Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di essere in grado di quantificare diverse metalloproteine in standard complessi basati sull'uso di standard metalloproteici noti. Questo metodo può rispondere a domande chiave sul ruolo dei metalli in biologia. Ad esempio, come cambia lo stato del metallo di una proteina nella malattia?

Un vantaggio chiave di questa tecnica è che consente di misurare lo stato metallico di una proteina nel suo stato nativo. A dimostrare la tecnica sarà Amber Lothian, una dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, omogeneizzare i campioni di tessuto o di coltura cellulare mediante abbassamento manuale o sonicazione per cinque minuti utilizzando soluzione salina tamponata Tris.

Chiarificare gli omogeneizzati mediante centrifugazione a 16.000 volte G, per cinque minuti. Dopo aver raccolto il surnatante risultante, normalizzare la quantità totale di proteine determinando le concentrazioni proteiche come descritto nel protocollo di testo. Riscaldare e sintonizzare il maspectromor al plasma accoppiato induttivamente, utilizzando i protocolli del produttore.

Diluire gli standard delle metalloproteine per godere della caduta nell'intervallo da zero a 500 microgrammi per litro, utilizzando l'uno per cento di acido nitrico. Per raggiungere gli standard all'interno di questo intervallo, non utilizzare diluizioni superiori a uno e 20. Imposta l'ordine delle iniezioni analizzando prima i sette livelli di calibrazione.

Concentrazioni che vanno da zero a 500 microgrammi per litro, seguite dagli standard delle metalloproteine. I sette livelli di calibrazione sono zero, uno, cinque, dieci, 50, 100 e 500 microgrammi per litro. Quindi, seleziona gli elementi di interesse.

Qui, usa ferro, rame, zinco, cobalto e iodio. In quanto sono gli elementi a cui sono vincolati gli standard proteici. Selezionare gli elementi nel metodo di acquisizione aprendo la scheda di selezione degli elementi e aggiungendo gli elementi e le rispettive masse isotopiche da analizzare.

Quindi, eseguire l'analisi del campione con lo strumento. Il software dello strumento crea automaticamente le curve di calibrazione per ciascuno degli elementi analizzati. Utilizzare le curve di calibrazione per determinare la concentrazione di metallo nei campioni sconosciuti.

Dai risultati dell'analisi di massa, generare gli standard metalloproteici che includono i tre oligoelementi più abbondanti nei tessuti dei mammiferi utilizzando una miscela di rame, zinco superossido dismutasi e ferritina. Spurgare le pompe per cromatografia rapida hyperformance, o HPLC, con 200 millimolari di tampone nitrato di ammonio per cinque minuti a una velocità di flusso di cinque millilitri al minuto. Una volta spurgato il sistema, impostare la portata al punto zero di un millilitro al minuto.

E collega la colonna di esclusione del lato. Collegare l'estremità opposta della colonna al rivelatore UV, impostare l'assorbanza di misura a 280 nanometri, utilizzando il tubo di picco. Aumentare gradualmente la portata della colonna con incrementi di zero virgola un millilitro al minuto, fino a raggiungere una portata finale di zero virgola quattro millilitri al minuto.

Durante questa operazione, controllare che i collegamenti dei tubi alla colonna non presentino perdite. Monitorare la pressione di questo sistema per assicurarsi che non superi i requisiti della colonna osservando la traccia di pressione sul cromatogramma nel software. Lasciare che la colonna si equilibri alla portata richiesta su un volume compreso tra cinque e 10 colonne.

Dopo averlo bilanciato, collegare gli strumenti per consentire l'analisi del campione. Impostare il metodo HPLC per pompare il tampone A sulla colonna al punto zero di quattro millilitri al minuto, per 15 minuti. Mettere l'ICPMS in modalità standby prima di modificare l'impostazione hardware.

Una volta in modalità standby, disattivare la comunicazione per il campionatore automatico e modificare l'introduzione del campione in altro. Utilizzare un tubo in PEEK per collegare il deflusso dal rivelatore UV direttamente al nebulizzatore sull'ICPMS. Accendere l'ICPMS e lasciare che lo strumento si riscaldi per 10-20 minuti.

Dopo che il plasma si è acceso, collegare il cavo remoto dall'ICPMS al retro del campionatore automatico HPLC. Fallo una volta che il plasma si è acceso. In caso contrario, il sistema HPLC si spegnerà automaticamente, poiché l'ICPMS non è attivo.

Modificare il metodo ICPMS per raccogliere dati per LC ICPMS modificando prima il metodo di acquisizione da spettro a risoluzione temporale dell'acquisizione. Quindi, selezionare gli elementi da analizzare. Ferro, rame, zinco, cobalto, iodio, oltre a qualsiasi altro elemento di interesse, e tempi di integrazione prestabiliti.

Dopo aver scelto gli elementi di interesse, regolare il tempo di acquisizione in modo che corrisponda al tempo di esecuzione della cromatografia. Regolazione manuale dell'ICPMS per la sensibilità e le portate di elio gassoso della cella di collisione con un tampone per cromatografia che scorre con cesio e antimonio inclusi nel tampone. Una volta che la conta degli ioni metallici si è stabilizzata e i valori di deviazione standard relativa sono inferiori al cinque percento, il sistema è pronto per l'uso.

Creare elenchi di esempio sia nei programmi software HPLC che ICPMS. L'elenco di esecuzione dei campioni contiene l'ordine in cui ciascuno dei campioni deve essere iniettato. Così come il nome con cui verranno salvati i dati.

Verificare che il numero totale di campioni nell'elenco corrisponda tra i due programmi. Avviare il lotto di campioni per l'ICPMS prima dell'HPLC, poiché l'iniezione del campione da parte dell'HPLC attiverà l'ICPMS per iniziare a raccogliere i dati. Se questa operazione non viene eseguita nell'ordine corretto, i dati risulteranno mancanti.

Generare punti della curva di calibrazione iniettando volumi variabili dello standard misto di superossido dismutasi e ferritina. I volumi di iniezione vanno da un microlitro a 30 microlitri. Infine, analizza ciascuno dei campioni sconosciuti, come tessuti, plasma o colture cellulari, prima di analizzare i dati come descritto nel protocollo di testo.

Viene mostrata l'illusione della ferritina in un intervallo compreso tra 2000 e 60.000 picogrammi di ferro iniettato sulla colonna. L'analisi di regressione è stata eseguita utilizzando l'area di picco. I profili di illusione per rame, zinco, superossido dismutasi sono mostrati sia per il rame che per lo zinco.

Vengono mostrate anche le analisi di regressione generate utilizzando le aree di picco. I risultati dell'analisi di regressione vengono utilizzati per convertire i dati grezzi in conteggi al secondo in picogrammi al secondo. In modo che la quantità di metallo associata alla proteina possa essere determinata quantitativamente.

Questa tecnica può essere utilizzata per identificare le metalloproteine in campioni biologici complessi. Qui viene mostrato il cervello umano separato da SEC ICPMS. Ognuno dei quali rappresenta un diverso metallo di interesse.

Vale a dire, rame, zinco o ferro. Qui sono mostrate le tracce ottenute quando il plasma umano viene sottoposto a questa tecnica. La complessità e l'abbondanza del campione influenzeranno il numero di picchi osservati.

Come previsto, il plasma è dominato da alcune metalloproteine, tra cui la ceruloplasmina e la transferrina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare uno strumento per misurare lo stato nativo delle metalloproteine in campioni complessi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata con successo in tre o quattro ore.

Ciò consente di analizzare da 20 a 36 campioni in un solo giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare gli standard di metalloproteine appropriati, come la SOD di rame e zinco, se sei interessato al rame e allo zinco. Così come gli standard interni nel buffer, come il cesio, che consente di correggere eventuali derive dello strumento nel tempo.

Seguendo questa procedura, è possibile implementare anche altre forme di spettrometria di massa per rispondere a domande importanti. Ad esempio, quali sono le metalloproteine presenti nel mio campione? Questo può essere fatto con viaggi standard nella digestione e nel sequenziamento dei peptidi proteici di massa.

Oppure, analizzando le proteine intatte, nel loro stato nativo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per comprendere il ruolo delle metalloproteine nelle malattie, come il morbo di Alzheimer. Non dimenticare che si lavora con acido nitrico concentrato e campioni clinici.

È necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.