-502 (sb118ts). Alcuni dei ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive nuove metriche per caratterizzare presto e fasi tardive di allungamento embrionale. Nella sezione 1, il punto critico è la potenziale presenza di batteri sul pad. Gli embrioni sono ermeticamente racchiusi tra il pad e il vetrino durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Sigillatura la slitta è necessario per evitare l&#39;essiccamento degli animali durante l&#39;acquisizione che dura più di due ore. A nostra conoscenza, nessuno dei sigillanti usati per montare ...

Per quasi 50 anni nematode Caenorhabditis elegans si è affermata come un potente modello per studiare le questioni importanti in fase di sviluppo, neurobiologia, l&#39;evoluzione, interazioni ospite-patogeno, ecc 1 Il punto di forza di questo modello per lo studio dello sviluppo risiede nella: suo ciclo di vita breve di 3 giorni; la facilità con cui questi animali possono essere geneticamente modificate; la trasparenza che permette l&#39;osservazione di spostamento e la morfologia cellulare in animali viventi e il suo sviluppo che è prevalentemente extra-uterina. Le fasi di sviluppo del nematode coinvolgono embriogenesi e quattro stadi larvali (da L1 a L4), seguito da adulta. Durante lo sviluppo embrionale, epidermica morfogenesi attirato considerevole attenzione per la sua capacità di consentire una migliore comprensione di come epiteliali cellule migrano come gruppo, come si riorganizzano loro giunzioni e modificare la loro morfologia individuale così come il posizionamento corrispondenti entro un epitelio funzionale.Epidermal morfogenesi è diviso in quattro fasi: intercalazione dorsale che consiste nella riorganizzazione delle cellule epidermiche dorsale, indicato come l&#39;ipoderma; recinzione ventrale, che consiste nella migrazione delle cellule ipodermici ventrale verso la linea mediana ventrale incassa quindi l&#39;embrione in un monostrato di cellule epiteliali; all&#39;inizio e alla fine l&#39;allungamento trasformare l&#39;embrione a forma di fagiolo in larve vermiforme. A seguito di morfogenesi, portello di embrione e L1 larve iniziano a nutrire utilizzando batteri disponibili nel loro ambiente immediato. allungamento embrionale è quindi una fase tardiva dello sviluppo embrionale. Consiste dell&#39;estensione dell&#39;embrione lungo il suo asse longitudinale ed una riduzione del suo diametro trasversale. Ciò comporta una modificazione drammatica della forma delle cellule ipodermici. Allungamento è diviso in una prima e una fase tardiva. La prima fase inizia nella fase virgola e si conclude quando i muscoli del corpo a parete iniziano a contrarre in fase di 1,75 volte in wILD-type (WT) embrioni - corrispondente a embrioni che sono 1,75 volte di lunghezza rispetto agli embrioni non allungata. Processi morfogenetici che si verificano in quella fase sono trainate principalmente dalla contrazione dei fasci filamentosi di actina (FB) situati al polo apicale delle cellule ipodermici che guidano il loro allungamento lungo l&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione 2. Contrazione di FB è il controllo da fosforilazione delle catene della miosina-luce da tre chinasi LET-502 / rock, MRCK-1 e PAK-1 5. La fase tardiva del allungamento, inizia quando i muscoli del corpo a parete diventano funzionali e iniziare amministrazione. Si tratta di segnalazione meccanotrasduzione dai muscoli del corpo a parete alle cellule dorsali e ventrali ipodermici e termina quando gli animali si schiudono 3. difetti di allungamento sono generalmente caratterizzati dalla percentuale di animali che muoiono come embrioni (letalità embrionale, Emb) e quelli arrestare il loro sviluppo come larve L1 (larvale fenotipo arresto; Lva) e di essere significativamente più breve di peso. L&#39;identificazione della fase di arresto dello sviluppo richiede osservazione al microscopio di embrioni morti e arrestato larve 3-6. E &#39;stato recentemente dimostrato che diversi geni, come ad esempio il / regolatore di Cdc42 Rac e effettori pix-1 e pak-1, il controllo dei processi morfogenetici sia in fase precoce e tardiva di allungamento 3,7. Abbiamo anche recentemente dimostrato che i processi morfogenetici differiscono lungo l&#39;asse antero-posteriore degli embrioni durante la prima allungamento 3 7. Questi risultati motivato lo sviluppo di nuove metriche rivolte specificamente alle fasi di allungamento presto o tardi e altri parametri che consentono la caratterizzazione della morfologia degli embrioni lungo il loro asse antero-posteriore durante l&#39;allungamento presto. Questi nuovi metodi consistono nel misurare la lunghezza di embrioni all&#39;inizio e alla fine dell&#39;allungamento precoce e la larghezza della loro luiannunci e le code. 7 due protocolli sono stati sviluppati anche per misurare la lunghezza delle larve appena schiusi, sincronizzati in fase L1 7. I gusci di uova di embrioni li proteggono trattamento ipoclorito alcalino mentre larve, adulti e batteri presenti nei mezzi di coltura vengono sciolti dal trattamento. Questo trattamento viene poi utilizzato per purificare embrioni da una popolazione non sincronizzato contenente una maggioranza degli adulti ben nutriti 8. restrizione alimentare viene utilizzato per sincronizzare le larve neonate. Misurare la lunghezza di queste larve viene quindi utilizzato per rilevare difetti di allungamento. Questa misurazione è preferibile rispetto alla misura di larve catturato su piastre di coltura a causa larve che si schiudono da non interamente embrioni allungati può recuperare a &quot;lunghezza normale&quot; durante l&#39;alimentazione ma mantenere la loro ridotta dimensione quando arrestato in assenza di cibo. Qui, presentiamo protocolli dettagliati che consentono la misurazione del length di allungamento embrioni così come la larghezza della loro testa e la coda utilizzando time-lapse DIC microscopia e analisi di immagine (protocollo 1). Forniamo anche protocolli dettagliati per misurare la lunghezza delle larve sincronizzata utilizzando l&#39;analisi dell&#39;immagine (protocollo 2) e citometria a flusso (protocollo 3).

<table><tbody><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Cloruro di calcio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione detergente&nbsp;</td><td>unione Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>in vetro Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Fisherbrand</td><td></td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Unione di particelle di controllo ad alta fluorescenza</td><td>Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato di potassio, bibasico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato di potassio, monobasico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (solfato di magnesio)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(fosfato di sodio, bibasico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (cloruro di sodio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Gomma da disegno 45&nbsp; ml</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>qualsiasi negozio d'arte/artigianato</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Bocchettone tampone guaina</td><td>Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>unione Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nuovi parametri per caratterizzare embrionale allungamento del nematode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

L'analisi delle vie di segnalazione che controllano l'alterazione dei processi morfogenici durante lo sviluppo embrionale richiede metriche robuste e sensibili. L'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans è uno stadio di sviluppo tardivo che consiste nell'allungamento dell'embrione lungo il suo asse longitudinale. Questa fase di sviluppo è controllata dalla comunicazione intercellulare tra le cellule ipodermiche e i muscoli sottostanti della parete corporea. Questi meccanismi di segnalazione controllano la morfologia delle cellule ipodermiche rimodellando il citoscheletro e le giunzioni cellula-cellula. La misurazione della letalità embrionale e dell'arresto dello sviluppo negli stadi larvali, nonché l'alterazione del citoscheletro e delle strutture di adesione cellula-cellula nelle cellule ipodermiche e muscolari, sono fenotipi classici che sono stati utilizzati per più di 25 anni per sezionare queste vie di segnalazione. Studi recenti hanno richiesto lo sviluppo di nuove metriche mirate specificamente all'allungamento precoce o tardivo e alla caratterizzazione dei difetti morfogenici lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione. Qui forniamo protocolli dettagliati che consentono di misurare con precisione la lunghezza e la larghezza degli embrioni allungati, nonché la lunghezza delle larve sincronizzate. Questi metodi costituiscono strumenti utili per identificare i geni che controllano l'allungamento, per valutare se questi geni controllano sia le fasi iniziali che quelle tardive di questa fase e sono necessari in modo uniforme lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Head-, fanalino posteriore e testa / coda rapporto larghezza sono metriche robuste. I protocolli descritti qui sono stati utilizzati con successo per caratterizzare la funzione di regolatori ed effettori di Rho GTPasi pix-1, pak-1 e let-502 durante l&#39;allungamento primi...

Qui dettagliamo i protocolli specificamente progettati per monitorare i difetti morfogenici che si verificano durante le fasi precoci e tardive dell'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans. In definitiva, questi protocolli sono progettati per identificare i geni che regolano queste fasi e per caratterizzare i loro requisiti differenziali lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

L'obiettivo generale di questo gruppo di esperimenti è identificare difetti dello sviluppo nel nematode Caenorhabditis elegans durante le fasi iniziali e tardive dell'allungamento embrionale. Questo metodo può rispondere a una domanda fondamentale nel campo della genetica dello sviluppo. Permette la caratterizzazione di geni che controllano una fase tardiva dello sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans denominata allungamento embrionale.Il principale vantaggio di questo gruppo di tecniche è che identificano geni che controllano sia le fasi iniziali che quelle tardive dell'allungamento, nonché quelli che regolano i processi morfogenetici nella parte anteriore o posteriore dell'embrione. Dimostrerò la procedura insieme a Olivier Rocheleau-Leclair, un ex studente del laboratorio. Questa procedura richiede lenti DIC, un prisma e un sistema di acquisizione video per la microscopia in time-lapse di Z stack.Posizionare innanzitutto il campione montato su vetrino per l'osservazione. I dettagli della preparazione sono riportati nel protocollo testuale. A partire da un ingrandimento basso, identificare gli embrioni nelle loro fasi pre-morfogenetiche.Quindi, aggiungere una goccia di olio e utilizzare un obiettivo più potente. Ora identificare i punti superiore e inferiore degli embrioni per registrare e impostare i parametri dello stack Z. Impostare l'acquisizione time-lapse per scattare immagini ogni due minuti.Assicurarsi che lo scatto della luce sia chiuso tra un'acquisizione e l'altra. Il tempo necessario per catturare l'evento iniziale di allungamento può variare da una a otto ore, a seconda dello stadio dell'embrione. A questo punto, eseguire il programma di acquisizione delle immagini e salvare i risultati.Successivamente, procedere con l'analisi utilizzando il software Fiji ImageJ. Una volta caricate le immagini, scegliere la modalità di visualizzazione Hyperstick. In seguito, regolare luminosità e contrasto applicando la modalità automatica (Auto Mode) dalle tabelle di ricerca (Lookup Tables).Successivamente, accedere a Analizza Imposta Misure e impostare i parametri. Per ogni embrione, impostare la barra della scala Z per focalizzare la faringe, che rappresenta un buon punto di riferimento per il punto centrale dell'embrione. Ora, regolare la barra della scala temporale all'inizio dell'allungamento precoce per un embrione specifico.Prendere nota di questo tempo. Quindi, calcolare la lunghezza dell'embrione utilizzando lo strumento Analizza Misura per tracciare una linea dalla punta della coda alla bocca lungo la linea mediana. Prendere nota di questa lunghezza.Successivamente, regolare il punto temporale alla fine dell'evento di allungamento precoce e ripetere la misurazione della lunghezza. Utilizzare questi valori per calcolare la durata dell'allungamento precoce e l'aumento di lunghezza durante l'allungamento precoce. La variazione della larghezza può essere misurata anche utilizzando lo strumento linea retta per tracciare una linea lungo la linea mediana della testa.Questa è una buona posizione per effettuare misurazioni riproducibili. Ripetere lo stesso procedimento sulla linea mediana della coda, quindi calcolare il rapporto tra testa e coda per ogni punto temporale e utilizzarlo per valutare le variazioni di larghezza. Per questo protocollo, è necessario preparare un citometro a flusso per il flusso di particelle di grandi dimensioni.Una macchina di questo tipo diventa essenzialmente un ordinatore di vermi. Prima di iniziare, accendere il blocco laser, il compressore, l'ordinatore di vermi e il software. Nel software, premere Avvia e verificare il controllo del laser all'argon.Selezionare la modalità Esegui e lasciare riscaldare il laser fino a raggiungere una potenza vicina a 10 milliwatt, quindi selezionare Fine. Lasciare stabilizzare la pressione per almeno 15 minuti. A questo punto, preparare il campione.Per prima cosa, caricare 10 microlitri di L1 di tipo selvatico sincronizzati in una capsula di Petri e stimare la frazione di uova morte al microscopio. Se la stima supera il 20%, non utilizzare il campione. Trasferire circa 700 microlitri di L1 sincronizzati in soluzione M9 in un tubo da 15 millilitri e aggiungere ioduro di propidio fino a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro.Lasciare agire il colorante per 30 minuti a temperatura ambiente. Ora, preparare il sistema. È fondamentale regolare la portata utilizzando i regolatori di flusso Sheath e Sample rispettivamente a 5,1 e 5,51.Quando le pressioni si stabilizzano, fare clic sulla casella Pressione OK. Successivamente, utilizzare il comando Acquisisci e agitare manualmente il tubo per rimuovere eventuali bolle dal canale tra il bicchiere del campione e la camera di analisi. La finestra di acquisizione mostrerà infine l'assenza di bolle.Questo è anche fondamentale per l'esperimento. Ora, impostare i parametri per le misurazioni di Fluorescents e TOF. Impostare le scale per TOF, EXT, Green, Yellow e Red su 256.Quindi, impostare il guadagno come indicato. Successivamente, impostare il controllo PMT a 700 per il verde e il giallo e a 900 per il rosso. A questo punto, calibrare lo sorter di vermi.Caricare 20 millilitri di particelle di controllo ad alta fluorescenza per usi generali in un bicchiere campione e inserirlo nell'apparecchio di separazione. Nel software, selezionare Esegui particelle di controllo dal menu Strumenti e fare clic su Acquisisci. Verificare che il coefficiente di variazione risultante sia maggiore o uguale a 11 e che la media sia pari a 21 più o meno sei.Se non è così, provare a pulire i tubuli facendo clic sul pulsante Pulisci o agitando il canale di flusso. Uscire ora dalla modalità Controllo Particelle deselezionando il comando in Strumenti. Una volta terminata la colorazione di 30 minuti dei vermi con ioduro di propidio, aggiungere 10 millilitri di M9 ai vermi colorati e mescolare.Incubare per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. Prelevare ora cinque millilitri della diluizione e aggiungerli a un campione contenente 15 millilitri di M9. Far passare questa diluizione attraverso il separatore di vermi. Premere il pulsante Acquire e osservare la portata.Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione di vermi per ottenere un flusso adeguato, compreso tra 15 e 25 oggetti al secondo. Una volta raggiunta la concentrazione appropriata degli oggetti, aggiungere le particelle di controllo al test per ottenere una concentrazione finale di circa 0,5-1x le particelle di controllo in soluzione. A questo punto, regolare il parametro di selezione (Gating Parameter) nel menu Gating in funzione del tempo di volo (TOF) rispetto al segnale verde.Quindi regolare i parametri di ordinamento su TOF rispetto a Rosso. Questo permetterà di separare le particelle di controllo dagli animali morti e da quelli vivi. Ora, eseguire l'esperimento cliccando su Acquisisci.Analizzare circa 10.000 oggetti, corrispondenti a circa 8.000 animali. Quindi interrompere l'esperimento e fare clic su Salva per memorizzare i dati come file di testo da analizzare. Per stabilire l'affidabilità della misurazione della larghezza della testa, la misurazione è stata eseguita in modo indipendente cinque volte su 12 embrioni di tipo selvatico allo stadio a 1,2 pieghe.Non c'è stata alcuna varianza tra i dati applicando il test di Brown-Forsythe. La riproducibilità e gli effetti di lotto associati alla misurazione della larghezza della testa sono stati valutati mediante imaging DIC 4D in tre giorni diversi. Tra questi tre gruppi di misurazione, non sono stati riscontrati né varianza né effetti di lotto.I due protocolli descritti sono stati utilizzati per valutare la lunghezza delle larve arrestate in ceppi selvatici e mutanti. L'analisi delle immagini ha fornito misurazioni assolute della lunghezza in micrometri. In questo esperimento, i mutanti erano più piccoli rispetto ai selvatici.La misurazione della lunghezza mediante citometria a flusso ha fornito risultati comparabili. Tuttavia, queste misurazioni sono state molto più robuste. Pertanto, questo metodo dovrebbe chiarire effetti più sottili nelle popolazioni mutanti.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale mantenere una portata costante durante l'esperimento per garantire un confronto equo tra i ceppi analizzati. Una volta acquisita padronanza, la misurazione della lunghezza delle larve mediante citometria a flusso consente la caratterizzazione di 18-24 condizioni o ceppi mutanti al giorno, anche considerando la calibrazione iniziale dell'apparecchiatura. Seguendo questa procedura, siamo in grado di studiare la morfologia della cellula ipodermica.Per fare ciò, possiamo utilizzare un marcatore fluorescente e la microscopia confocale per caratterizzare la funzione molecolare dei geni identificati. Non dimenticare che l'ioduro di propidio può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti e occhiali protettivi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Lo sperma deve navigare con successo attraverso l'ovidotto per fertilizzare un ovociti. Qui, descriviamo un saggio per misurare la migrazione dello sperma all'interno dell'utero ermafrodita C. elegans . Questo saggio può fornire dati quantitativi sulla distribuzione dello sperma all'interno dell'utero dopo l'accoppiamento, così come sulla velocità, la velocità direzionale e la frequenza di inversione.

Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

Questo studio descrive le misurazioni quantitative delle dimensioni sinaptiche e della localizzazione, della morfologia muscolare e della forma mitocondriale in C. elegans utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini liberamente disponibili. Questo approccio consente a studi futuri in C. elegans di confrontare quantitativamente l'estensione dei cambiamenti strutturali dei tessuti e degli organelli a seguito di mutazioni genetiche.

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

Qui, presentiamo un metodo generale per determinare la vitalità embrionale e il numero totale di embrioni prodotti (covata) utilizzando l'organismo modello C. elegans.

Misurazione della vitalità embrionale e delle dimensioni della covata in Caenorhabditis elegans

Scopri nuovi parametri per caratterizzare l'allungamento embrionale nel nematode Caenorhabditis elegans. Questo metodo consente di identificare geni che regolano le fasi iniziali e tardive dello sviluppo.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode

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