Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare le cellule immunitarie gengivali per la caratterizzazione approfondita delle risposte immunitarie correlate all'immunità orale e alla parodontite. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunità orale, come ad esempio quali fattori cellulari sono implicati nella patogenesi della parodontite. I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente la valutazione della rete di cellule immunitarie orali e l'isolamento di un numero sufficiente di cellule vitali per le indagini in vitro a valle.

Come primo passo di questo protocollo, inizia posizionando dei perni per immobilizzare il corpo del topo e aprire le cavità toraciche e addominali per esporre il cuore e gli organi interni. Successivamente, praticare un'incisione nella vena cava e utilizzare una siringa da 3 millilitri, dotata di un ago calibro 27, per erogare 3 millilitri di PBS attraverso il ventricolo sinistro. Quando tutto il sangue è stato lavato, appuntare la testa del topo su un tampone da dissezione, con lo stomaco rivolto verso l'alto.

Quindi usa le forbici per tagliare ogni commessura del labbro verso il collo, separando la pelle che copre la mandibola e la regione del collo ed esponendo i tessuti e i muscoli sottostanti. Tagliare tra gli incisivi inferiori per separare entrambi i lati della mandibola. Immobilizzare ciascun lato della mandibola separata con aghi calibro 25 per accedere alla cavità orale.

Dopo aver identificato il palato, utilizzare una lama chirurgica numero 10 per praticare incisioni verticali appena anteriormente al primo molare e posteriormente al terzo molare. Quindi sezionare il tessuto lontano dalla cavità nasale e sezionare anche i blocchi dalla mandibola. Quindi eliminare il tessuto in eccesso dal bordo della gengiva e trasferire i blocchi mascellare e mandibolare in un tubo conico da 50 millilitri contenente 5 millilitri di collagenasi e DNasi su ghiaccio.

Digerire il tessuto in un incubatore shaker a 37 gradi Celsius per un'ora, aggiungendo 50 microlitri di EDTA molare 0,5 durante gli ultimi cinque minuti. Quindi aggiungere 5 millilitri di terreno DNasi freddo ai tessuti e mescolare delicatamente il contenuto del tubo facendo roteare. Quindi, trasferisci i quattro blocchi di tessuto in una capsula di Petri.

E coprili con 500 microlitri di terreno DNasi fresco. Usa un bisturi per rimuovere la gengiva da ogni blocco di tessuto. E trasferisci l'intero contenuto del piatto in un colino cellulare da 70 micron sopra un tubo da 50 millilitri.

Lavare la capsula di Petri e il colino con 3-5 millilitri di terreno DNasi fresco. E poi usa lo stantuffo di una siringa sterile da 3 millilitri per schiacciare il tessuto gengivale contro la rete del colino. Sciacquare il colino con 30-35 millilitri di terreno DNasi freddo e centrifugare il filtrato.

Quindi risospendere il palato in 1 millilitro di terreno completo e determinare il numero di cellule vitali. L'isolamento e il processamento delle cellule immunitarie, come appena dimostrato, produce un numero sufficiente di cellule per eseguire una stimolazione e una caratterizzazione ex-vivo dei pattern di secrezione di citochine delle cellule gengivali sia da animali wild-type, sia da animali suscettibili alla parodontite. Infatti, la composizione delle cellule immunitarie gengivali murine può essere analizzata, come dimostrato in questi grafici di densità che valutano i compartimenti delle cellule t e natural killer nei topi knockout per LFA suscettibili alla parodontite.

Utilizzando le appropriate strategie di gating, è possibile determinare anche la produzione intracellulare di citochine delle cellule t TCR beta CD4 positive, TCR beta CD8 positive e TCR gamma delta positive, nonché delle cellule NK e delle cellule linfoidi innate. Una volta padroneggiate, le cellule possono essere isolate in tre ore per l'immunocolorazione se la tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di completare tutti i passaggi in modo efficiente e rapido, mantenendo le cellule sul ghiaccio ogni volta che non vengono manipolate.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'ordinamento cellulare, per rispondere a ulteriori domande relative alla funzione dei sottoinsiemi cellulari specifici.