Name: En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri come rilevare ossido nitrico e superossido simultaneamente nello strato endoteliale di aorte intatte di topo usando le sonde fluorescenti DAF-2DA e DHE. Questo metodo permette di studiare la funzione endoteliale e lo stress ossidativo in modelli di disfunzione vascolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (310030_141070/1), dalla Fondazione Svizzera per la Lotta al Cuore e dal Centro Nazionale di Competenza per la Ricerca (NCCR-Kidney.CH) Svizzera. Yu Yi è supportato dal Chinese Scholarship Council.

lavoro Animal è stato approvato dal Comitato Etico del veterinario di Friburgo, in Svizzera. Il protocollo segue le linee guida sulla cura degli animali e la sperimentazione presso il nostro istituto. 1. Preparazione di un set-up per l&#39;incubazione di isolato arterie <ol><li> Costruire un sistema di bagno per organi che può essere riscaldato a 37 ° C e aerato con 95% O 2 e 5% CO 2 da un serbatoio di carbonio. </li><li> Preparare quanto tampone bicarbonato di Krebs-Ringer, se necessario con la concentrazione della seguente composizione: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA, e 11,1 mm D-glucosio). </li><li> Mantenere la scorta su ghiaccio e aerare il buffer con il 95% O 2 e il 5% di CO 2. </li><li> Accendere il sistema bagno per organi, impostare la temperatura a 37 ° C, aggiungere 5 ml del tampone pronte all&#39;uso per ciascuna camerae mantenere aerare il buffer con 95% O 2 e 5% CO 2. </li><li> Lavare le camere una volta con tampone Krebs-Ringer per 30 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di Krebs-Ringer buffer per ciascuna camera e coprire la camera per evitare l&#39;evaporazione. </li></ol> 2. Isolamento di mouse aorte <ol><li> Iniettare pentobarbital che viene sciolto in 0,9% NaCl intraperitoneale alla concentrazione di 150 mg / kg di sacrificare i topi. </li><li> Posare il mouse supinamente su una tavola chirurgica. </li><li> Spruzzare la pelliccia della regione toracica con il 70% di etanolo a fini di sanificazione e umidità. </li><li> cavità aperta petto da taglio intorno al costola per esporre il cuore ei polmoni, e rimuovere i polmoni. </li><li> Rimuovere il sangue nella cavità toracica delicatamente con un fazzoletto di carta. </li><li> Afferrare cuore delicatamente con una pinza e staccare l&#39;aorta toracica tagliando il tessuto adiposo perivascolare tra l&#39;aorta e la colonna vertebrale con le forbici chirurgiche. </li><li> immergere immediatamente il da te tessuti a freddo ghiaccio (4 ° C) tampone Krebs-Ringer. </li><li> Rimuovere cuore e l&#39;arco aortico sotto un microscopio di dissezione e mantenere il segmento aortico toracico nel buffer. </li><li> Sezionare l&#39;aorta libera di aderire il tessuto perivascolare al microscopio con le forbici e pinze chirurgiche. </li><li> Afferrare il bordo fine dell&#39;aorta con una pinza, e lavare via il sangue nel lume vascolare da vampate di calore delicatamente tampone Krebs-Ringer con un 26 G × 1 / 2&quot; siringa. </li><li> Tagliare gli anelli aortici puliti in segmenti lunghi 3 mm. Nota: Prestare attenzione a questo passaggio per non danneggiare strato endoteliale. </li></ol> 3. DHE e DAF-2DA colorazione <ol><li> Trasferire i segmenti aortici puliti con una pinza verso le camere di bagno per organi pieni di Krebs-Ringer tampone a 37 ° C aerato con 95% O 2 e 5% CO 2. Nota: toccare solo il lato avventiziale degli anelli aortici con una pinza e non bloccare il bvasi lood. </li><li> Equilibrare le arterie nella camera vasca organo per 30 min. </li><li> Aggiungere acetilcolina (ACh) al bagno per organi alla concentrazione finale 1 mM, e incubare le arterie per 10 min. </li><li> Preparare 1 ml di soluzione DHE / DAF-2DA (5 micron di ogni colorante, diluito da 1.000 × magazzino) con pre-riscaldato tampone Krebs-Ringer in 1,5 ml provetta. Avvolgere la provetta con un foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Dopo la stimolazione, trasferire gli anelli aortici da bagno per organi alla soluzione DHE / DAF-2DA in una provetta a 37 ° C aerato con 95% O 2 e 5% di CO 2 e incubare gli anelli aortici per 30 min. Nota: Da questo punto, tenere le aorte sempre nel buio. </li><li> Trasferire gli anelli aortici ad una nuova provetta con tampone Krebs-Ringer per il lavaggio e ripetere il lavaggio tre volte entro 1 min. </li><li> Trasferire gli anelli aortici alla soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio per il 30min. </li><li> Preparare 1 ml 4 &#39;, 6-soluzione diamidino-2-phenylindole (DAPI) (300 Nm, diluito da 1.000 × magazzino) con tampone fosfato (PBS) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Controcolorare le aorte per 3 min. </li><li> Trasferire i aorte alla nuova provetta con tampone PBS per il lavaggio per 1 min. Ripetere il lavaggio tre volte. Nota: Fare attenzione a non bloccare gli anelli aortici o danneggiare lo strato endoteliale. </li></ol> 4. En Face di montaggio <ol><li> Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alla diapositiva. </li><li> Tagliare gli anelli aortici longitudinalmente con le forbici microchirurgia al microscopio, apportare le aorte arrotolati piatta e montarlo en face sul mezzo di montaggio con l&#39;endotelio rivolto verso il basso sul vetrino. Non spostare le aorte avanti e indietro. </li><li> Coprire il vetrino con copertura di slittamento e sigillare il vetrino con smalto. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione aria sotto protezione dalla luce, utilizzare gli scivoli per l&#39;imaging directly entro poche ore o conservarli a -20 ° C per i prossimi giorni. </li></ol> 5. confocale microscopico Imaging <ol><li> Utilizzare un microscopio confocale per rilevare i segnali di fluorescenza. Accendere la macchina e ottimizzare le impostazioni di imaging, come l&#39;ingrandimento, la velocità di scansione, la risoluzione, Z-stack. <ol><li> Per questo protocollo, utilizzare un 200 Hz velocità di scansione, risoluzione di 1.024 × 1.024 pixel e la dimensione Z-passo di 0,25 micron. Eccitare la fluorescenza da DAF-2DA con 488 nm laser ad argon e rilevare a 515 nm, mentre eccitare la fluorescenza da DHE a 514 nm e rilevare a 605 nm di emissione. </li></ol></li><li> Utilizzare 10X ingrandimenti di concentrarsi sul campione fino a quando il segnale è chiaro DAPI con raggi ultravioletti, e quindi regolare l&#39;obiettivo a 40x ingrandimenti. </li><li> Definire l&#39;intervallo dello strato endoteliale regolando la posizione Z sul pannello di controllo. I segnali di nuclei DAPI macchiati sono punti ovale o rotonda nello strato endoteliale. </li><li> Scansione dall&#39;alto(Strato endoteliale sul confine lume) del campione attraverso l&#39;intero spessore di immagini segnale e registrare endoteliali. Scegli almeno 3 campi diversi per la scansione di ogni campione. </li></ol> 6. Analisi di Immagini <ol><li> Utilizzare il software per aprire i dati acquisiti al microscopio confocale. Scegliere tre immagini consecutive per campo per l&#39;analisi e la valutazione di almeno 3 diversi campi per campione. Esportare le immagini scelte e salvarle come file JPEG. </li><li> Quantificare le immagini da DAF-2DA, DHE e colorazione DAPI con il software di elaborazione delle immagini. Per l&#39;immagine dalla colorazione DAPI, scegliere &#39;Plugin&#39; → &#39;analizzare&#39; → &#39;cellulare Contatore&#39; per contare il numero di DAPI nucleo positivo. <ol><li> Per le immagini da DAF-2DA e DHE colorazione, scegliere &#39;Analizza&#39; → &#39;Misura&#39; per analizzare l&#39;intensità dei segnali, e prendere il valore &#39;medio&#39;, come l&#39;intensità del segnale relativo. Presenti poi i risultati come il rapporto tra DAF-2DA pernuclei positivi DAPI o il rapporto di DHE per DAPI. Per ogni campione, prendere il valore medio di ogni immagine e campo. </li></ol></li><li> Dividere il risultato di ogni campione per la media del gruppo di controllo per ottenere il cambiamento piega. L&#39;analisi statistica è stata effettuata con test t di Student spaiato o ANOVA con Dunnett o Bonferroni post-test. Dare dati come media ± SEM. Considerate le differenze di valori medi, come significativa a p &lt;0.05 14. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Rilevazione di NO o O 2 .- con coloranti fluorescenti è stato spesso usato in molti studi in cellule endoteliali in coltura e anche in tessuto criosezioni 23. Qui abbiamo esteso questo metodo per i vasi sanguigni di vita intatto, vale a dire, en face detection di NO e O 2 .- livelli nello strato endoteliale con rispettivamente DAF-2DA e DHE, che è efficace, relativamente semplice, e intuitivo. In confronto con il metodo criosezioni vascola...

Le cellule endoteliali vascolari mantenere l&#39;integrità strutturale e funzionale vascolare rilasciando fattori vasoattivi 1. Tra questi fattori, l&#39;ossido di azoto endotelio-derivati ​​(NO) prodotto da L-arginina tramite endoteliale NO-sintasi (eNOS) è il fattore più importante e meglio caratterizzato nella fisiologia cardiovascolare 2. NO provoca il rilassamento della muscolatura liscia e inibisce la proliferazione delle cellule, inibisce l&#39;aggregazione piastrinica e l&#39;adesione delle cellule infiammatorie e l&#39;infiltrazione nello spazio sottoendoteliale, quindi la protezione contro lo sviluppo della malattia vascolare 3. In molte condizioni fisiologiche e patologiche, tra cui l&#39;invecchiamento, ipertensione, diabete, iperlipidemia, ecc, disfunzione endoteliale caratterizzata da ridotta biodisponibilità di NO e aumentato O 2 .- produzione è presente e promuove la patogenesi dell&#39;aterosclerosi 2. Gli studi degli ultimi anni dimostrano che il disaccoppiamento di eNOS è unimportante meccanismo per la disfunzione endoteliale, in cui l&#39;enzima eNOS genera O 2 .- invece di NO, nelle varie condizioni suddette 1,4. Pertanto, l&#39;analisi della funzione endoteliale, in particolare, endoteliali produzione di NO e O 2 .- generazione è fondamentale per la ricerca sperimentale sulle malattie cardiovascolari e complicanze. Ci sono numerosi approcci metodologici che sono stati sviluppati per analizzare e misurare la produzione di NO in campioni biologici. A causa della natura estremamente labile di NO che viene facilmente ossidato a NO 2 - e NO 3 - con un&#39;emivita di 3 a 6 sec, è difficile da misurare direttamente NO. Pertanto determinazione di NO 2 - / NO 3 - nei campioni di liquido è stato usato come indice di NO liberato dalle cellule o tessuti 5. Anche se la procedura è relativamente semplice, il metodo è, tuttavia, easily affetto da alta sfondo di NO stabile 2 - / NO 3 - contenuto nella soluzione. Perché NO stimola solubili della guanilato ciclasi per la produzione di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) 6, il livello di cGMP cellulare è stato anche determinato a stimare il rilascio di NO 7. Anche in questo caso, si tratta di una stima indiretta e non può essere specifica, dal momento che alcuni fattori endotelio-derivati ​​come il C-peptide natriuretico di tipo (CNP) potrebbe anche aumentare i livelli di cGMP attraverso l&#39;attivazione di particolato guanilato ciclasi 8. NO è prodotto da L-arginina con generazione di L-citrullina come sottoprodotto 9, misura della produzione di L-citrullina è quindi utilizzato anche come un metodo indiretto per stimare la produzione di NO. I principali svantaggi di questo metodo sono che è radioattivo e non misura i livelli di NO bioattivi, dal momento che NO Liberatoria potrebbe essere rapidamente inattivato da O 2 .-; Inoltre, L-citrullina può essere riciclato a L-arginina 10. Altri metodi chimici come il rilevamento chemiluminescenza 11, risonanza di spin elettronico 12, o porfirinico elettrochimico NO sensore 13 sono utilizzati da molti ricercatori. Questi metodi non sono di solito facile in funzionamento, le procedure di rilevamento e richiedono attrezzature speciali. E &#39;anche ricordare che molti studi si applicano esperimenti bagno per organi con i vasi sanguigni isolati con o senza l&#39;endotelio per valutare la funzione endoteliale e indirettamente misura non mediata rilassamenti vascolare endotelio-derivati. Tuttavia, questo metodo, anche se è principalmente vicino alla situazione fisiologica, ma strettamente a dire, non misura NO funzione, piuttosto valuta endotelio-mediata risposte vasomotorie in generale che riflettono effetti netti della funzione eNOS, produzione di altri derivazione endoteliale rilassante fattori e fattori contraenti endotelio-derivati, la produzione di O 2 .-, e anche le risposte delle cellule muscolari liscea questi fattori. Un&#39;analisi specifica della funzione eNOS e la produzione di NO è di solito necessario 3. Molti gruppi di ricerca hanno compreso il nostro, negli ultimi anni ha usato il metodo colorante fluorescente per rilevare la produzione intracellulare di NO 14-19. In questo metodo è stato utilizzato il cellulare spia permeabile fluorescenza diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) per misurare la libera funzione NO e NOS in cellule e tessuti in vitro o ex vivo vivente. Il principio è che nelle cellule viventi, DAF-2DA è deacetilata da esterasi intracellulare di non fluorescente 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) che è stato poi convertito in fluorescente DAF-2 triazolo (DAF-2T) reagendo con NO . La fluorescenza da DAF-2T può essere osservata sotto un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a fluorescenza 14. L&#39;intensità della fluorescenza intracellulare riflette quindi la produzione NO intracellulare nelle cellule o dell&#39;endotelio di un intatto in vesse sanguel. In combinazione con uno specifico colorante fluorescente come dihydroethidium (DHE), si può valutare contemporaneamente intracellulare NO e O 2 .- generazione nelle cellule o nei vasi sanguigni 14. Analogamente, DHE è anche un composto cellula-permeabile che viene ossidato da O 2 .- all&#39;interno delle cellule, e il prodotto ossidativo poi intercala con acidi nucleici per emettere un colore rosso vivo rilevabile quantitativamente mediante microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale. DHE è un colorante molto specifica per il rilevamento di O 2 .- da campioni biologici, in quanto rileva essenzialmente radicali superossido, viene mantenuto bene da cellule, e può anche tollerare fissaggio lieve 20. Uno dei vantaggi di questo metodo colorante fluorescente è che rileva e visualizza NO e / o O 2 .- en face direttamente sullo strato endoteliale intatto di un vaso sanguigno vivente. In questo documento,descriviamo questo metodo colorante fluorescente per rilevare NO e O 2 .- che abbiamo adattato per en face detection di NO e O 2 .- in aorte intatte di un modello murino di obesità indotta da alto contenuto di grassi, la dieta (HFD) di alimentazione. Abbiamo dimostrato che questo metodo potrebbe con successo e in modo affidabile misurare NO e O 2 .- livelli e valutare la funzione eNOS (dis) nello strato endoteliale di appena isolate aorte intatte mouse in obesità.

<table><tbody><tr><td>Diidroetidio (DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>si dissolve con DMSO a 5&nbsp; mmol/L come 1.000x stock, immagazzinato a -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Diaminofluoresceina-2 Diacetato (DAF-2DA)</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>sciogliere con DMSO a 5&nbsp; mmol/L come 1.000x stock, immagazzinato a -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>sciogliere con acqua a 300&nbsp; &micro; mol/L come 1.000x stock, immagazzinato a 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Supporto di montaggio</td><td>Lavoro vettoriale. (reactolab)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N<sotto>&#969; -Nitro-L-arginina metil estere cloridrato (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Myograph System&nbsp;</td><td>Microscopio danese Myo Technology A/S</td><td>modello 610M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio</td> confocale Nikon <td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica&nbsp;</td><td>DM6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software di elaborazione</td><td>delle immagini National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche&nbsp;</td><td>S& T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microchirurgia&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>S& T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti rotondo diametro 15&nbsp; mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>Punte da 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suggerimenti 200 &#956; l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Provette Safe-Lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>Cloruro di acetilcolina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en face detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie intact

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

ossido nitrico endotelio-derivato (NO) prodotto da endoteliale NO-sintasi (eNOS) è uno dei più importanti molecole vasoprotettive nella fisiologia cardiovascolare. Disfunzionale eNOS quali sganciamento eNOS porta alla diminuzione NO biodisponibilità e aumento anione superossido (O 2 .-) di produzione, e, a sua volta promuove malattie cardiovascolari. Pertanto, la misura appropriata di NO e O 2 .- livelli nelle cellule endoteliali sono fondamentale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e complicanze. A causa della natura estremamente labile di NO e O 2 .-, è difficile misurare NO e O 2 .- direttamente in un vaso sanguigno. Sono stati sviluppati numerosi metodi per misurare NO e O 2 .- produzione. È, tuttavia, sia insensibile, o non specifici, o tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali. Qui si descrive un adattamentodel metodo colorante fluorescente per en Face Detection e la visualizzazione di intracellulare NO e O 2 simultanea .- utilizzando la cellula permeabile diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), rispettivamente in aorte intatte di un modello di obesità del mouse indotti per l&#39;alimentazione ricca di grassi-dieta. Abbiamo potuto dimostrare diminuzione intracellulare NO e O migliorato 2 .- livelli nelle aorte intatti appena isolati di topo obesità rispetto al controllo del mouse magra. Abbiamo dimostrato che questo metodo è una tecnica semplice per la rilevazione diretta e visualizzazione di NO e O 2 .- nei vasi sanguigni intatti e può essere ampiamente applicato per l&#39;indagine della funzione endoteliale (dis) sotto (fisio) condizioni patologiche.

L&#39;obesità è un importante fattore di rischio di malattia coronarica ischemica ed è associata a diminuzione endoteliale NO biodisponibilità, un segno distintivo della malattia vascolare aterosclerotica 21. eNOS-disaccoppiamento ha dimostrato di essere un importante meccanismo di disfunzione endoteliale in numerose condizioni fisiologiche e patologiche inclusi anziani 22, arteriosclerosi, l&#39;obesità e 14. Pertanto, qui mettiamo a confronto i topi mag...

In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O 2 .- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è rilevare simultaneamente il monossido di azoto intracellulare e gli anioni superossido mediante l'utilizzo dei coloranti fluorescenti DAF-2DA e DHE in aorte di topo isolate fresche e integre. Questo metodo può essere utile nei laboratori per sostenere casi di ricerca nel campo della fisiologia cardiovascolare, come la disfunzione endoteliale e il disaccoppiamento dell'eNOS. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un metodo semplice e preciso per il rilevamento diretto e la visualizzazione ex vivo simultanea di monossido di azoto e anione superossido in vasi sanguigni integri.Per questo protocollo, costruire un sistema di bagno d'organo che possa essere riscaldato a 37 gradi Celsius e aerato con una miscela gassosa al 95% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica proveniente da una bombola di gas. Per iniziare, preparare una quantità sufficiente di tampone bicarbonato di Krebs-Ringer, fresco, necessaria per immergere i tessuti di interesse. Ad esempio, sono necessari 200 millilitri per le aorte in un singolo esperimento.Accendere il sistema del bagno d'organo e regolare il controllo della temperatura a 37 gradi Cel

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La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) spettroscopia è stato impiegato per rilevare ossido nitrico da cellule endoteliali aortiche bovine e radicale superossido da neutrofili umani utilizzando ferro (II)-N-metil-D-glucammina ditiocarbammato, Fe...

Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

La produzione endogena di ossido nitrico (NO) regola una varietà di funzioni biologiche. Sta diventando sempre più chiaro che l'alterazione o disregolazione di NO segnalazione based è coinvolta in molte malattie umane. Metodi per quantificare relativo numero metaboliti possono fornire nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici per le malattie umane.

Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

La funzione delle cellule vascolari dipende dall'attività dei messaggeri intracellulari.  Qui descritto è un metodo di imaging ex vivo a due fotoni che consente la misurazione dei livelli intracellulari di calcio e ossido nitrico in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici in singole cellule endoteliali e muscolari lisce di un'aorta isolata.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell'arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine ​​e l'identificazione dei tipi di cellule nell'intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.

En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Questo manoscritto presenta protocolli per l'applicazione di nuove sonde di ossido nitrico (NO•) geneticamente codificate (geNOps) per monitorare le fluttuazioni di NO• di singole cellule in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. La formazione di NO• innescata dal Ca2+ a livello delle singole cellule endoteliali è stata visualizzata combinando geNOps con un sensore chimico di Ca2+.

L&#39;applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule

Qui, presentiamo un protocollo per l'immunofluorescenza colorazione per osservare direttamente le cellule endoteliali dell'aorta del topo. Questa tecnica è utile quando si studia il fenotipo cellulare e molecolare delle cellule endoteliali in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell'aterosclerosi.

Uso dell'immunofluorescenza en faccia per osservare direttamente le cellule endoteliali vascolari

Qui presentiamo protocolli per rilevare l'ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.

Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

La generazione di anione superossido è essenziale per la stimolazione delle piastrine e, se disregolata, fondamentale per le malattie trombotiche. Qui, presentiamo tre protocolli per la rilevazione selettiva di anioni superossido e lo studio della regolazione piastrinica redox-dipendente.

Metodi alternativi per la rilevazione della generazione di anioni superossido nelle piastrine 

Nucleosoma ELISA (NU-ELISA) è un metodo sensibile e quantitativa per rilevare modelli globali di modificazioni post-traduzionali nelle preparazioni dei nativi, nucleosomi intatto. Queste modifiche includono methylations, acetylations e fosforilazioni a specifici residui di aminoacidi degli istoni, e quindi NU-ELISA fornisce un test globale proteomica della complessivo stati modificazione della cromatina di tipi cellulari specifici.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

Scopri come rilevare ossido nitrico e superossido simultaneamente nello strato endoteliale di aorte intatte di topo usando le sonde fluorescenti DAF-2DA e DHE. Questo metodo permette di studiare la funzione endoteliale e lo stress ossidativo in modelli di disfunzione vascolare.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

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