Name: A High Resolution metodo per monitorare lattivazione fosforilazione-dipendente di IRF3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Scopri un metodo ad alta risoluzione per analizzare l'attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3 utilizzando SDS-PAGE, native-PAGE e immunoblot con anticorpi fosfo-specifici. Questa tecnica sensibile ed economica distingue le diverse forme attivate di IRF3 nelle risposte immunitarie innate.

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Gli autori ringraziano i membri precedenti e attuali del laboratorio per lo sviluppo dei protocolli. Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [sovvenzione # MOP-130527] e dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG ha ricevuto una cattedra di ricerca canadese di livello II. AR detiene una borsa di studio del programma di formazione della Rete di ricerca sulla salute respiratoria del Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

NOTA: Il protocollo è descritto qui utilizzando cellule A549 infettate con il virus di Sendai (SeV). Tuttavia, il protocollo per SDS-PAGE e PAGE nativo funziona anche con tutti i tipi di cellule umane e murine testati finora, in particolare le cellule mieloidi stimolate con vari-IRF3 attivando 9,15,19,24,25 stimoli. 1. L&#39;infezione di cellule A549 <ol><li> Mantenere cellule A549 in coltura in una piastra 15 cm a 37 ° C / 5% di CO 2 in 20 ml F12K / mezzo Ham contenente il 10% di siero inattivato al calore fetale bovino (HI-FBS) e 1% di L-glutammina (completo F12K / Prosciutto di media). NOTA: Tutte le soluzioni usate per la cultura e trattamenti con le cellule devono essere sterili. </li><li> A 24 ore prima dell&#39;infezione, aspirare il terreno e lavare le cellule con 10 ml di acqua distillata tampone fosfato salino (PBS-D) a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA soluzione per ciascuna piastra per coprire le cellule e incubare a 37 ° C per 3 min. </li><li> Fermare l&#39;incubazione non appena thcellule e cominciano a staccarsi dalla piastra delicatamente toccando il piatto con una sola mano. Inattivare i tripsina aggiungendo 10 ml di completo F12K / Ham medio preriscaldato per piastra e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare a 350 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 8 ml di completo F12K / Ham mezzo per ottenere una sospensione omogenea di cellule singole. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seme le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule per piastra 60 mm in 4 ml di completo F12K / Ham medio pre-riscaldato. Incubare per 20 - 24 ore a 37 ° C / 5% CO 2. Dopo 20 - 24 ore, le cellule formano un monostrato confluente 90% (che corrisponde a 1,5 x 10 6 cellule). </li><li> Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 2 ml di F12K privo di siero / medio Ham (SFM). Aggiungere 2 ml di SFM fresca per 60 millimetri piatto. </li><li> Scongelare una aliquota di Sendai virus (SeV) (conservato in aliquote a -80 ° C) su ghiaccio e vortex brevemente. </li><li> Diluire °e virus in pre-riscaldato SFM per ottenere 60 HAU / 100 ml. Mescolare pipettando su e giù dolcemente e aggiungere 100 ml di virus diluito per piastra per eseguire l&#39;infezione a 40 unità di agglutinazione / 10 6 cellule. Non aggiungere virus nella piastra di controllo non infetto. </li><li> Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C / 5% di CO 2. Agitare le piastre manualmente 3 o 4 volte, o utilizzando un agitatore orbitale o dondolo automatico collocato direttamente in incubatrice, durante la prima ora di infezione. </li><li> A 2 ore dopo l&#39;infezione, aggiungere 2 ml di F12K / Cam mezzo contenente 20% di HI-FBS per ottenere una concentrazione finale di 10% HI-FBS. </li><li> Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C / 5% di CO 2 per un ulteriore 1, 4 e 7 ore per raggiungere tempi totali infezione di 3, 6 e 9 ore, rispettivamente. In ciascuno di questi punti di tempo, procedere al punto 2.1. </li></ol> 2. Preparazione di estratti cellulari Whole (WCE) <ol><li> Rimuovere il supporto infezione. Raccogliere le cellule raschiando in 1 mldi ghiacciata D-PBS e trasferire la sospensione cellulare in un pre-raffreddata 1,5 ml provetta da centrifuga. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 16.000 xg a 4 ° C per 20 sec e decantare accuratamente ogni traccia di D-PBS. NOTA: A questo punto, il pellet cellulare può essere direttamente sottoposto ad estrazione proteina o congelati rapidamente in azoto liquido o ghiaccio secco / bagno di etanolo e conservato a -80 ° C fino lisi. </li><li> Preparare il tampone di lisi contenente 50 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% glicerolo e 1% Nonidet P-40 in acqua deionizzata (DDH 2 O). Estemporaneamente aggiungere proteasi (1 mg / ml leupeptina e 2 mg / ml aprotinina) e fosfatasi inibitori (fluoruro di sodio 5 mM, 1 mM attivato orthovanadate sodio, 2 mM p-nitrofenil fosfato e 10 mM β-glicerofosfato pH 7,5). NOTA: Il tampone di lisi senza inibitori può essere conservato a 4 ° C. Un protocollo specifico per l&#39;attivazione di orthovanadate sodio è descritto nella tabella di Reagenti Specifici / Equipment. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 70 ml di tampone di lisi. In genere la concentrazione lisato sarà di circa 2 mg / mL. </li><li> Incubare in ghiaccio per 20 min. Flash-congelare il lisato mediante incubazione in un bagno di azoto liquido per 15 secondi. Scongelare il lisato a RT finché non è completamente fuso e vortex per 10 sec. Ripetere il congelamento / scongelamento / ciclo vortex per 3 volte. <ol><li> In alternativa, eseguire la fase di congelamento in un / bagno di ghiaccio secco di etanolo per 1 min. </li></ol></li><li> Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 20 min. Trasferire il surnatante (corrispondente al WCE) in un pre-raffreddata 1,5 ml provetta da centrifuga. Tenere il WCE su ghiaccio in ogni momento. </li><li> Quantificare le proteine ​​utilizzando qualsiasi procedura di quantificazione di proteine ​​compatibile con il tampone di lisi, come a base di Metodo di Bradford 26. </li></ol> 3. Risoluzione del WCE per alta risoluzione SDS-PAGE <ol><li> Preparare tre denaturazione gel elettroforesi. <ol><li> Per la rilevazione diForme IRF3, versare due gel di almeno 16 cm di lunghezza con un gel di separazione composto 7,5% acrilammide / bis-acrilammide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% sodio dodecil solfato (SDS ), 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O e un gel di impilamento composto 4% acrilammide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% persolfato di ammonio e 0,1% TEMED in DDH 2 O. Attenzione! Acrilamide, TEMED e SDS sono tossici e / o irritanti. Indossare guanti protettivi e manipolare sotto una cappa aspirante. </li><li> Per la rilevazione di proteine ​​Sev, versare un gel di un minimo di 8,5 cm di lunghezza con caratteristiche simili al gel descritto in 3.1.1, tranne che il gel di separazione contiene il 12% di acrilammide. </li></ol></li><li> Denaturare WCE ottenuto nel passaggio 2,6 aggiungendo 1: 4 (v / v) di tampone 5x carico (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), il 10% SDS, 20% (p / v) di glicerolo, 0,0005% blu di bromofenolo e 25% β-mercaptoetanolo in DDH 2 O) e successivamente riscaldati a 100 °C per 10 min. Giro veloce i tubi per far cadere la condensa che si forma nel tappo. Attenzione! β-mercaptoetanolo è tossico per inalazione. Indossare guanti protettivi e manipolare sotto una cappa aspirante. </li><li> Montare i gel nell&#39;apparato migrazione. Riempire le camere superiori e inferiori con corsa tampone contenente 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS e glicina 192 mM in acqua distillata (dH 2 O). </li><li> Carico di 14 ml di standard di peso molecolare in un pozzetto di ogni gel 16 centimetri e 7 ml di standard di peso molecolare in un pozzetto del gel 8,5 centimetri. Carico 30 mg di WCE denaturato (preparato come descritto al punto 3.2) per pozzetto dei due gel previste al punto 3.1.1 per il rilevamento di forme IRF3. Carico 8-10 mg di WCE denaturato (preparato come descritto al punto 3.2) per bene sul gel preparato al punto 3.1.2 per l&#39;analisi SeV. </li><li> Eseguire il gel al 30 mA corrente costante fino al fronte migrazione raggiunge il fondo del gel. NOTA: La migrazione in genere dura approssitamente 3 ore per un gel 16 centimetri e 45 minuti per un gel 8,5 centimetri. </li><li> Procedere al trasferimento su membrane di nitrocellulosa (fase 5). </li></ol> 4. Analisi dei IRF3 dimerizzazione da Native-PAGE Nota: questo metodo è stato originariamente descritto dal gruppo del Dr. T. Fujita 27. <ol><li> Preparare i superiori (-) e inferiore (+) buffer di elettroforesi camera. Il buffer camera superiore è costituito da 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT), glicina 192 mM e 1% sodio desossicolato (DOC) in DDH 2 O. Il buffer camera inferiore contiene 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT) e 192 mM glicina in DDH 2 O. NOTA: La camera di buffer di elettroforesi superiori ed inferiori possono essere conservati a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Tuttavia, assicurarsi che siano pre-riscaldato a RT prima di eseguire la elettroforesi. </li><li> Versare un gel non denaturante risoluzione di un minimo di 8.5 cm di lunghezza, contenente 7,5% di acrilammide / bis-acrilammide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% ammonio persolfato e 0,1% TEMED in DDH 2 O. </li><li> Pre-eseguire il gel a 40 mA corrente costante per 30 min in ghiaccio. Premere il funzionamento dell&#39;apparato nel ghiaccio approssimativamente al livello del buffer elettroforesi camera inferiore. È importante che il gel non è nel ghiaccio. </li><li> Durante la pre-corsa, mix WCE tenuti in ghiaccio con 2x nativo-PAGE tampone di caricamento 1: 1 (v / v) contenente 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), il 30% di glicerolo e 0,1% blu di bromofenolo in DDH 2 O. </li><li> Carico 8 - 10 mcg WCE (preparato come descritto al punto 4.4) immediatamente al termine della pre-corsa. </li><li> Eseguire il gel a 25 mA corrente costante sul ghiaccio, come descritto sopra per il pre-corsa, finché il fronte migrazione raggiunge il fondo del gel (circa 40 min). </li></ol> 5. Immunoblot analisi di IRF3 specie <ol><li> Preparare il buffer di trasferimento contenente 25 mM Tris-Base e 192 mM glicina in DDH 2 O. Refrigerare il buffer di trasferimento a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Wet tre pezzi di membrana di nitrocellulosa tagliato a dimensioni leggermente più grandi dei gel in una scatola di plastica / vetro contenente il buffer di trasferimento. Indicare l&#39;orientamento della membrana tagliando un angolo. Il buffer di trasferimento può essere riutilizzata per 3 volte. Conservare il tampone a 4 ° C tra usi. </li><li> Non convertito i gel (SDS-PAGE e nativo-PAGE) e tagliare un angolo di ogni gel per l&#39;orientamento corretto. <ol><li> Per nativo-PAGE, incubare il gel a RT in agitazione per almeno 30 min nel buffer SDS-PAGE corrente per eliminare la DOC prima del trasferimento al buffer di trasferimento. </li></ol></li><li> Incubare i gel (SDS-PAGE e nativo-PAGE) nel buffer di trasferimento per 5 - 10 minuti. </li><li> Montare un panino trasferimento al gel in una cassetta di trasferimento con la membrana verso l&#39;elettrodo positivo (carta pad / filtro antipolline / membrana / gel / carta da filtro / tappetino in gomma). Fate attenzione a rimuovere tutte le bolle tra gli strati del sandwich. </li><li> Eseguire il trasferimento come consigliato by il produttore per il dispositivo di trasferimento utilizzato. NOTA: Eseguire tutte le incubazioni e lavaggi nei prossimi passi su una piattaforma di scuotimento a dondolo o orbitale. </li><li> Al termine del tempo di trasferimento, incubare le membrane per 15 min in soluzione di fissaggio contenenti acido acetico 7%, 40% etanolo e 3% glicerolo in DDH 2 O. Lavare le membrane 3x 5 minuti in PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10,2 mm Na 2 HPO 4 e 1,8 mm KH 2 PO 4 in dH 2 O). Attenzione! L&#39;acido acetico è tossico, irritante e infiammabile. Indossare guanti protettivi e manipolare sotto la cappa. NOTA: La soluzione di fissaggio può essere riutilizzato più volte. </li><li> Per la membrana nativo-PAGE passare direttamente al punto 5.11. </li><li> Risciacquare le tre membrane SDS-PAGE rapidamente in dH 2 O prima incubazione per 1 min in soluzione contenente 6,57 ponceau rosso mM ponceau rosso e 1% di acido acetico in DDH 2 O. NOTA: La soluzione ponceau rosso può essere r<html> eused più volte. </li><li> Sciacquare le membrane in dH 2 O fino a quando lo sfondo è bianco abbastanza per vedere le bande di proteine ​​colorate in rosso. Nota i marcatori con una matita e tagliare la membrana in eccesso intorno alle proteine. Decolorare le membrane di incubazione per 5 min in PBS sotto agitazione. </li><li> Incubare le membrane per 1 ora a RT o O / N a 4 ° C in soluzione di bloccaggio (PBS contenente 0,05% di Tween 20 e latte in polvere 5% non grasso (PBS-T-latte). Lavare le membrane 3x 5 min in PBS-T. NOTA: Il lavaggio PBS-T è facoltativo e solo strettamente necessario quando si applica anticorpi diluiti in PBS-T contenente il 5% di albumina di siero bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 e Tabella 1) nel passaggio successivo. </li><li> Incubare le quattro membrane (da SDS-PAGE e nativo-PAGE) con gli anticorpi primari secondo l&#39;ordine sequenziale descritto nella figura 1 e nella tabella 1. Eseguire 5x 5 min lavaggi in PBS-T. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> Figura 1. Sequenza di analisi immunoblot. Lo schema descrive le singole SDS-PAGE e nativo-PAGE gel necessari per rilevare le varie forme fosforilate e monomeriche / dimerica IRF3. L&#39;ordine specifico di anticorpi applicate alla membrana risultante da ogni gel nella procedura immunoblot è descritta. Si noti che gli anticorpi anti-actina sono utilizzati prima di garantire parità di caricamento dei campioni prima applicare altri anticorpi specifici. La sequenza alternata, con anticorpi anti-actina applicata dopo gli anticorpi anti-fosfo-IRF3, funziona anche. Spogliarello viene utilizzato tra anti-actina e anticorpi anti-Sev, o tra anti-fosfo-IRF3 e gli anticorpi anti-IRF3 a causa delle dimensioni dei segnali di sovrapposizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gli anticorpi primari </td><td> Diluizione </td><td> Tampone di diluizione </td><td> Incubazione </td><td> Anticorpi secondari </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Anti-actina </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 15 min a temperatura ambiente </td><td> Anti-topo </td><td> Utilizzare dopo SDS-PAGE Antibodyies diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td> Anti-coniglio </td><td> Utilizzare dopo Native-PAGE. Si raccomanda di non riutilizzare l&#39;anticorpo diluito </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td&gt; anti-coniglio </td><td> Utilizzare dopo SDS-PAGE. Si raccomanda di non riutilizzare il diluito anticorpi anti-IRF3-P-396 è disponibile da Cell Signaling anche. Diluizione ottimale è stata definita come 1 / 1.000 per questo anticorpo, ma può variare tra i lotti. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td> Anti-coniglio </td><td> Utilizzare dopo SDS-PAGE. Si raccomanda di non riutilizzare l&#39;anticorpo diluito </td></tr><tr><td> Anti-IRF3 lunghezza </td><td> 1 / 7.500 </td><td> PBS-T latte </td><td> 3 ore a temperatura ambiente </td><td> Anti-coniglio </td><td> Utilizzare dopo SDS-PAGE. Anti-IRF3 anticorpo piena lunghezza può essere utilizzato dopo nativo-PAGE, ma è meno sensibile per rilevare il monomero. Anticorpi diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-NES </td><td> 0,5 mg / ml </td><td> PBS-T latte </td><td> 3 ore a temperatura ambiente </td><td> Anti-coniglio </td><td> Utilizzare dopo Native-PAGE. Antibodyies diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. </td></tr><tr><td> Anti-SeV </td><td> 1 / 14.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 3 ore a temperatura ambiente </td><td> Anti-coniglio </td><td> Utilizzare dopo SDS-PAGE. Antibodyies diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservato a 4 ° C in presenza di 0,02% di sodio azide. </td></tr><tr><td colspan="6"> NOTA: diluizione e buffer utilizzato per anticorpi secondari HRP-accoppiati devono essere ottimizzati in quanto varia da una compagnia all&#39;altra. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Specifiche di anticorpi utilizzati nella Procedura Immunoblotting. <ol start="13"><li> Incubare le membrane con la perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpi secondari come specificato nella figura 1 e nella tabella 1. Lavare le membrane 5x 5 min in PBS-T, seguito da 2x 5 min in PBS per rimuovere completamente le tracce di Tween. </li><li> Incubare le membrane per 1 min in un volume di reagente chemiluminescenza potenziata sufficiente a coprire completamente le membrane. Essiccare le membrane con carta da filtro. </li><li> Collocare le membrane in un analizzatore di immagini luminescenti per visualizzare le bande immunoreattive. <ol><li> In alternativa, effettuare il rilevamento di bande immunoreattive utilizzando radiografie sensibili. </li></ol></li><li> Lavare le membrane 3x 5 minuti in PBS. NOTA: A questo punto le membrane possono essere mantenuti asciutti. Tuttavia, se è necessario un ulteriore strippaggio, è preferibile eseguire la spellatura prima di asciugare la membrana. Le membrane possono anche essere memorizzati per breve termine in PBS. </li><li> Per le membrane che non richiedono strippaggio tra incubazione con anticorpi (vedi Figura 1) passare direttamente al punto5.20. </li><li> Quando è richiesto strippaggio tra anticorpi (vedi Figura 1), incubare le membrane in soluzione preriscaldata strippaggio contenente 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) e 0,7% β-mercaptoetanolo in DDH 2 O a 50 ° C per 20 minuti in agitazione regolare. Lavare le membrane 3x 5 minuti in PBS. NOTA: Agitazione durante la procedura di stripping è la chiave. Spelatura può essere eseguita in un fornetto. In alternativa, lo strippaggio può essere eseguita utilizzando membrane sigillate in sacchetti di plastica e immersi in un bagno d&#39;acqua. In questo caso, è importante per agitare le membrane 4 - 5 volte durante l&#39;incubazione. </li><li> Incubare le membrane per 1 ora a RT o O / N a 4 ° C in PBS-T-latte. </li><li> Ripetere i passaggi 5,12-5,16 di figura 1. </li></ol>

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<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo che descriviamo qui costituito da una combinazione di alta risoluzione SDS-PAGE e native-PAGE accoppiato all&#39;utilizzo di diversi anticorpi phosphospecific distinguere il monomero / dimero e phosphoforms I-IV di IRF3. Rilevazione adeguata di queste specie IRF3 è essenziale per caratterizzare completamente attivazione IRF3 in un ambiente specifico. Per esempio, LPS stimolazione dei macrofagi attivati ​​porta alla formazione di dimerica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilata che presenta un ipofosforilata (modulo...

<html> Il fattore di trascrizione ubiquitariamente e costitutivamente espresso Interferone (IFN) Fattore di regolamentazione 3 (IRF3) è fondamentale per la prima linea di difesa contro i patogeni principalmente attraverso l&#39;induzione di Interferone beta, ma anche attraverso l&#39;induzione della chemochina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e diverse proteine ​​antivirali tra cui proteine ​​IFN-indotta con tetratricopeptide ripete IFIT1 / 2/3 1-3. Attivazione IRF3 è stata riportata a seguito dell&#39;infezione da numerosi virus, o l&#39;esposizione ad acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o lipopolisaccaride (LPS) 4. È importante sottolineare che i virus più studiati sono evoluti meccanismi per eludere la risposta IRF3-mediata, e quindi sfuggire l&#39;host difesa immunitaria innata 5. Pertanto, il monitoraggio di attivazione IRF3 è di grande importanza per comprendere i meccanismi molecolari del innata difesa ospite antivirale, ma anche di individuare la strategia utilizzata dai virus per contrastare questa risposta. ent &quot;&gt; Molti rapporti pubblicati però fornire solo un&#39;analisi limitata di attivazione IRF3 eseguito dal monitoraggio dell&#39;induzione gene IRF3-bersaglio (IFNB1 e IFIT1) e / o luciferasi giornalista test gene accoppiato a bassa risoluzione di sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS PAGE) analisi delle IRF3. Tuttavia, numerosi studi biochimici, analisi del comportamento dei vari mutanti IRF3 e delucidazione struttura cristallina IRF3 6-11 hanno contribuito a stabilire che IRF3 è sottoposto ad una serie complessa di sequenziali modificazioni post-traduzionali dalla fosforilazione a più siti. L&#39;insieme di fosforilazione coinvolti nell&#39;attivazione IRF3 sembra essere dipendente dalla stimolo e più probabile del tipo di cellula. In cellule non infettate, IRF3 coesiste come specie non fosforilata e ipofosforilata contenente phosphoresidues, tra Thr135 e Ser173, in 1 -198 aa regione N-terminale 6,12-14. L&#39;accumulo di questo ipofosforilata form di IRF3 è indotta da induttori di stress, fattori di crescita e che danneggiano il DNA agenti 6. La fosforilazione di residui Ser / Thr alla regione C-terminale della IRF3 contenente il dominio di transattivazione viene attivato dopo l&#39;attivazione da parte di virus, poli I: C o LPS in un tipo cellulare dipendente manner 15-17. C-terminale fosforilazione di IRF3 coinvolge non meno di 7 siti phosphoacceptor distinte organizzate in due gruppi principali, Ser385 / Ser386 e Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, che ogni contribuiscono all&#39;attivazione IRF3 attraverso dimerizzazione, nucleare accumulazione, l&#39;associazione con il CREB proteine ​​-binding (CBP) / coattivatori p300, legame con IFN risposta elemento sensibile (ISRE) sequenze consenso e transattivazione di geni bersaglio 9,10,17-19 DNA. La fosforilazione di Thr390 è anche pensato per contribuire alla virale IRF3 attivazione 20. Spettrometria di massa analisi dei IRF3 hanno dimostrato che Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 residui sono direttamente phosphorylatcato per l&#39;inibitore di chinasi kB ε (IKKε) / TANK-binding chinasi 1 (TBK1) chinasi 9,10. È anche necessario fosforilazione ai residui C-terminale per la terminazione di attivazione IRF3 attraverso polyubiquitination e proteasoma-mediata degradazione 10. Questo processo è anche dipendente dalla fosforilazione in Ser339, che è necessaria per l&#39;assunzione della isomerasi Pin1 propile 10,11. Specie IRF3 contenenti almeno fosfo-Ser339 / 386/396 residui sono considerati forme iperfosforilata. L&#39;esatta sequenza e la funzione di ogni sito rimane una questione di discussione 10,21. E &#39;ormai chiaro che IRF3 attivato non rappresenta uno stato omogeneo, ma che diverse specie che presentano caratteristiche di fosforilazione attivati ​​o dimerizzazione distinti esiste 10,22. Per fornire una comprensione completa di attivazione IRF3 in risposta a patogeni specifici, è quindi necessario characterize che delle specie attivati ​​sono indotti. Induzione di geni bersaglio IRF3, IFNB1 e IFIT1, ha dimostrato di fornire una lettura-out affidabile per l&#39;attivazione IRF3. Tuttavia, il monitoraggio espressione di questi geni non fa distinzioni tra i diversi stati di attivazione del IRF3. Un&#39;analisi completa di stati di attivazione IRF3 in un ambiente particolare si basa sulla caratterizzazione dettagliata della sua fosforilazione e dimerization stato di 10. Fosforilata (modulo I), ipofosforilata (modulo II) e iperfosforilata (forme III e IV) forme IRF3 6,18,23 può essere risolto con successo dalla mobilità ridotta ad alta risoluzione analisi SDS-PAGE. Specie IRF3 monomeri e dimeri possono essere efficacemente identificati con analisi nativo-PAGE. Questi approcci sono notevolmente migliorate quando usato in combinazione con gli anticorpi diretti contro phosphospecific siti IRF3 phosphoacceptor distinte. Protocolli standard consentono una scarsa risoluzione diproteine ​​che non consentono la separazione efficiente di IRF3 distinte forme fosforilate. Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per realizzare la massima risoluzione per monitorare l&#39;induzione di distinte specie IRF3 virus attivato mediante SDS-PAGE accoppiato ad nativo-PAGE in combinazione con immunoblot utilizzando anticorpi totali e phosphospecific. In vivo discriminazione tra i diversi attivato forme di IRF3 viene eseguita sulla base dei loro spostamenti mobilità osservati su SDS-PAGE. Inoltre, IRF3 monomero e dimero si distinguono per elettroforesi non denaturante. La combinazione di queste due tecniche complementari con immunoblot dimostra di essere un approccio accessibile e sensibile per acquisire tutte le informazioni necessarie per una completa analisi di attivazione fosforilazione mediata di IRF3.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Caldo in un 37 gradi C bagno prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Virus Sendai Ceppo Cantell</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Bioshop</td><td></td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Tagliare l'estremità del puntale e pipettare lentamente poiché è molto denso.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Marchio registrato corrispondente a Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergente</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td></td><td>Bioshop LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Attivazione dell'ortovanadato di sodio 0,2 M : 1) Regolare il pH a 10,0 utilizzando 1 N NaOH o 1 N HCl. Il pH iniziale della soluzione di ortotovanadato di sodio può variare con molte sostanze chimiche. 2) La soluzione è gialla a pH 10,0. 3) Far bollire fino a quando non diventa incolore. 5) Regolare il pH a 10,0 e ripetere i passaggi 3-4 fino a quando la soluzione rimane incolore e si stabilizza a 10,0. Conservare le aliquote di ortovanadato di sodio attivato a -20 °C.</td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato sale disodico esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per il dosaggio delle proteine Bio-Rad&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>citotossico</td></tr><tr><td>acrilammide/bis-acrilammide (37,5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>citotossico</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>Lavorare sotto cappa aspirante. Tossico e irritante.</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>Irritante.</td></tr><tr><td>Amonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Tossico e irritante.</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Lavoro sotto cappa aspirante. Tossico per il sistema nervoso, le mucose. Può essere tossico per le vie respiratorie superiori, gli occhi, il sistema nervoso centrale.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>Irritante.</td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa (0,45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>Lavoro sotto cappa aspirante. Tossico, irritante e infiammabile.</td></tr><tr><td>Ponceau rosso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp;</td><td>Per la composizione di PBS per immunoblot.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>Per la composizione PBS per immunoblot.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp;</td><td>Per la composizione di PBS per immunoblot.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>per PBS-T-BSA composizione per immunoblot.</td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Garofano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals 103168</td><td></td><td>Tagliare l'estremità della punta e pipettare lentamente poiché è molto densa.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Negozio aliquotato a -20 oC. Evitare il congelamento/disgelo.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Home made19</td><td></td><td>Store aliquotato a -80 oC. Evitare il congelamento/disgelo.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>4947s</td><td>Conservare a -20 oC.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Home made15</td><td></td><td>Store aliquotato a -80 oC. Evitare il congelamento/disgelo.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-full length</td><td>Actif motif</td><td>39033</td><td>Conservare aliquotato a -80 oC. Evitare il congelamento/disgelo.</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Negozio aliquotato a -20 oC.</td></tr><tr><td>Reagente per chemiluminescenza Western Lightning Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini CCD Apparecchio per telecamere</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Standard di peso molecolare, ampia gamma</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Conservare aliquotato a -20 oC.</td></tr></tbody></table>

a high resolution metodo per monitorare l&#39;attivazione fosforilazione-dipendente di irf3

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Il fattore di trascrizione IRF3 è fondamentale per la prima linea di difesa contro i patogeni, principalmente attraverso l'interferone β e l'espressione genica antivirale. Un'analisi dettagliata dell'attivazione di IRF3 è essenziale per capire come i patogeni inducono o eludono la risposta antivirale innata. Forme attivate distinte di IRF3 possono essere distinte in base alla loro fosforilazione e allo stato di monomero rispetto al dimero. La discriminazione in vivo tra le diverse specie attivate di IRF3 può essere ottenuta attraverso la separazione di forme fosforilate di IRF3 in base ai loro spostamenti di mobilità su SDS-PAGE. Inoltre, i livelli del monomero e del dimero IRF3 possono essere monitorati utilizzando l'elettroforesi non denaturante. Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per raggiungere la massima risoluzione per ottenere il maggior numero di informazioni sullo stato di attivazione dell'IRF3. Ciò si ottiene attraverso la combinazione di una SDS-PAGE ad alta risoluzione e di una PAGE nativa accoppiata a immunoblot utilizzando più anticorpi totali e fosfospecifici. Questa strategia sperimentale costituisce un approccio economico e sensibile per acquisire tutte le informazioni necessarie per un'analisi completa dell'attivazione mediata dalla fosforilazione di IRF3.

La figura 2 mostra una tipica immagine immunoblot di IRF3 rilevato con IRF3 totale anticorpi e anticorpi IRF3-phosphospecific contro Ser396 e Ser398 dopo la risoluzione di WCE da ad alta risoluzione SDS-PAGE. Nelle cellule A549 stimolate, IRF3 viene rilevato come due bande a 50 e 53 kDa in SDS-PAGE corrispondente alla non fosforilata (modulo I) e il ipofosforilata (modulo II) specie di IRF3. L&#39;esposizione delle cellule A549 di Sev per 3 - 9 risultati hr in uno sposta...

Qui descriviamo una procedura che permette un'analisi dettagliata dell'attivazione dipendente dalla fosforilazione del fattore di trascrizione IRF3. Ciò si ottiene attraverso la combinazione di una SDS-PAGE ad alta risoluzione e di una PAGE nativa accoppiata a immunoblot utilizzando più anticorpi fosfospecifici.

A High Resolution metodo per monitorare l&#39;attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire un'analisi dettagliata dell'attivazione dipendente dalla fosforilazione del fattore di trascrizione IRF3. Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti l'interferone che media la risposta immunitaria innata. Ad esempio, un agente patogeno attiva o invade l'espressione dell'interferone beta dipendente da IRF3.Il vantaggio principale di questa tecnica è che costituisce un approccio economico e sensibile per distinguere le diverse forme attivate da IRF3 che possono insorgere a seguito di diverse stimolazioni. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sull'infezione virale delle cellule umane, può essere applicato anche a tessuti di topo o umani soggetti ad altri agenti patogeni o modelli molecolari associati a patogeni. A dimostrare la procedura saranno Alexa Robitaille e Melissa Mariani, due esperte di Simulink cellulare del mio laboratorio.Le cellule A549 utilizzate in questa procedura sono mantenute in coltura in una piastra di 15 centimetri a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un terreno F-12K Ham completo. Ventiquattro ore prima dell'infezione, tripsinizzare le cellule come descritto nel testo del protocollo e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare a 350 x G per tre minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cella in otto millilitri di terreno F-12K Ham completo per ottenere una sospensione omogenea a singola cellula. Dopo aver contato le cellule utilizzando un emoctiometro, seminare le cellule a una densità di una volta la decima alla sesta cella per piastra da 60 millimetri e quattro millilitri di terreno F-12K Ham completo preriscaldato. Incubare per 20-24 ore a 37 gradi Celsius, cinque percento di anidride carbonica.Dopo 20-24 ore le cellule dovrebbero formare un monostrato confluente al 90%. Rimuovere il terreno e lavare le cellule con due millilitri di terreno F-12K Ham senza siero, o SFM. Aggiungere due millilitri di SFM fresco per piastra da 60 millimetri.Diluire in aliquote scongelate del virus Sendai in SFM preriscaldato per ottenere 60 unità di emoagglutinazione, o HAU, per 100 microlitri. Mescolare pipettando delicatamente su e giù, quindi aggiungere 100 microlitri di virus diluito goccia a goccia in ciascuna piastra per eseguire l'infezione a 40 HAU per 10 fino alla sesta cellula. Non aggiungere virus nella piastra di controllo non infetta.Incubare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius, cinque per cento di anidride carbonica. Durante la prima ora di infezione, agitare le piastre a mano tre o quattro volte. A due ore dall'infezione, aggiungere due millilitri di F-12K Ham medium contenente il 20% di calore e FDS attivato, per ottenere una concentrazione finale del 10% di calore e FDS attivato.Incubare le cellule nell'incubatore per una, quattro e sette ore per raggiungere tempi di infezione totali rispettivamente di tre, sei e nove ore. Le cellule verranno raccolte in ciascuno di questi punti temporali per la preparazione di estratti di cellule intere, come dimostrato nel prossimo segmento video. Iniziare questa procedura rimuovendo il mezzo di infezione.Raccogli le cellule raschiando un millilitro di DPBS ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga pre-raffreddata da 1,5 millilitri. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 16.000 x g a 4 gradi Celsius per 20 secondi.E decantare accuratamente tutte le tracce di DPBS. Risospendere il pellet cellulare in 70 microlitri di tampone di lisi. Incubare su ghiaccio per 20 minuti.Congelare il lisato mediante incubazione in un bagno di azoto liquido per 15 secondi. Quindi scongelare il lisato a temperatura ambiente fino a quando non si sarà completamente sciolto. Vortice per dieci secondi.Ripeti questo ciclo di congelamento-disgelo-vortice tre volte. Centrifugare a 16.000 x g a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Trasferire il surnatante, che è l'estratto dell'intera cellula, in una nuova provetta da centrifuga pre-raffreddata da 1,5 millilitri.È importante mantenere sempre gli estratti di cellule intere sul ghiaccio. Per risolvere gli estratti di cellule intere mediante SDS-PAGE ad alta risoluzione, preparare tre gel per elettroforesi denaturanti, due gel da 16 centimetri per la rilevazione di forme IRF3 e un gel da 8,5 centimetri per la rilevazione delle proteine del virus Sendai. Caricare 14 microlitri di peso molecolare standard in un pozzetto di ogni gel da 16 centimetri.Successivamente, caricare 30 microgrammi di estratto di cellule intere denaturate per pozzetto dei due gel da 16 centimetri. Caricare sette microlitri di peso molecolare standard in un pozzetto del gel da 8,5 centimetri. Caricare da otto a dieci microgrammi di estratto di cellule intere denaturate per pozzetto del gel da 8,5 centimetri.Far funzionare i gel a 30 milliampere di corrente costante fino a quando il fronte di migrazione raggiunge il fondo del gel. La migrazione dura tecnicamente circa tre ore per un gel di 16 centimetri e 45 minuti per un gel di 8,5 centimetri. Iniziare questa analisi preparando un gel risolutivo non denaturante di lunghezza minima di 8,5 centimetri, seguendo la procedura nel testo del protocollo.Premere l'apparecchio in funzione nel ghiaccio approssimativamente al livello del tampone per elettroforesi della camera inferiore, ma assicurarsi che il gel non sia nel ghiaccio. Pre-eseguire il gel a 40 milliampere di corrente costante per 30 minuti sul ghiaccio. Durante la pre-corsa, mescolare uno a uno gli estratti di cellule intere mantenuti in ghiaccio con il tampone di caricamento Two-X Native-PAGE.Immediatamente alla fine della pre-corsa, caricare da otto a dieci microgrammi di estratto di cellule intere sul gel. È importante caricare i campioni vicino al fondo del pozzetto in modo che le bande non vengano disturbate. Far funzionare il gel a 25 milliampere di corrente costante sul ghiaccio, come dimostrato per la pre-corsa, fino a quando il fronte di migrazione raggiunge il fondo del gel.Ci vorranno circa 40 minuti. Al termine di tutte le corse di gel, le proteine vengono trasferite alle membrane di nitrocellulosa e fissate. La procedura di trasferimento è descritta nel testo del protocollo allegato.Le tre membrane SDS-PAGE, ma non la membrana Native-PAGE, sono colorate con una soluzione rossa di Ponceau per identificare i marcatori di peso molecolare. Dopo aver incubato tutte e quattro le membrane da SDS-PAGE e Native-PAGE in soluzione bloccante, incubare le membrane con gli anticorpi primari secondo l'ordine sequenziale mostrato in questo diagramma. Le membrane devono essere sottoposte a cinque lavaggi di cinque minuti in PBS-T prima dell'incubazione con gli appropriati anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano.Dopo aver rimosso le tracce di tween con PBS, incubare le membrane per un minuto nel volume di reagente chemiluminescenza potenziato sufficiente a coprire completamente le membrane. Utilizzare la carta da filtro per asciugare le membrane e quindi posizionarle nell'analizzatore di immagini luminescenti per visualizzare le bande immunoreattive. Prima dell'incubazione con gli anticorpi primari successivi, lavare le membrane tre volte in PBS per cinque minuti ogni volta.Quando è necessario lo stripping tra gli anticorpi, incubare le membrane in una soluzione di stripping preriscaldata a 50 gradi Celsius per 20 minuti con agitazione regolare. I dettagli dell'analisi immunoblot sono disponibili nel testo del protocollo allegato. Di seguito è mostrata una tipica immagine immunoblot di IRF3 rilevata con anticorpi totali IRF3 e anticorpi fosfospecifici IRF3 contro Ser396 e Ser398, dopo l'alta risoluzione di estratti di cellule intere.Nelle cellule non stimolate, IRF3 viene rilevato come due bande corrispondenti alle specie non fosforilate e ipofosforilate di IRF3. L'esposizione delle cellule al virus Sendai si traduce in un passaggio dipendente dal tempo alle forme iperfosforilate a migrazione lenta tre e quattro, che sono anche specificamente immunorilevate utilizzando gli anticorpi fosfospecifici contro Ser396 e Ser398. La figura seguente mostra un profilo di rilevazione di IRF3 ottenuto da estratti di cellule intere risolte da PAGE nativo, seguito da immunoblot utilizzando anticorpi NES anti-IRF3 e anticorpi fosfospecifici contro Ser386.Nelle cellule non stimolate IRF3 viene rilevato come una singola banda corrispondente alla forma momomerica. Dopo l'infezione con il virus Sendai i livelli di monomero IRF3 diminuiscono con un concomitante accumulo di una banda a migrazione lenta che corrisponde alla forma dimera di IRF3, che è anche specificamente immunorilevata utilizzando anticorpi fosfospecifici contro Ser386. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la composizione e la lunghezza dei diversi gel sono fondamentali per ottenere una risoluzione appropriata dei fosfoformi IRF3.Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il legame al DNA o gli acidi reporter genici per valutare l'attività di IRF3. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come distinguere le diverse forme attive di IRF3. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni può essere pericoloso e le manipolazioni devono essere eseguite in conformità con le linee guida sulla biosicurezza dell'istituto ospitante.

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