High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli
24 marzo 2016
Questo protocollo descrive un test ad alto rendimento per testare le preferenze di deposizione delle uova di Drosophila melanogaster alla risoluzione di un singolo animale. Questo test fornisce una piattaforma semplice, efficiente e scalabile per identificare i geni e i componenti dei circuiti che controllano un semplice processo decisionale.
L'obiettivo generale di questo saggio ad alto rendimento è fornire una piattaforma semplice, efficiente e scalabile per identificare i geni e i neuroni che controllano un comportamento di scelta semplice in Drosophila. Il principale vantaggio di questo metodo è che in realtà è possibile utilizzare una scelta di ovodeposizione come scelta di riferimento, in modo altamente adatto per un singolo animale. Per iniziare l'esperimento, inserire otto femmine e sei maschi in un'ampolla stretta contenente il comune mezzo di coltura per moscerini.
Quindi utilizzare le progenie femmine sviluppate da questa provetta per gli esperimenti di deposizione delle uova. Due o tre giorni dopo l'eclosione delle femmine, preparare una pasta di lievito fresca mescolando sei grammi di lievito attivo con 10 millilitri di acido propionico 0,5%. Utilizzare una spatola per applicare la pasta di lievito sulla parete laterale delle provette contenenti il terreno di coltura.
Successivamente, inserire 30 femmine precedentemente raccolte già schiuse e 20 maschi nei vial. Dopo quattro giorni, controllare la superficie del mezzo di coltura. Se la superficie è bagnata a causa delle larve che scavano attivamente nel cibo, le mosche femmine sono pronte per esperimenti di deposizione delle uova.
Proseguire con l'esperimento recuperando le camere per la deposizione delle uova in acrilico precedentemente costruite. Inserire fogli di plastica nella parte superiore, caricando un pezzo della camera a fungere da superficie inferiore. Successivamente, anestetizzare le femmine su un tampone di anidride carbonica e caricarle singolarmente in ciascuna arena per la deposizione.
Lasciare le mosche per 30 minuti in modo che si riprendano dall'anidride carbonica e si ambientino al nuovo ambiente. Mentre le mosche si stanno adattando, riempire un tubo con agarosio fino al segno di 10 millilitri, quindi preparare un substrato di saccarosio da 150 millilitri aggiungendo 750 microlitri di soluzione di saccarosio due molare nel tubo. Mantenere una bottiglia di agarosio fuso al 1% in un bagnomaria.
Preparare il substrato semplice nello stesso modo, ma sostituire la soluzione di saccarosio con acqua distillata. Successivamente, prendere il pezzo di substrato della camera e pipettare 1.000 microlitri di substrato di agarosio in ciascuna scanalatura. Lasciare solidificare l'agarosio per 30 minuti.
Una volta pronti i substrati in agarosio e le mosche, assemblare le tre parti della camera per la deposizione delle uova, quindi rimuovere i fogli di plastica. Collocare le camere negli incubatori per moscerini per tutta la notte. Anestetizzare le femmine iniettando anidride carbonica nella camera.
Smontare la camera e scartare le mosche anestetizzate. Infine, scattare fotografie delle uova per la documentazione. L'indice di preferenza, o PI, è stato calcolato come il numero di uova deposte dalle mosche femmine quando avevano la scelta tra un substrato semplice e un substrato contenente saccarosio.
Le femmine hanno mostrato una marcata preferenza per il substrato semplice per la deposizione delle uova. Seguendo questa procedura, altre tecniche come la radio registrazione rappresentano opportunità in cui la genetica può essere applicata per rispondere ad altre domande, ad esempio su come le mosche si comportano prima di deporre ciascun uovo.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un saggio ad alto rendimento per testare le preferenze di deposizione delle uova di Drosophila melanogaster a risoluzione singolo animale. Questo saggio fornisce una piattaforma semplice, efficiente e scalabile per identificare geni e componenti dei circuiti che controllano un processo decisionale semplice.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del comportamento
- Genetica
Sfondo
- Drosophila melanogaster è un organismo modello per lo studio della genetica e del comportamento.
- Le preferenze nella deposizione delle uova sono un comportamento di scelta semplice che può essere analizzato.
- Comprendere la base genetica e neurale dei processi decisionali è fondamentale nelle neuroscienze.
- Questo saggio consente un'analisi ad alto rendimento a livello di singoli animali.
Scopo dello studio
- Identificare i geni che influenzano le preferenze nella deposizione delle uova in Drosophila.
- Esplorare i circuiti neurali coinvolti nei comportamenti decisionali.
- Stabilire un metodo scalabile per saggi comportamentali negli studi genetici.
Metodi Utilizzati
- Posizionamento di Drosophila in un ambiente controllato per l'osservazione.
- Preparazione di provette con terreno standard per moscerini per la deposizione delle uova.
- Applicazione di pasta di lievito per stimolare il comportamento di deposizione delle uova.
- Osservazione delle preferenze individuali nella deposizione delle uova nel tempo.
Risultati principali
- Il saggio identifica con successo le preferenze individuali nella deposizione delle uova.
- Le variazioni genetiche possono essere associate a differenze nel comportamento.
- I componenti neurali coinvolti nel processo decisionale possono essere mappati.
- Il metodo è scalabile per studi genetici di maggiori dimensioni.
Conclusioni
- Questo saggio ad alto rendimento è efficace per lo studio del comportamento in Drosophila.
- Fornisce informazioni sulle basi genetiche e neurali del processo decisionale.
- L'approccio può essere applicato a diversi studi genetici e comportamentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo saggio ad alto rendimento consente uno screening genetico sistematico dei comportamenti decisionali con risoluzione a livello di singolo animale, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella validazione degli obiettivi in neurofarmacologia. Fornendo letture quantitative e scalabili delle preferenze nella deposizione delle uova, supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli neurali e migliora la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta. La piattaforma potenzia la continuità traslazionale dalla scoperta del gene alla funzione del circuito, influenzando direttamente la selezione del portafoglio nello sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche che collegano geni a comportamenti di scelta semplici in un sistema geneticamente manipolabile.
- Valore operativo: Permette lo screening ad alto rendimento di singoli insetti, aumentando l'efficienza nelle campagne di riduzione del rischio dei bersagli.
- Valore predittivo: Genera dati di indice di preferenza (PI) che correlano la scelta del substrato a perturbazioni genetiche o neurali, contribuendo alla valutazione della fiducia nel bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce substrati standardizzati (semplici rispetto a quelli con saccarosio) che forniscono output quantificabili di deposizione delle uova per screening affidabili di composti o genotipi.
- Scalabilità: Le camere possono ospitare fino a trenta moscerini singoli per ogni prova, consentendo test in parallelo per librerie genetiche.
- Riproducibilità: Risultati coerenti tra le repliche supportano la standardizzazione del saggio e la condivisione di dati tra diversi laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella processi decisionali semplici rilevanti per gli endofenotipi dei disturbi neuropsichiatrici.
- De-risking meccanicistico: Permette la mappatura dei circuiti neurali coinvolti nel comportamento, riducendo l'incertezza riguardo al meccanismo d'azione della molecola bersaglio.
- Continuità traslazionale: Collega i riscontri genetici alla validazione a livello di circuito, sostenendo le decisioni di avanzamento nei percorsi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per i programmi del sistema nervoso centrale in cui i fenotipi comportamentali guidano la selezione del bersaglio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando manipolazioni genetiche o neurali a cambiamenti misurabili nelle preferenze di deposizione delle uova.
- Screening: Permette lo screening iniziale di modificatori genetici mediante output quantitativi dell'indice di preferenza.
- Analisi: Il calcolo dell'indice di preferenza (PI) fornisce una metrica normalizzata per confrontare condizioni tra diversi esperimenti.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati genetici alla funzione dei circuiti neurali, sostenendo la validazione di bersagli allineati ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Il design della camera consente il riutilizzo in diversi studi grazie a dispositivi aggiuntivi per optogenetica o registrazione video, promuovendo la sostenibilità della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi decisionali grazie alla risoluzione a livello di singolo animale.
- Valore operativo: La preparazione standardizzata delle mosche e il montaggio della camera migliorano la riproducibilità del flusso di lavoro.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go nella validazione degli obiettivi aumentando il throughput della fenotipizzazione comportamentale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli obiettivi aggiustata per il rischio, basata su evidenze genetiche e comportamentali convergenti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di Drosophila, nell’allestimento di saggi comportamentali e nella microscopia di base per la quantificazione delle uova.
- Presuppone l’accesso a strumenti di fabbricazione per le camere in acrilico e a controlli ambientali per l’incubazione delle mosche e la solidificazione dell’agarosio.
- Necessita della standardizzazione della preparazione della pasta di lievito e della versatura del substrato per garantire una motivazione costante alla deposizione delle uova tra le diverse prove.
- Le considerazioni per l’adattamento includono il tipo di substrato (ad esempio, avversivo vs. appetitivo) e le modifiche alla camera per l’integrazione con optogenetica o imaging.
- I limiti pratici comprendono la necessità di un conteggio manuale delle uova, a meno che non venga abbinato a un’analisi automatica delle immagini, come indicato nella dipendenza del protocollo dalla registrazione basata su immagini.
