Name: Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Impara a isolare e caratterizzare le cellule immunitarie gengivali murine per studiare l'immunità orale e la patogenesi della parodontite. Questa tecnica consente analisi funzionali dettagliate in vitro.

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Gli autori sono stati finanziati in parte dal programma intramurale del NIDCR (N.M.M) e supportati da una Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B a J.E.K) e da una sovvenzione del Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research (a J.E.K). Gli autori ringraziano Teresa Wild per la revisione critica del manoscritto.

Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo seguite le linee guida necessarie e sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, NIDCR / NIH. 1. preparare in anticipo <ol><li> Preparare supporti Completa: RPMI integrato con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e il 10% FBS. </li><li> Preparare supporti DNase: 50 ml di media RPMI con 7,5 mcg DNasi (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento). </li><li> Preparare supporti Collagenasi-DNasi: 5 ml di media DNasi oltre 3,2 mg / ml di Collagenasi di tipo IV (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento). </li><li> Pre-cool tampone FACS: 0,5% FBS diluito in PBS. </li><li> centrifuga pre-raffreddare a 4 ° C. </li><li> Warm agitatore incubatore a 37 ° C. </li></ol> 2. Isolamento, Dissection, e l&#39;isolamento delle cellule da gengivali Blocks <ol><li> Euthanize topi esponendo loro di CO 2 in una camera adeguata, secondo le linee guida ARAC. </li> &lt;li&gt; Aprire la cavità toracica e addominale per esporre il cuore e gli organi interni. Per profumato, fare un&#39;incisione nella vena cava inferiore e profumato 3 ml di PBS attraverso il ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 3 ml con un ago 27 G. </li><li> Immobilizzare il corpo e la testa del mouse su un blocco con lo stomaco rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Tagliare ogni commessura del labbro verso il collo con le forbici, separando la pelle che copre la mandibola e collo regione, esponendo i tessuti sottostanti e muscoli. Sezionare il labbro inferiore per scoprire la mandibola. </li><li> Tagliare tra gli incisivi inferiori per separare entrambi i lati della mandibola e immobilizzare ogni lato per accedere alla cavità orale. </li><li> Visualizzare e sezionare il palato lontano dalla cavità nasale. </li><li> Sezionare aree utilizzando una lama di 10 e comprendono aree molari mascellari e mandibolari con circostante gengiva (Figura 1). Fare incisioni verticali appena anteriore al primo molare e posteriore per il terzo molare e una incisione orizzontaleil bordo della gengiva (colletto bianco del tessuto denti circostanti). </li><li> Posizionare il mascellare e mandibolare blocchi in un tubo da 50 ml con 5 ml Collagenasi / DNasi (tenere in ghiaccio). </li><li> Incubare in un incubatore shaker a 37 ° C per 1 ora e durante gli ultimi 5 min di incubazione aggiungere 50 ml di 0,5 M EDTA. </li><li> Aggiungere 5 ml di media DNasi freddo per il tubo da 50 ml con i tessuti e mescolare delicatamente per mescolare. </li><li> Trasferire i 4 blocchi di tessuto in una capsula di Petri e coprire con 500 ml di DNasi media. Rimuovere gengiva da ciascun blocco di tessuto, utilizzando un bisturi e indicando la lama nelle aree gengivali e interdentali. </li><li> Trasferire i tessuti e il supporto dalla capsula di Petri, nonché i mezzi di DNasi precedenti utilizzate durante la dissezione, in un tubo da 50 ml attraverso il filtro cella (70 micron dimensioni). Lavare con supporti DNasi (3-5 ml) tutti gli strumenti utilizzati e filtro. </li><li> Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 ml, schiacciare il tessuto contro il filtro,filtraggio con i media DNasi fredda (da 30 a 35 ml). </li><li> Lavare il filtro cella con i media DNasi freddo. </li><li> Centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 6 min. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere in 1 ml di completo media. </li><li> Contare le cellule (la quantità prevista dovrebbe variare tra 8 x 10 5 1,2 x 10 6 cellule con una vitalità&gt; 80%) usando un contatore automatico di cellule. </li></ol> 3. Stimolazione e FACS colorazione delle cellule gengivali <ol><li> Stimolare la sospensione cellulare singola con PMA (50 ng / ml) e Ionomicina (2,5 mcg / ml) in presenza di 1 microlitri / ml di brefeldin A. </li><li> Incubare per 3,5 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Spin giù e lavare con PBS e centrifugare a 4 ° C; 314 xg per 6 min. </li><li> Macchiare le cellule utilizzando una macchia vitalità seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Stain di marcatori extracellulari (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ o formicaibodies di scelta) a seguito le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare le cellule con tampone a freddo FACS e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min. </li><li> Delicatamente vortice di disturbare il pellet. </li><li> Fissare le cellule con paraformaldeide al 2% per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con tampone freddo FACS, centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min e colorare per citochine intracellulari. <ol><li> Riempire i tubi FACS con una soluzione di fredda saponina 0,5% diluito in tampone FACS e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min. </li><li> Aggiungere 300 pl di soluzione di saponina 0,5% ai tubi FACS, incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C e quindi si centrifuga a 4 ° C, 314 xg per 5 min. </li><li> Colorare le cellule per markers intracellulari (IL-17A e IFNγ o citochine di scelta) seguito le istruzioni del produttore. Lavare le cellule con soluzione di saponina 0,5% e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min. </li><li> Lavare nuovamente con FACSbuffer e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in 300 ml di tampone FACS. </li></ol></li><li> Analizzare i risultati su un citometro di flusso. </li></ol> 4. Flusso Analisi Citometria <ol><li> Visualizzare le cellule da analizzare in avanti (FSC) e side scatter (SCC) e porta ad escludere detriti. </li><li> Selezionare le celle singole con zona forward scatter (FSC-A) vs. altezza parametri (FSC-H). </li><li> Cellule gate che sono in diretta (come indicato dalla redditività colorazione) e positiva per il marcatore ematopoietiche CD45 + per ulteriori analisi (Figura 2A e 2C). </li><li> Continuare analisi di marcatori specifici come mostrato in Figura 2 e Figura 3. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

L&#39;attuale tecnica produce con successo un gran numero di cellule immunitarie (da un singolo mouse) adatto, non solo per la caratterizzazione fenotipica, ma anche per studi funzionali ex vivo. Un altro gruppo aveva già pubblicato un protocollo per isolare e caratterizzare le cellule immunitarie murino gengivali e ha introdotto il valore di usare multicolore citometria a flusso nello studio di parodontite in modelli animali 9. A seguito di una notevole risoluzione dei problemi della modifica chiave...

Tessuti gengivali circondano la dentatura murino e umano e sono costantemente esposti al complesso biofilm del dente 1. La rete di cellule immunitarie sorvegliare la barriera gengivale è fondamentale per mantenere l&#39;integrità del tessuto, garantendo omeostasi con i microbi commensali locali e, al tempo stesso, assicura immunità efficace contro sfida patogenicità 2. Per raggiungere l&#39;omeostasi, il sistema immunitario è attentamente su misura per l&#39;ambiente gengivale creazione di una rete di cellule immunitarie altamente specializzato, ma piccolo dettaglio si sa delle popolazioni di cellule immunitarie gengivali e il loro ruolo nel mantenimento del tessuto immunità 2. Quando l&#39;omeostasi immunitaria è interrotta alla gengiva, sia attraverso una maggiore suscettibilità dell&#39;ospite e / o la presenza di comunità microbiche disbiosico, una condizione infiammatoria, la parodontite si pone 3 4. La parodontite è una malattia infiammatoria comune, con conseguente perdita del dente sstrutture upporting. Nelle sue forme più gravi si è visto in circa il 10% della popolazione generale 5. Analisi dei fattori chiave coinvolti nella predisposizione e nella progressione della parodontite si è dimostrato difficile 6. Tuttavia, i modelli animali sono stati estremamente utili per la comprensione dei meccanismi di iniziazione parodontite e la progressione 7. I modelli possono essere utilizzati per definire le popolazioni di cellule chiave e mediatori molecolari che sono vitali per il mantenimento dell&#39;omeostasi immunitario e lo sviluppo di auto di periodontite. Tale intuizione trasformerà la nostra comprensione di controllo specifico-gengiva di omeostasi immunitaria e ulteriormente la nostra attuale comprensione della patogenesi della malattia.

<table><tbody><tr><td>Forbici fini</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi #3</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi #10</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>10010-00</td><td>Pinze sterili</td></tr><tr><td>per schegge</td><td>Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>Aghi con smusso regolare&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 G, lunghezza 12,7 mm</td></tr><tr><td>Siringhe monogetto</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>punta Luer-lock, 3 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Senza L-glutammina</td></tr><tr><td>DNasi I da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Gibco (di Life technologies)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino</td><td>Gemini Bio-prodotti</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina 50 mg/ml</td><td>Biologico di qualità</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco (di Life technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco (di Life technologies)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Qualità biologica</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Polipropilene, sterile</td></tr><tr><td>70 &mu; Filtri cellulari M</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Provette FACS sterili da 5 ml</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Sterile BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Contiene brefeldina A soluzione</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina Calcio Sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponina dalla corteccia di quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di macchie di cellule morte Aqua riparabile</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo gamma delta TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo IFN-&gamma; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo TCR beta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Le reti di cellule immunitarie nei tessuti svolgono un ruolo vitale nel mediare l'immunità locale e nel mantenere l'omeostasi dei tessuti, ma si sa poco delle popolazioni di cellule immunitarie residenti nella mucosa orale e nella gengiva. Abbiamo messo a punto una tecnica per l'isolamento e lo studio delle cellule immunitarie dai tessuti gengivali murini, un'area di costante esposizione microbica e un sito vulnerabile a una comune malattia infiammatoria, la parodontite. Il nostro protocollo consente una caratterizzazione fenotipica dettagliata delle popolazioni di cellule immunitarie residenti nella gengiva, anche allo stato stazionario. La nostra procedura produce anche un numero sufficiente di cellule con un'elevata vitalità per l'uso in studi funzionali, come la valutazione della secrezione di citochine ex vivo. Questa combinazione di caratterizzazione fenotipica e funzionale della rete di cellule immunitarie gengivali dovrebbe aiutare a studiare i meccanismi coinvolti nell'immunità orale e nell'omeostasi parodontale, ma farà anche progredire la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nell'immunopatologia locale.

Per illustrare l&#39;applicazione del protocollo, si mostra risultati rappresentativi esaminando la rete delle cellule immunitarie nella gengiva di topi con e senza parodontite (WT vs LFA - / -, Figura 2a - C). FACS Rappresentante grafici mostrano le cellule CD45 + ematopoietiche dal vivo nella gengiva (Figura 2A, 2C). L&#39;isolamento e la trasformazione delle cellule immunitarie con questo protoco...

Abbiamo stabilito una tecnica per l&#39;isolamento, la caratterizzazione fenotipica e analisi funzionale di cellule immuni dalla gengiva murino.

Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare le cellule immunitarie gengivali per la caratterizzazione approfondita delle risposte immunitarie correlate all'immunità orale e alla parodontite. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunità orale, come quali fattori cellulari siano implicati nella patogenesi della parodontite. I principali vantaggi di questa tecnica sono che permette la valutazione della rete delle cellule immunitarie orali e l'isolamento di un numero sufficiente di cellule vitali per successive indagini in vitro.Come primo passo di questo protocollo, iniziare posizionando dei perni per immobilizzare il corpo del mouse ed aprire le cavità toracica e addominale per esporre il cuore e gli organi interni. Successivamente, effettuare un'incisione nella vena cava ed utilizzare una siringa da 3 millilitri, dotata di un ago da 27 gauge, per infondere 3 millilitri di PBS attraverso il ventricolo sinistro. Quando tutto il sangue è stato rimosso, fissare la testa del mouse su un supporto da dissezione, con lo stomaco rivolto verso l'alto.Quindi utilizzare le forbici per tagliare ciascuna commessura delle labbra in direzione del collo, staccando la pelle che ricopre la regione della mandibola e del collo ed esponendo i tessuti e i muscoli sottostanti. Tagliare tra gli incisivi inferiori per separare i due lati della mandibola. Immobilizzare ciascun lato della mandibola separata con aghi da 25 gauge per accedere alla cavità orale.Dopo aver identificato il palato, utilizzare una lama chirurgica numero 10 per effettuare incisioni verticali appena anteriori al primo molare e posteriori al terzo molare. Quindi dissezionare il tessuto dalla cavità nasale ed estrarre i blocchi dalla mandibola. Successivamente, rimuovere il tessuto in eccesso dal margine della gengiva e trasferire i blocchi mascellari e mandibolari in un tubo conico da 50 millilitri contenente 5 millilitri di collagenasi e DNasi su ghiaccio.Digerire il tessuto in un incubatore agitatore a 37 gradi Celsius per un'ora, aggiungendo 50 microlitri di EDTA 0,5 Moli durante gli ultimi cinque minuti. Successivamente, aggiungere 5 millilitri di mezzo di DNasi freddo ai tessuti e mescolare delicatamente il contenuto del tubo ruotandolo. Poi, trasferire i quattro blocchi di tessuto in una piastra di Petri.E coprirli con 500 microlitri di mezzo DNasi fresco. Utilizzare un bisturi per rimuovere la gengiva da ciascun blocco di tessuto. E trasferire l'intero contenuto della piastra in un filtro cellulare da 70 micron posizionato sopra un tubo da 50 millilitri.Lavare la piastra di Petri e il setaccio con 3-5 millilitri di mezzo fresco di DNasi. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa sterile da 3 millilitri per macerare il tessuto gengivale contro la maglia del setaccio. Risciacquare il setaccio con 30-35 millilitri di mezzo di DNasi freddo e centrifugare il filtrato.Quindi risospendere il palato in 1 millilitro di mezzo completo e determinare il numero di cellule vitali. L'isolamento e la lavorazione delle cellule immunitarie come qui illustrato permettono di ottenere un numero sufficiente di cellule per eseguire una stimolazione ex-vivo e la caratterizzazione dei profili di secrezione di citochine da parte delle cellule gengivali, sia da animali wild-type che da animali suscettibili a parodontite. In effetti, la composizione delle cellule immunitarie gengivali nei topi può essere analizzata come mostrato in questi grafici di densità che valutano i compartimenti delle cellule T e delle cellule natural killer nei topi knock-out per LFA suscettibili a parodontite.Utilizzando adeguate strategie di selezione, è inoltre possibile determinare la produzione intracellulare di citochine da parte di cellule T TCR beta CD4 positive, TCR beta CD8 positive, TCR gamma delta positive, nonché di cellule NK e cellule linfoidi innate. Una volta acquisita padronanza della tecnica, le cellule possono essere isolate in tre ore per la colorazione immunoistochimica, a condizione che la procedura venga eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di completare tutti i passaggi in modo efficiente e rapido, mantenendo le cellule sul ghiaccio ogni volta che non vengono manipolate.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il sorting cellulare, per rispondere a ulteriori domande relative alla funzione di specifici sottoinsiemi cellulari.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un'alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Questo video mostra la procedura di isolamento della rete di cellule immunitarie gengivali da un modello murino. La digestione enzimatica rilascia il tessuto gengivale dai denti e dall'osso attaccati, che viene ulteriormente digerito meccanicamente, liberando le cellule immunitarie dalla gengiva. Le cellule isolate sono pronte per esperimenti immunologici.

Isolamento della rete di cellule immunitarie gengivali da blocchi di denti murini

Questo studio descrive una tecnica efficiente per isolare e processare tessuti gengivali dalla cavità orale topo per produrre una coltura cella singola. Le cellule risultanti possono essere ulteriormente utilizzati per l'analisi di citometria a flusso e studi molecolari.

Isolamento, elaborazione ed analisi dei murini gengivali

Questo articolo presenta due protocolli: uno per misurare i batteri anaerobi che possono invadere e sopravvivere con successo all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri anaerobici che interagiscono con le cellule ospiti. Questo studio può essere applicato a qualsiasi anaerobo coltivabile e a qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

L'obiettivo del protocollo è quello di costruire un modello di infiammatorio gengiva umana in vitro. Questo modello di tessuto Co-coltiva tre tipi di cellule umane, keratinocytes di HaCaT, fibroblasti gengivali e macrofagi THP-1, in condizioni tridimensionali. Questo modello può essere applicato a indagare le malattie parodontali, quali gengivite e parodontite.

Equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del Gingiva

Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsillare da esseri umani sani sottoposti a tonsillectomia chirurgica parziale per studiare le risposte immunitarie innate dopo l'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali.

Isolamento delle cellule mononucleari del Tonsillar per studiare le risposte immunitarie innate Ex Vivo in un tessuto linfoide mucosale umano

Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.

Isolamento rapido di singole cellule da denti di topo e umani

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2), implicate nell'infiammazione di tipo 2, partecipano principalmente alla risposta all'infezione da elminti, alle malattie allergiche, all'omeostasi metabolica e alla riparazione dei tessuti. In questo studio, viene dimostrata una procedura per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina e rilevare l'espressione di CD226.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un approccio standardizzato per valutare quantitativamente l'integrità della barriera epiteliale gingivale murina applicando topicamente destranti marcati con fluorescenza di dimensioni molecolari variabili sulla superficie gengivale in vivo, seguiti da imaging ex vivo utilizzando un sistema di microscopia a fotone singolo.

Valutazione funzionale della barriera epiteliale gingivale del topo utilizzando traccianti fluorescenti

Impara a isolare e caratterizzare le cellule immunitarie gengivali murine per studiare l'immunità orale e la patogenesi della parodontite. Questa tecnica consente analisi funzionali dettagliate in vitro.

Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

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