Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi
23 marzo 2016
Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare nell'occhio murino che provoca la perdita di cellule gangliari retiniche come osservato nel glaucoma. microsfere magnetiche vengono iniettati nella camera anteriore e attratti l'angolo iridocorneale utilizzando un magnete per bloccare il deflusso dell'umore acqueo.
L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è indurre un glaucoma dipendente dall'ipertensione oculare mediante l'iniezione di microsferette magnetiche nella camera anteriore dell'occhio del topo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del glaucoma, ad esempio quali cambiamenti patologici precoci si verificano nell'occhio prima della morte evidente delle cellule gangliari retiniche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di aumentare in modo affidabile la pressione intraoculare, provocando al contempo un danno minimo all'occhio durante l'intervento.
Le persone alle prime armi con questo metodo avranno difficoltà a perforare la cornea durante l'iniezione e potrebbero danneggiare strutture adiacenti, come il cristallino, a causa di un microago non correttamente preparato o di un posizionamento errato del microago. Per iniziare, utilizzare un estrattore per capillari per ottenere un microago da una capillare di vetro borosilicato. Sotto microscopio, utilizzare una lama affilata per creare con attenzione un'apertura alla punta del microago, in modo che questa presenti una forma ellittica con un diametro dell'asse maggiore e dell'asse minore rispettivamente di circa 190 micrometri e 70 micrometri.
Nel sistema di smussatura per micropipetta, posizionare la micro-ago a un angolo di 20 gradi rispetto alla piastra di smussatura, in modo che l'apertura della micro-ago tocchi la piastra. Smussare per circa 10 minuti utilizzando gocce d'acqua finché i bordi non diventano piatti e lisci. Successivamente, ruotare l'ago per smussare i due bordi intorno all'apertura finché la punta della micro-ago non diventa affilata.
Quindi, con un soffiatore ad aerosol, rimuovere tutti i detriti e l'acqua dall'apertura della punta della microagocciatura. Esaminare attentamente la microagocciatura finita al microscopio. Scartare le microagocciature con fratture.
La seguente procedura richiede due persone per essere completata. Quando un'azione specifica deve essere eseguita da una persona specifica, la persona che deve compiere l'azione sarà indicata come "Persona 1" o "Persona 2". Preparare la soluzione di microsfere magnetiche seguendo il protocollo indicato. Per misurare la pressione intraoculare di base, o IOP, in un topo sveglio, immobilizzare delicatamente il topo tenendo la pelle tra le orecchie.
Posizionare il topo sul piano del bancone in modo che l'animale sia comodo e gli occhi siano accessibili. Applicare una goccia di cloridrato di proparcaina sulla cornea, quindi mantenere il tonometro perpendicolare alla superficie corneale ed effettuare almeno tre serie di 10 letture consecutive per ogni occhio per ottenere una media della pressione intraoculare (IOP). Successivamente, dopo aver anestetizzato il topo secondo il protocollo descritto nel testo, somministrare 0,05 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di buprenorfina per via sottocutanea.
Quindi trattare l'occhio con un collirio a base di tropicamide per indurre la dilatazione della pupilla, facilitando la visualizzazione della posizione della micro-ago durante l'iniezione. Applicare un unguento topico sull'occhio controlaterale per prevenire l'essiccazione della cornea durante la procedura. Ora, fissare un microago sterile all'insieme di iniezione della pompa micro-siringa.
Quindi trasferire il topo anestetizzato sulla piattaforma operatoria. Sotto il microscopio, la Persona 1 deve accertarsi che la pupilla sia completamente dilatata e che i muscoli oculari siano rilassati, in modo da evitare movimenti dell'occhio e garantire stabilità durante l'intervento. Utilizzare tamponi assorbenti per rimuovere delicatamente le gocce oculari di tropicamide dall'occhio.
Fare mescolare la soluzione di microsferette magnetiche a pipetta su e giù alla persona 2. Quindi, utilizzando la pompa a microsiringa, caricare la micro-ago con 1,5 microlitri della soluzione omogeneizzata di microsferette magnetiche. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sulla punta della micro-ago.
Posizionare il più rapidamente possibile l'ago a un angolo di 45 gradi in direzione anteriore, rispetto al limbo. La Persona 1 deve utilizzare la pinzetta di plastica per sostenere l'occhio, mantenendo un angolo di circa 90 gradi tra l'ago microscopico e la pinzetta di plastica. Utilizzando la pompa per micro-siringa, la Persona 2 deve perforare delicatamente la cornea con l'ago microscopico caricato, in modo che la punta dell'ago microscopico entri nella camera anteriore evitando il cristallino, l'iride e la camera posteriore.
Senza muovere la testa del mouse, la Persona 1 posizioni l'ago accanto all'occhio opposto alla punta dell'ago. Per attrarre le microsfere magnetiche nella camera anteriore e ridurre al minimo il contatto delle microsfere con la superficie interna della cornea. Mentre la Persona 1 continua a tenere il magnete, la Persona 2 utilizzi la pompa della micro-siringa per iniettare 1,5 µL della soluzione di microsfere magnetiche nella camera anteriore in un periodo di tempo compreso tra 15 e 30 secondi.
Una volta iniettato l'intero volume di perline, estrarre lentamente l'ago microscopico dall'occhio. Per evitare il reflusso delle microperline, far sì che la Persona 1 continui a tenere il magnete accanto all'occhio per ulteriori 30-60 secondi, in modo da attirare le perline nella camera anteriore. Successivamente, utilizzare il magnete per attirare le perline verso l'angolo iridocorneale, evitando di farle aderire alla superficie interna della cornea, dove potrebbero rimanere attaccate.
Assicurarsi che le perle formino un anello uniformemente distribuito lungo la circonferenza della camera anteriore. Successivamente, trattare l'occhio operato con un collirio antibiotico per ridurre al minimo il rischio di infezione. Lasciare che il topo si riprenda su un tappetino riscaldante finché non sia completamente sveglio, con l'occhio operato rivolto verso l'alto per prevenire infezioni e l'accumulo di perle sulla superficie interna della cornea.
Dopo almeno due giorni di recupero, misurare la PIO come mostrato in precedenza nel video e monitorarla almeno una volta alla settimana o più frequentemente se necessario, sempre alla stessa ora del giorno. Analizzare i risultati secondo il protocollo descritto nel testo. L'iniezione di microsferette magnetiche nella camera anteriore di topi adulti descritta in questo protocollo ha determinato un aumento robusto e riproducibile della PIO.
Come mostrato qui, una settimana dopo l'intervento, la pressione intraoculare (IOP) è aumentata da un valore basale medio di 10, più o meno 0,6 millimetri di mercurio, a 19, più o meno 0,5 millimetri di mercurio negli occhi ipertesi. Questa tabella mostra che successivamente la IOP si è stabilizzata, mantenendosi elevata con un valore medio di 20 millimetri di mercurio per almeno sei settimane, il punto temporale più lungo esaminato in questo studio. L'aumento medio massimo della IOP negli occhi iniettati con microsfere, a due, tre e sei settimane dopo l'intervento chirurgico, è stato di 25 millimetri di mercurio.
Per valutare la perdita delle cellule gangliari retiniche, o RGC, il numero di cellule positive per BRN-3A è stato quantificato su preparati a whole mount di retina a una, due, tre e sei settimane dall'induzione dell'ipertensione oculare. Sebbene un aumento significativo della pressione intraoculare (IOP) sia stato rilevato già alla prima settimana, nessuna perdita significativa dei corpi cellulari delle RGC è stata osservata nelle prime due settimane. Tuttavia, è stata osservata una morte cellulare significativa a tre e sei settimane dall'intervento.
In questa figura, le sezioni trasversali del nervo ottico colorate con blu di toluidina mostrano una significativa perdita di assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) a tre e a sei settimane rispetto ai nervi ottici integri, indicando che questo intervento provoca una perdita assonale, come osservato nel glaucoma. Una volta acquisita padronanza, l'iniezione in un topo può essere eseguita in 15 minuti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale adottare le opportune misure per garantire che lo stesso numero di microperle venga iniettato nella camera anteriore.
Questo ridurrà la variabilità che può verificarsi tra gli animali. Dopo aver visto il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre ipertensione oculare iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore degli occhi del topo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per indurre ipertensione oculare negli occhi di topi, simulando le condizioni del glaucoma mediante iniezione di microsfere magnetiche. Il metodo consente lo studio delle alterazioni patologiche precoci prima della morte delle cellule gangliari retiniche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Oftalmologia
- Ricerca sul glaucoma
Sfondo
- L'ipertensione oculare è un fattore di rischio significativo per il glaucoma.
- Comprendere i meccanismi che portano alla perdita delle cellule gangliari retiniche è fondamentale.
- I metodi attuali per indurre l'ipertensione oculare potrebbero non fornire risultati affidabili.
- Questo protocollo mira a creare un modello riproducibile per la ricerca sul glaucoma.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per indurre ipertensione oculare nei topi.
- Studiare i cambiamenti precoci dell'occhio associati al glaucoma.
- Favorire la ricerca su possibili interventi terapeutici.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio.
- Misurazione della pressione intraoculare (IOP) mediante tonometro.
- Uso di anestesia e dilatazione della pupilla per un posizionamento preciso dell'ago microscopico.
- Monitoraggio della IOP nel tempo per valutare la stabilità del modello.
Risultati principali
- L'induzione di ipertensione oculare ha determinato un aumento significativo della pressione intraoculare (IOP).
- L'IOP è aumentata da un valore medio basale di 10 mmHg a 19 mmHg negli occhi ipertesi.
- L'IOP elevata è stata mantenuta per almeno sei settimane dopo l'intervento.
- Il metodo si è rivelato robusto e riproducibile per gli studi sul glaucoma.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un modello affidabile per lo studio del glaucoma.
- Permette ai ricercatori di esplorare i primi cambiamenti patologici nell'occhio.
- Il metodo può contribuire allo sviluppo di nuove terapie per il glaucoma.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello fornisce un metodo riproducibile per indurre ipertensione oculare nei topi, consentendo studi meccanicistici sulla fisiopatologia del glaucoma prima della perdita delle cellule gangliari retiniche. Supporta la validazione degli obiettivi permettendo un aumento controllato della pressione intraoculare per analizzare i percorsi neurodegenerativi. L'approccio migliora la fiducia predittiva nella ricerca preclinica sul glaucoma modellando un fattore di rischio chiave con una variabilità procedurale minima.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche inducendo un'ipertensione oculare controllata per studiare i primi cambiamenti patologici.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica attraverso un'induzione standardizzata e riproducibile dell'aumento della pressione intraoculare.
- Valore strategico: Favorisce la riduzione del rischio del bersaglio modellando un fattore di rischio chiave del glaucoma in un sistema rilevante per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati con un aumento stabile della pressione intraoculare per lo screening coerente di composti.
- Valore operativo: Garantisce la prontezza del saggio grazie a un danno corneale minimo e a un ridotto reflusso delle microsfere, migliorando l'affidabilità dei dati.
- Valore strategico: Facilita il riutilizzo della piattaforma in diversi studi grazie alla robustezza del modello e alla stabilità della pressione intraoculare per sei settimane.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra una continuità dall'induzione dell'ipertensione oculare alla perdita delle cellule gangliari retiniche e degli assoni, rispecchiando la progressione del glaucoma umano.
- Valore operativo: Permette decisioni di avanzamento basate sul rischio grazie a parametri quantificabili di pressione intraoculare e di estremi istopatologici nel tempo.
- Valore strategico: Favorisce l'allineamento traslazionale dei biomarcatori correlando l'aumento della pressione intraoculare alla perdita di cellule positive per BRN-3A e al danno del nervo ottico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino ai test di efficacia preclinica, grazie alla sua capacità di indurre e mantenere un'ipertensione oculare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo un aumento controllato della pressione intraoculare (IOP) per studiare le alterazioni glaucomatose precoci.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio grazie a un aumento riproducibile della IOP e a una riduzione degli artefatti procedurali.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative della IOP e parametri istopatologici (BRN-3A, sezioni del nervo ottico) per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega l'induzione della IOP alla perdita delle cellule gangliari retiniche (RGC) e alla degenerazione assonale, sostenendo la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile grazie alla preparazione standardizzata dei microaghi e al posizionamento guidato da magnete delle microsfere.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella patologia indotta dalla pressione intraoculare.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante l'uso di microlancette smussate e il trattenimento delle microsfere assistito da magneti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale modellando un fattore di rischio chiave del glaucoma con controllo temporale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per rischio grazie alla stabilità della pressione intraoculare a sei settimane e alle letture correlate di neurodegenerazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, microscopia e misurazione della pressione intraoculare (IOP) mediante tonometria.
- È dipendente da un estrattore capillare, una pompa per micro-siringa, un magnete manuale e un'unità sterile per microago.
- Necessita di una standardizzazione intersoggettiva della molatura del bevel del microago (angolo di 20 gradi) e del volume di iniezione delle microsfere (1,5 µL).
- Le considerazioni per l'adattamento includono la scalabilità del modello tra diverse linee di topi e i protocolli di anestesia.
- I limiti pratici comprendono la dipendenza dall'abilità tecnica per evitare danni alla cornea, il contatto con il cristallino e il reflusso delle microsfere durante l'iniezione.
