En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare simultaneamente gli anioni intracellulari di ossido nitrico e superossido utilizzando il colorante a fluorescenza DAF-2DA e DHE in aorte di topo intatte appena isolate. Questo metodo può aiutare in laboratorio a recuperare il caso di un ricercatore nel campo della fisiologia cardiovascolare come la disfunzione endoteliale e il disaccoppiamento di eNOS. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di fornire un metodo semplice e preciso per la rilevazione diretta ex vivo e la visualizzazione simultanea dell'ossido nitrico e dell'anione superossido in vasi sanguigni intatti.

Per questo protocollo, costruire un sistema di bagno d'organo che può essere riscaldato a 37 gradi Celsius e aerato con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica da un serbatoio di gas di carbonio. Per iniziare, prepara una quantità sufficiente di tampone di bicarbonato Krebs-Ringer fresco secondo necessità per bagnare i tessuti di interesse. Ad esempio, in un esperimento sono necessari 200 millilitri per le aorte.

Accendere il sistema del bagno d'organo e regolare il controllo del calore a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato le camere con il tampone bicarbonato Krebs-Ringer, aggiungere cinque millilitri di tampone bicarbonato Krebs-Ringer a ciascuna camera e accendere il gas per aerarlo con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Tenere le camere coperte.

Inoltre, prepara una bottiglia di tampone bicarbonato Krebs-Ringer ghiacciato con aerazione. Dopo l'asportazione dell'aorta toracica, immergere immediatamente l'intero tessuto in una piastra con tampone Krebs-Ringer ghiacciato. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere il cuore e l'arco aortico mantenendo il segmento aortico toracico nel tampone.

Quindi, sezionare l'aorta liberandola dal tessuto perivascolare aderente utilizzando forbici chirurgiche e pinze. Successivamente, utilizzare una pinza per afferrare il bordo del tessuto e sciacquare delicatamente il sangue dal lume vascolare utilizzando il tampone Krebs-Ringer ghiacciato erogato da una siringa. I coaguli di sangue nel lume vascolare devono essere eliminati perché possono causare segnali artificiali e interferire con i segnali fluorescenti mentre, allo stesso tempo, la forza di lavaggio deve essere controllata per non danneggiare lo strato endoteliale.

Ora, taglia gli anelli aortici puliti in segmenti lunghi tre millimetri. Dopo aver preparato gli anelli aortici puliti, colorarli. Toccando solo il lato avventiziale degli anelli aortici con una pinza, senza bloccare i vasi sanguigni, trasferire i segmenti aortici puliti nelle camere del bagno d'organo preparate.

Lasciare che le arterie si equilibrino nel tampone per 30 minuti. Dopo mezz'ora, aggiungere acetilcolina al bagno d'organo per ottenere una concentrazione finale di un micromolare e incubare le arterie per 10 minuti con l'acetilcolina. Nel frattempo, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, preparare un millilitro di soluzione colorante con tampone Krebs preriscaldato.

Quindi, avvolgi il tubo in un foglio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce e mantenerlo a 37 gradi Celsius. Dopo la stimolazione con acetilcolina, trasferire gli anelli aortici dal bagno d'organo al tubo di soluzione colorante e lasciarli incubare per 30 minuti al buio con aerazione. Tutti i passaggi da questo punto in avanti dovrebbero essere eseguiti con un'esposizione minima alla luce.

Quindi, trasferire gli anelli aortici in una nuova provetta riempita con tampone Krebs per un minuto. Eseguire questa fase di lavaggio tre volte. Quindi, fissare gli anelli aortici in un bagno di soluzione di paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la fase di fissaggio, trasferire gli anelli nella soluzione DAPI per tre minuti a temperatura ambiente per applicare il controcolorante. Quindi, lavare gli anelli aortici con PBS tre volte per un minuto per lavaggio. Sii sempre sensibile alla fragilità del tessuto endoteliale quando muovi gli anelli.

Al microscopio, tagliare gli anelli aortici longitudinalmente con le forbici microchirurgiche su un vetrino. Quindi, rimuovere il liquido in eccesso dall'aorta mantenendola bagnata. Forzare le aorte arrotolate contro un vetrino con l'endotelio rivolto verso il basso sul vetrino utilizzando due pinze microchirurgiche.

In questo processo, non muovere le aorte avanti e indietro. Questo passaggio è molto critico, ma non facile da usare. È meglio esercitarsi molto prima dell'esperimento formale.

Quindi, far cadere il mezzo di montaggio sull'aorta. Copri il vetrino e sigillalo con lo smalto per unghie. Dopo l'essiccazione all'aria al buio, visualizzare i vetrini utilizzando la microscopia confocale.

Utilizza una velocità di scansione di 200 hertz, una risoluzione di 1024 x 1024 pixel e una dimensione dello z-stack di un quarto di micron. Per osservare il DAF-2DA, utilizzare un laser ad argon, impostare la fluorescenza di eccitazione a 488 nanometri e il rilevamento dell'emissione a 515 nanometri. Per osservare il DHE, impostare la fluorescenza eccitata a 514 nanometri e impostare la rilevazione a 605 nanometri.

Dopo aver messo a fuoco con ingrandimenti 10x, regolare l'obiettivo su ingrandimenti 40x. Ora, definisci l'intervallo dello strato endoteliale regolando la posizione z sul pannello di controllo, utilizzando i nuclei colorati con DAPI come punti di riferimento. Quindi, eseguire la scansione dallo strato endoteliale sul bordo del lume attraverso l'intero spessore dello strato endoteliale e registrare le immagini.

Scansiona almeno tre diversi campi visivi per ogni campione. I giovani topi neri C57 6 sono stati resi obesi alimentati con una dieta ricca di grassi per 14 settimane. I controlli sono stati alimentati con un cibo normale.

Dopo 14 settimane, sono state esaminate le arterie toraciche. Prima della colorazione, i tessuti sono stati esposti all'inibitore di eNOS L-NAME per un'ora a un nanomolare. Il segnale di DAF-2T, visto in verde, viene convertito da DAF-2 non fluorescente dall'ossido nitrico.

Quindi, la colorazione suggerisce la presenza di ossido nitrico in una cellula. Allo stesso modo, quando ossidato dal superossido, il DHE emette un segnale fluorescente rosso. Quindi, i campioni che mostrano più colore rosso hanno più superossido nelle cellule.

La quantificazione delle immagini a fluorescenza confocale ha rivelato una diminuzione della produzione di ossido nitrico e un aumento della generazione di super ossido sensibile a L-NAME nello strato endoteliale aortico dei topi alimentati con la dieta ricca di grassi. Questi dati supportano l'idea che il disaccoppiamento eNOS si verifichi con l'obesità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare l'ossido nitrico e gli anioni superossido e l'uso di coloranti fluorescenti nei vasi sanguigni intatti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere intatto lo strato endoteliale durante l'intera procedura operativa. E immergere sempre i vasi sanguigni nel tampone Krebs-Ringer per mantenere in vita le cellule endoteliali prima della fase di fissazione.

Combinando con questa procedura possono essere eseguite altre misure come l'analisi delle risposte vasomotorie dei vasi sanguigni per rispondere a ulteriori domande come la funzione fisiologica delle cellule endoteliali nella regolazione del tono vascolare.