Gradiente di deformazione Chip per comportamenti stimolanti cellulari in cella-carichi idrogel

L'obiettivo generale di questo chip di deformazione a gradiente è quello di fornire un approccio semplice per generare deformazioni statiche a gradiente non continuo su un idrogel 3D per lo studio dei comportamenti cellulari in una serie di condizioni di deformazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della bioingegneria, come la stimolazione della differenziazione di una cellula staminale e la regolazione dell'allineamento cellulare per lo sviluppo di organi tissutali artificiali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che vari ceppi possono essere applicati sullo strato cellulare e idrogel nello stesso microambiente per il confronto del comportamento cellulare.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione del chip sono difficili da apprendere poiché la luce dovrebbe essere completa in tre o quattro ore per la base dell'esperimento per garantire un'elevata variabilità delle celle. Pesare 10 grammi di gelatina in polvere e aggiungerla a un pallone di vetro con 100 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, o DPBS. Inserire un'ancoretta magnetica nel pallone e posizionare il pallone su una piastra riscaldante.

Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione dell'acqua. Impostare la temperatura della piastra riscaldante da 50 a 60 gradi e l'agitatore a 100 giri/min per un'ora per sciogliere la gelatina in polvere. Dopo che la gelatina si è sciolta, aggiungere otto millilitri di anidride metacrilico molto lentamente utilizzando una pipetta.

Lasciare agire a 60 gradi Celsius per tre ore. Quindi aggiungere il DPBS preriscaldato nel pallone fino a un volume finale di 500 millilitri. Lasciare mescolare bene la soluzione per 15 minuti per fermare la reazione.

Nel frattempo tagliare una membrana per dialisi in diversi tubi lunghi 25 millimetri. Immergeteli in acqua deionizzata per 15 minuti. E fare un nodo per chiudere un'estremità dei tubi di dialisi.

Caricare la quantità appropriata di soluzione polimerica nelle provette per dialisi e chiudere l'altra estremità. Quindi posizionare i tubi pieni in un becher di plastica da cinque litri con acqua deionizzata per una settimana. Rinnovare l'acqua deionizzata due volte al giorno e mantenere la soluzione a 40-50 gradi Celsius durante il processo di dialisi.

Dopo la dialisi, raccogliere la soluzione dai tubi in un flacone di vetro da 500 millilitri. Versare circa 450-500 millilitri di soluzione in una tazza filtrante da 500 millilitri. E applicare un vuoto per forzare la soluzione a passare attraverso la membrana del filtro per la sterilizzazione.

Quindi trasferire il polimero sterilizzato in diverse provette sterilizzate da 50 millilitri. Trasferisci il polimero sterilizzato in diversi tubi sterilizzati da 50 millilitri e conservali in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per tre o cinque giorni. Liofilizzare il polimero a meno 80 gradi Celsius per una settimana utilizzando un liofilizzatore per formare GelMA che può poi essere conservato in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Per la fabbricazione del chip preparare prima il polimetacrilato o PMMA, suonato e modellato come descritto nel protocollo di testo. Quindi preparare il coperchio PTMS e il tappo PTMS mescolando correttamente 30 grammi di elastomero PTMS e tre grammi di agente indurente PTMS. Degassare la miscela sotto una camera a vuoto per un'ora.

Versare da 1,8 a due grammi di miscela nello stampo in PMMA per il coperchio PTMS. Utilizzare anche la quantità appropriata per riempire ogni cavità per lo stampo in PMMA per il tappo PTMS. Inoltre, gettare 10 grammi di miscela PTMS non polimerizzata in una piastra di plastica vuota di 10 centimetri.

Mettere questi stampini in una camera a vuoto a degassare per 30 minuti. Polimerizzare il PTMS per due ore a 80 gradi Celsius. Dopo aver raffreddato il PTMS polimerizzato sullo stampo, staccare i coperchi PTMS e i tappi PTMS dagli stampi in PMMA.

Successivamente praticare due fori con diametro di circa tre millimetri alle estremità dei canali di flusso dei coperchi PTMS. Tagliare il foglio PTMS stampato dalla lastra di plastica da 10 centimetri in tanti cubi di un centimetro per un centimetro. E fai un foro di tre millimetri in ogni cubo PTMS.

Incollare due cubi PTMS non polimerizzati da un centimetro per un centimetro sulle aperture del coperchio PTMS per fungere da serbatoi medi e per facilitare il processo di polimerizzazione dei modelli circolari di idrogel a gradiente. Quindi polimerizzare per un'ora a 80 gradi Celsius. Quindi incollare i coperchi PTMS con i due serbatoi PTMS su una guida rivestita in TMSPMA.

A tale scopo, pretrattare il lato di incollaggio del coperchio PTMS e il vetrino rivestito in TMSPMA sotto una macchina al plasma a ossigeno per 90 secondi di trattamento al plasma a ossigeno. Entrare in contatto con la superficie trattata al plasma dei coperchi PTMS e del vetrino TMSPMA e premerli strettamente per un legame permanente attraverso la formazione del legame silicio-ossigeno e silicio. Stampa una fotomaschera stampando il layout stabilito su una pellicola trasparente.

Quindi tagliare la fotomaschera stampata a 25 millimetri per 37,5 millimetri. Pesare 25 milligrammi di GelMA liofilizzato in 0,3 millilitri di terreno di coltura cellulare preriscaldato in una provetta da microcentrifuga nera da 1,5 millilitri. Mettere la provetta per microcentrifuga su una piastra riscaldante dell'agitatore da laboratorio fino a quando il GelMA non si dissolve nel mezzo.

Aggiungere 50 milligrammi di fotoiniziatore a un millilitro di DPBS in una provetta per microcentrifuga. E mettilo in un forno a 80 gradi Celsius per 15 minuti o fino a quando il fotoiniziatore non si sarà sciolto. Aggiungere 25 microlitri del fotoiniziatore al 10% alla provetta della microcentrifuga.

Pipettare più volte per mescolare bene. Successivamente, conta tre milioni di celle NIH3T3 utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Dopo aver centrifugato la sospensione a 200 Gs per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 175 microlitri di terreno di coltura cellulare.

Aggiungere la soluzione cellulare alla provetta da microcentrifuga per ottenere una soluzione di cella pre-polimero di 5% GelMA, 0,5% di fotoiniziatore e circa sei milioni di cellule 3T3 per millilitro. Dopo la miscelazione, caricare 100 microlitri di prepolimero cellulare in una microsiringa da 100 microlitri. Allineare manualmente un pezzo della fotomaschera sul vetrino inferiore del chip di deformazione a gradiente sterilizzato.

E basta fissare la posizione usando una piccola goccia di acqua deionizzata in mezzo. Collegare la microsiringa da 100 microlitri, caricata con soluzione di cellule prepolimeriche, all'ingresso del chip. Quindi posizionare 50 microlitri di soluzione di cellule prepolimeriche nel canale di flusso utilizzando la microsiringa e tappare l'uscita utilizzando un tappo PTMS.

Iniettare altri 40 microlitri di soluzione per creare un rigonfiamento convesso nella membrana circolare PTMS. Sposta il chip con la fotomaschera, la microsiringa e il plug PTMS sotto una lampada UV. Ed esponilo per 30-45 secondi per reticolare l'idrogel circolare concentrico nella camera fluidica.

Dopo la reticolazione, rimuovere il tappo PTMS e la microsiringa per rilasciare la pressione del liquido. Utilizzare una siringa da un millilitro caricata con DPBS preriscaldato per lavare tre volte le resine non reticolate sciacquando dall'ingresso all'uscita. Quindi riempire il canale di flusso con circa 100 microlitri di terreno di coltura cellulare.

Metti la patatina in un piatto di coltura sterilizzato e coltiva in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per una settimana. Rinfresca il mezzo ogni giorno. Scatta le immagini di tre chip il giorno zero dopo quattro ore di incubazione come gruppo di controllo.

E tre chip il terzo giorno come set sperimentale utilizzando un microscopio con un obiettivo 20 volte. Misura la larghezza della linea di ciascun idrogel dalla linea uno alla linea 12 utilizzando il software per calcolare le macchie di impacco. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi dei modelli di idrogel con zero microlitri e 40 microlitri sopra l'iniezione, dopo la reticolazione UV e quattro ore di incubazione.

La larghezza della linea dell'idrogel 3D nel controllo senza sovrainiezione appare uniforme come previsto. Tuttavia, i modelli di idrogel con 40 microlitri sopra l'iniezione danno una larghezza della linea sfumata degli idrogel che diminuisce dalla linea uno alla linea 12. Dopo tre giorni di incubazione, le cellule nell'idrogel si estendono in direzioni diverse.

Le cellule della prima linea si allineano lungo la direzione radiale a causa della stimolazione dell'allungamento dell'idrogel. Al contrario, le cellule della linea 12 si allineano lungo la forma dell'idrogel dove la geometria domina l'allineamento cellulare. Non c'è un allineamento cellulare specifico nella linea 7 in cui i due segnali di allineamento cellulare della linea uno e della linea 12 si bilanciano a vicenda.

Una volta misurato il microambiente delle deformazioni a gradiente su idrogel 3D, il chip di deformazione a gradiente può essere eseguito dal chip di deformazione a gradiente in due ore, se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di sterilizzare il chip di deformazione a gradiente prima di caricare la soluzione di prepolimero cellulare. Inoltre, pulire accuratamente la superficie del chip con etanolo al 75% prima di posizionare i chip nell'incubatore per colture cellulari.

Dopo aver visto questo video dovresti avere un'ottima comprensione di come generare un chip di deformazione a gradiente per studiare i comportamenti delle cellule sotto diversi ceppi imperiali.