Name: Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Impara a quantificare le metalloproteine in campioni biologici complessi utilizzando la cromatografia di esclusione molecolare accoppiata alla spettrometria di massa ICP-MS. Questo metodo consente di analizzare lo stato metallico delle proteine nello stato nativo.

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Vorremmo riconoscere il sostegno del programma del Governo del Victoria Operativa Infrastrutture di supporto, il collegamento Progetti Scheme (con Agilent Technologies) Australian Research Council, l&#39;Australian Research Centre Cooperative National Health and Medical Research Council, la banca del cervello vittoriana, per la salute mentale e il Neuroproteomics servizio, struttura.

1. Preparazione di buffer e Campioni <ol><li> Preparare 500 ml di tampone, 200 mM di nitrato di ammonio pH 7,6 - 7.8 (pH regolato con idrossido di ammonio (NH 4 OH)) con cesio (Cs) e antinomy (Sb) aggiunto ad una concentrazione finale di 10 ppb. Utilizzare cesio e antinomia come standard interni per monitorare qualsiasi deriva nella risposta di ICP-MS. tampone filtro prima dell&#39;uso attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Preparare campioni a seconda del tipo di campione: liquido, tessuti o coltura cellulare. <ol><li> Per i campioni che richiedono omogeneizzazione (ad esempio, tessuti o cellule), assicurarsi che non contengono detersivo. Utilizzare i buffer Tris per la preparazione del campione. In alternativa, utilizzare tamponi fosfato, ma possono influire negativamente sul metalloproteome nel tempo o con cicli di gelo-disgelo 12. </li><li> Omogeneizzare campioni di tessuto o di colture cellulari di Dounce manuale o sonicazione per 5 min con Tris tamponata salina (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM di cloruro di sodio(NaCl) + acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) inibitori della proteasi libere). </li><li> Chiarire omogeneizzati per centrifugazione a 16.000 xg per 5 min. Raccogliere il surnatante risultante. I campioni a 4 ° C. Nota: Tutti i campioni devono essere centrifugati prima di caricare nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) fiale per evitare che le particelle di bloccare la colonna dimensione esclusione cromatografia (SEC). </li></ol></li><li> Normalizzare la quantità totale di proteine ​​caricate sulla colonna di tutti i campioni. Determinare le concentrazioni di proteine ​​a 280 nm utilizzando un micro volume di spettrofotometro UV 13. Carico tra 20 e 150 mg di proteine. Utilizzare volumi tipici iniezione vanno da 2 - 80 microlitri seconda della concentrazione del campione. <ol><li> Pulire il braccio del campione del micro spettrofotometro volume di UV con acqua distillata prima di caricamento del campione. Il braccio del campione è dove i campioni di proteine ​​vengono caricati. </li><li> Vuoto lo strumento contro 2 ml di thtampone campione e. Poi, carico 2 ml di ogni campione sul braccio e misurare l&#39;assorbanza a 280 nm. </li><li> Determinare le concentrazioni. Per i campioni proteici grezzi, utilizzare un coefficiente di estinzione di 1 Abs = 1 mg / ml. Per determinare la concentrazione di proteine ​​nei campioni, utilizzare la legge di Beer-Lambert, A = ε xlxc, dove A è l&#39;assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione, l è la lunghezza del percorso in centimetri e c è la concentrazione. </li></ol></li></ol> 2. Analisi di massa di metalloproteine ​​Standards Utilizzando plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa <ol><li> Warm-up e accordare lo strumento utilizzando i protocolli del produttore. </li><li> Una volta strumento viene riscaldato e messo a punto, eseguire massa ICP-MS. Nota: Le soluzioni madre di metalloproteine ​​purificati in genere bisogno di essere diluito prima della misurazione. La concentrazione di metallo dello standard può essere stimata dalla proteina nota: stochiometries metallo e concentrazione di proteine ​​stimatozione. Questa informazione può essere utilizzata per determinare la diluizione che sarà opportuno rientrare nell&#39;intervallo della curva standard generata. <ol><li> Diluire standard metalloproteine, tireoglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12, per garantire che rientrano nel range di 0 - 500 mg / L, con acido nitrico 1%. Per raggiungere gli standard all&#39;interno di questo intervallo, non utilizzare diluizioni superiori a 1 a 20. Effettuare diluizioni seriali in acqua per diluire le scorte prima di questo, se necessario. </li><li> Impostare l&#39;ordine di iniezioni. Innanzitutto, analizzare i sette livelli di taratura, concentrazioni comprese tra 0 - 500 mg / L, seguiti dalle norme metalloproteine. I sette livelli di calibrazione sono 0, 1, 5, 10, 50, 100 e 500 mg / L. </li><li> Selezionare gli elementi di interesse. Qui, utilizzare Fe, Cu, Zn, Co e io, in quanto sono gli elementi che le norme proteiche sono tenuti a. Selezionare gli elementi nel metodo dell&#39;acquisizione aprendo la scheda selettore di elementi e aggiungendo il eleme<html> NTS e le rispettive masse isotopi che devono essere analizzati. </li><li> Effettuare analisi campione con lo strumento e il software dello strumento crea automaticamente le curve di calibrazione per ciascuno degli elementi oggetto di analisi. Le curve di calibrazione sono create dal software tracciando il conteggi / sec del metallo rilevato contro la quantità di metallo che lo standard è destinato a contenere, in mg / L. Utilizzare le curve di calibrazione per determinare la concentrazione di metallo nei campioni sconosciuti. Nota: Usando la curva di calibrazione, il software determina la concentrazione di metallo in ciascuna soluzione standard metalloproteine. </li><li> Dai risultati delle analisi di massa, generare standard metalloproteine ​​che includono i tre elementi in tracce più abbondanti nei tessuti di mammifero usando una miscela di Cu, Zn superossido dismutasi (SOD) diluito a 200 mg / l di rame e zinco e ferritina (FTN) ad una finale concentrazione di 2.000 mg / L di ferro. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Setup HPLC del sistema e Size Exclusion Equilibration cromatografia Colonna Nota: Questa sezione deve essere eseguita in parallelo al precedente, poiché entrambi necessari circa 1-1,5 ore per completare. <ol><li> Pompe di spurgo HPLC con tampone fatta allo step 1.1 e spurgare le pompe per 5 min ad una velocità di flusso di 5 ml / min. </li><li> Una volta che il sistema viene spurgato, impostare la portata a 0,1 ml / min e collegare la colonna di esclusione dimensionale (4,6 x 300 mm, 3 micron, 150 Å). Nota: una connessione bagnata tra il tubo e la colonna evita eventuali bolle d&#39;aria intrappolate in fase durante la connessione della colonna. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta della colonna al rivelatore UV impostato per misurare l&#39;assorbanza a 280 nm usando tubo PEEK. </li><li> Aumentare gradualmente la velocità di flusso della colonna in passi da 0,05 - 0,1 ml / min fino ad una velocità di flusso finale di 0,4 ml / min è raggiunto. Anche se questo è in corso, controllare i collegamenti dei tubi alla colonna di eventuali perdite. Monitorare la pressionedel sistema per garantire che non superi i requisiti delle colonne osservando la traccia pressione sul cromatogramma nel software. </li><li> Lasciare la colonna per equilibrare alla portata richiesta in 5 - 10 volumi di colonna. Dopo che è equilibrato, collegare gli strumenti per consentire l&#39;analisi del campione a verificarsi. </li><li> Impostare il metodo HPLC alla pompa tampone A sopra la colonna a 0,4 ml / min per 15 min. </li></ol> 4. creazione e la gestione Size Exclusion - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa Nota: le procedure operative possono variare tra gli strumenti e modelli. Contatta lo specialista tecnico dello strumento per ulteriori informazioni su come configurare la ICP-MS in uso. <ol><li> Posizionare la ICP - MS in modalità standby prima di cambiare l&#39;impostazione hardware. <ol><li> Una volta in modalità standby, spegnere la comunicazione per il campionatore automatico e cambiare l&#39;introduzione del campione di &quot;altro&quot;. Nota: A seconda del software e duroware configurazione selezionando &quot;HPLC&quot; come fonte di introduzione del campione può essere utilizzato. Contatta lo specialista tecnico strumento per sapere se questa opzione è disponibile. </li></ol></li><li> Utilizzare PEEK tubo (ID 0,13 millimetri) per collegare il flusso in uscita dal rivelatore UV direttamente al nebulizzatore sul ICP-MS. </li><li> Potenza backup ICP - MS e lasciare lo strumento si riscaldi per 10 - 20 min. </li><li> Dopo il plasma è acceso, collegare il cavo remoto dal ICP - MS al retro del autocampionatore HPLC. Fate questo una volta che il plasma è acceso; altrimenti il ​​sistema HPLC si spegne automaticamente dal momento che la ICP - MS non è acceso. </li><li> Modificare il metodo ICP-MS per raccogliere i dati per LC-ICP-MS. <ol><li> Modificare il metodo di acquisizione da spettro di acquisizione in tempo risolvere (TRA). </li><li> Selezionare gli elementi da analizzare, Fe, Cu, Zn, Co, I, nonché qualsiasi altro elemento di interesse, ed i tempi di integrazione impostato (tipicamente tra 0,05-0,3 sec). Dopo che gli elementi di interesse unare scelto, regolare il tempo di acquisizione in base al tempo di funzionamento per la cromatografia (ad esempio, 900 secondi per una corsa cromatografia 15 min). </li><li> sintonizzare manualmente la ICP - MS dell&#39;elio sensibilità e collisione cella (He) portate di gas con il buffer cromatografia scorre utilizzando Cs e Sb inclusi nel buffer. Le portate He sono tipicamente ~ 1 ml / min inferiore a quelli utilizzati per l&#39;analisi di massa. Una volta che i conteggi di ioni metallici sono stabilizzati e valori deviazione standard relativa (RSD) sia inferiore al 5%, il sistema è pronto per l&#39;uso. </li></ol></li><li> Fare il campione liste eseguiti sia in HPLC e programmi software ICP-MS. L&#39;elenco esecuzioni campione contiene l&#39;ordine in cui ciascuno dei campioni deve essere iniettato, così come il nome con cui salvare i dati. Controllare che il numero totale di campioni nella partita lista tra i due programmi. </li><li> Avviare il lotto di campioni per ICP-MS prima della HPLC, come l&#39;iniezione del campione per HPLC attiverà l&#39;ICP - MS per iniziare a raccoglieredati. Se questo non avviene nell&#39;ordine corretto si tradurrà in dati mancanti. </li><li> Genera punti della curva di calibrazione iniettando diversi volumi della SOD e miscela standard FTN da 200 mg / L a 6.000 mg / L iniettato su colonna per Cu e Zn e 2.000 mg / L fino a 60.000 mg / L per Fe. volumi di iniezione vanno da 1 a 30 ml. Nota: Questi intervalli di concentrazione comprendono le concentrazioni di Fe, Cu e Zn tipicamente osservati in omogenati complesse. Per i campioni che contengono solo le proteine ​​purificate la portata massima della curva deve essere regolata di conseguenza. Poiché la quantità di metallo associati con la proteina può richiedere un intervallo più piccolo o più grande poiché non vi è meno contaminazione del campione da altri fattori. </li><li> Analizzare ciascuno dei coltura di tessuti campioni sconosciuti, plasma o cellule. </li></ol> 5. Analisi dei dati, manipolazione e visualizzazione <ol><li> Memorizzare i dati di valore separati da virgola (CSV) formato di file e caricare into programmi di elaborazione, come richiesto. </li><li> Al fine di controllare per lo strumento deriva, dividere i conteggi per secondo per ogni elemento dai conti al secondo per entrambi Cs o SB. </li><li> Generare curve di calibrazione per ciascuno degli elementi. <ol><li> Determinare l&#39;area sotto il picco del metallo corrispondente al metalloprotein che essa è destinata a per ciascuna delle iniezioni eseguendo l&#39;integrazione dei picchi nel software di analisi dati preferito. </li><li> Tracciare l&#39;area sotto il picco del metallo contro l&#39;importo totale del metallo che è stato iniettato nella colonna in ciascuna prova, 200 - 6.000 mg / L per Cu e Zn e 2.000 - 60.000 mg / L per Fe. Eseguire analisi di regressione lineare secondo il protocollo software. </li><li> Utilizzare i risultati pendenza dall&#39;analisi di regressione lineare come fattore per convertire conteggi al secondo per pg / sec. Dividere ciascuno dei conteggi per punti dati secondo tutto il cromatogramma dal gradiente del valore della linea. </li></ol></li><li> Grafico i dati inpg / sec contro il tempo cromatogramma. Determinare l&#39;area sotto i picchi di interesse. L&#39;area sotto il picco rappresenta la quantità totale di metallo che la proteina è destinato a, in pg. </li><li> Generare una calibrazione basato sul peso molecolare delle metalloproteine ​​conosciuti e il momento in cui essi eluiscano. Usare questo per valutare la dimensione dei picchi di proteine ​​in campioni complessi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Assicurare lo stato nativo della proteina significa particolare attenzione ai buffer utilizzati e sono necessarie conservazione del campione. Non tutte le tecniche di cromatografia o tecniche di preparazione dei campioni possono essere impiegate. È importante che i buffer utilizzati durante la preparazione del campione e la cromatografia sono privi di chelanti di metalli e utilizzare buffer che imitano le concentrazioni di pH e di sale fisiologico. Altre condizioni da evitare sono il riscaldamento del campione o l&#39;aggiunta di proteine ​​denaturanti (ad esempio, urea). È fondamentale per minimizzare il numero di cicli di gelo-disgelo. La capacità del buffer scelto di legare metalli bivalenti è importante e una ragione che Tris o ammonio nitrato buffer sono scelti fra i respingenti base di fosfato. La risoluzione e bassa capacità di picco della cromatografia ad esclusione sterica rispetto ad altre forme di cromatografia è un grosso limite di questa tecnica. Tuttavia, la natura gentile di dimensioni esclusione crPHY è importante mantenere lo stato nativo della proteina e quindi preservare i legami metallo-proteina relativamente deboli. Il requisito per mantenere lo stato originario delle proteine ​​richiede una particolare attenzione al trattamento dei campioni anche limitare il numero di cicli di gelo-disgelo, evitando chelanti di metalli (ad esempio, EDTA) o sali caotropici e detergenti. Questa bassa risoluzione di questa tecnica influenzano la capacità di quantificare la quantità di metallo associato con una proteina specifica se è in un campione complesso come i picchi osservati conterrà più di una proteina. Pertanto, la quantità di metallo determinato con l&#39;integrazione dei picchi sarebbe un&#39;indicazione della quantità totale di metallo associati con tutte le proteine ​​eluendo a questo punto di tempo e non solo una proteina specifica. Per superare questa limitazione della proteina di interesse dovrebbe essere ulteriormente purificato in condizioni native. Ciò consentirebbe per la quantificazione diil metallo associato a questa proteina da segnalare con un più alto grado di Certezza. Un altro potenziale limite di questa tecnica sarebbe la perdita di proteine ​​dovuta al legame reversibile non alla colonna. Al fine di determinare se questo accade un esperimento di recupero deve essere effettuata per cui la quantità di proteine ​​eluizione largo della colonna viene analizzato per determinare se questo corrisponde alla quantità iniettata. Lo stesso può essere fatto misurando il contenuto di metallo del materiale eluizione e il materiale di partenza da massa ICP-MS. Recupero colonna può variare a seconda delle condizioni utilizzate, ma è stato dimostrato che il recupero completo di proteine ​​da una colonna dimensioni esclusione è possibile 9. Pertanto è importante controllare se vi è alcuna perdita nelle condizioni operative utilizzate. Le modifiche al protocollo possono essere correlati agli standard metalloproteine ​​che vengono utilizzati, così come gli elementi analizzati. Il tipo di metalloproteine ​​standard degli Stati UnitiEd sarà diverso a seconda degli elementi che sono di interesse. Per elementi come Cu, Fe e Zn proteine, SOD e ferritina sono impiegati. Qualsiasi altro metalloprotein che hanno stoichometries noti può essere utilizzato e alcuni esempi sono stati qui mostrato. Una complicazione maggiore che può derivare dall&#39;uso di questa tecnica è la formazione di cristalli di sale nella torcia della ICP-MS. Per impedire la formazione di cristalli di sale, la torcia viene lavata con acqua distillata ogni 500 - 1,000 ml di tampone che è stato passato attraverso il sistema o quando viene determinato mediante ispezione visiva che la torcia deve essere lavato. Un altro problema che può sorgere è un rapido declino più nella pulizia dei coni campione ed estrazione. Questi devono essere puliti regolarmente seguendo i protocolli del produttore. La preparazione del campione iniziale è la fase più critica nel protocollo. Se ci sono eventuali modifiche alla proteina - il complesso metallico informazione generato non sarà valida. Questo è uno dei principali limiti della tecnica; inoltre l&#39;uso della bassa risoluzione, colonna esclusione dimensionale produce una vista dettagliata limitata della vera complessità delle metalloproteine ​​in biologia. La tecnica qui descritta permette l&#39;espansione della conoscenza del metalloproteome di un organismo. analisi Bulk dà solo un&#39;indicazione grezza di modifiche alla quantità di metallo in un campione. Oltre alle considerazioni generali che devono essere presi in considerazione, questa tecnica fornisce uno strumento che può essere usato per quantificare la quantità di metallo associati con proteine ​​e metalloproteine ​​identificazione che differiscono confrontando i tracciati ottenuti. L&#39;uso di questa tecnica può essere utilizzata per identificare le differenze tra stati di malattia. Le metalloproteine ​​identificate possono poi essere ulteriormente studiati per aiutare a determinare il ruolo che svolgono nei processi di malattia. L&#39;applicazione di un trattino ICP-MS ha una crescitafuturo per determinare il ruolo dei farmaci che hanno un eteroatomo come platino, iodio o rame come ICP-MS può essere utilizzato per identificare le proteine ​​che il farmaco si lega.

metalli essenziali svolgono un ruolo fondamentale nelle funzioni biologiche normali, tra cui percorsi di messaggistica secondarie, percorsi del metabolismo e le funzioni degli organelli. Il 30% di tutte le proteine ​​sono pensato per essere metalloproteine ​​1 e il 50% di tutti gli enzimi 2. Metalloenzimi utilizzano questi metalli in tracce come cofattori di catalizzare reazioni chimiche, stabilizzare la struttura delle proteine, e per i ruoli di regolamentazione, come messaggeri secondari. Alcuni degli oligoelementi più studiati con riferimento a neurodegenerazione sono rame, ferro e zinco 3. Si pensa di essere coinvolti in molte vie malattia in cui da dyshomeostasis può avere effetti negativi. Per esempio lo stato di metallo di superossido dismutasi (SOD) direttamente gli impatti del ciclo di vita e il fenotipo dei modelli di topi transgenici di tipo familiare di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) 4. Nella malattia di Alzheimer, metalloproteomics tecniche sono state utilizzate per scoprire una diminuzione dello stato metallico di transferrina in pLasma 5. Questi studi evidenziano le importanti metalloproteine ​​ruolo possono giocare nella malattia. Lo studio di metalloproteine ​​direttamente dai tessuti biologici è un campo in via di sviluppo. Anche se alcuni metalloenzimi sono stati caratterizzati, la maggior parte rimane ancora indefinita o sconosciuti 6. Una delle principali sfide in metalloproteine ​​di misura è l&#39;obbligo di mantenere lo stato nativo della proteina 7. Classica bottom-up tecniche di proteomica si basano sulla digestione delle proteine ​​in peptidi. Questo processo interrompe l&#39;interazione non covalente di metalli e loro proteine. Quindi, nessuna informazione sullo stato di metallo di una proteina è guadagnato. Un modo per superare questo problema è quello di utilizzare la cromatografia dimensione esclusione in coppia con plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa 8,9 (SEC-ICP-MS). Questo genera informazioni sulla dimensione approssimativa della proteina così come tutti i metalli che sono assocIATED con esso 10. Inoltre, l&#39;esclusione dimensioni è una delicata tecnica cromatografica che può preservare lo stato nativo di un complesso enzimatico o proteina-proteina. Un vantaggio di utilizzare plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (ICP-MS) è la natura quantitativa della tecnologia. Utilizzando un insieme di standard metalloproteine ​​è possibile fornire quantificazione assoluta di metalloproteine ​​da campioni biologici 9,11. Questo risultato è ottenuto generando una curva standard iniettando metalloproteine ​​noti in un range di concentrazioni di metalli. Questo protocollo mostra un esempio di come questo può essere realizzato per una varietà di standard metalloproteine. In questo articolo ci proponiamo di creare curve standard per i metalli che sono in gran parte studiati nei campi biologici tra cui ferro (Fe), rame (Cu), zinco (Zn), iodio (I), e il cobalto (Co).

<table><tbody><tr><td>Pompa binaria Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Autocampionatore Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Termostato autocampionatore Agilent serie 1200</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Vano colonna termostatata</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Rivelatore a lunghezza d'onda variabile</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Base di metallo in tracce di idrossido di ammonio&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Nitrato di ammonio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>256064</td><td>Prepara una soluzione fresca da 200 mM il giorno dell'esperimento</td></tr><tr><td>&nbsp; Antinomia&nbsp;</td><td>Scelta analitica&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ceruloplasmina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cesio&nbsp;</td><td>Scelta analitica&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Inibitori completi della proteasi privi di EDTA&nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Conalbumina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Concanavalina A da Canavalia ensiformis (Jack bean)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cu, Zn Superossido dismutasi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ferritin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Standard di calibrazione multielementare ICP-MS&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Realizzato fino alle concentrazioni richieste in acido nitrico all'1%</td></tr><tr><td>&nbsp; Spettrofotometro UV per microvolumi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 65% Acido nitrico&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>diluito all'1% per l'uso</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubi in peek&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Colonna di esclusione dimensionale BioSEC-3 PLC. colonna, 4,6 x 300 mm, 3 &; m, 150 & Aring; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Fornitura chimica</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tris cloridrato&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals inc.</td><td>Codice 103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tireoglobulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vitamina B12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

norme per quantitativa metalloproteomic analisi utilizzando size exclusion icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

I metalli sono essenziali per la funzione delle proteine come cofattori per catalizzare le reazioni chimiche. L'interruzione dell'omeostasi dei metalli è implicata in una serie di malattie, tra cui il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson, ma il ruolo esatto di questi metalli deve ancora essere completamente chiarito. L'identificazione delle metalloproteine incontra molte sfide e difficoltà. Qui riportiamo un approccio che permette di quantificare le metalloproteine in campioni complessi. Ciò si ottiene utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale accoppiata con la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (SEC-ICP-MS). Utilizzando sei metalloproteine note, la colonna di esclusione dimensionale può essere calibrata e i rispettivi oligoelementi (ferro, rame, zinco, cobalto, iodio) possono essere utilizzati per la quantificazione. Vengono presentate tracce di cervello e plasma umano. L'uso di questi standard di metalloproteine fornisce i mezzi per confrontare quantitativamente le abbondanze di metalloproteine tra campioni biologici. Questa tecnica è pronta a far luce sul ruolo delle metalloproteine nelle malattie neurodegenerative e in altre malattie in cui sono implicati squilibri negli oligoelementi.

L&#39;uso di standard metalloproteine ​​consente la taratura della colonna esclusione dimensionale. Figura 1A mostra il profilo di eluizione per gli standard tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12 in base al metallo che essi sono tenuti a (Fe, Co, Cu, Zn e I). Figura 1B mostra la curva di calibrazione per la colonna esclusione dimensionale in base al peso molecolare degli standard proteine ​​e il loro tempo di eluizione, presentata nel formato di volume di eluizione (Ve) diviso per il volume vuoto della colonna (Vo). Le proteine ​​utilizzate per generare questa curva standard sono Concanavalina A, conalbumina, ceruloplasmina, ferritina, SOD e tireoglobulina. La Figura 2A mostra l&#39;eluizione di ferritina su una gamma di 2.000 - 60.000 pg di Fe iniettato su colonna e la figura 2D è l&#39;analisi di regressione effettuata utilizzando pzona eak. Figure 2B e 2C sono i profili di eluizione per Cu / Zn SOD per Cu e Zn e 2E e 2F sono l&#39;analisi di regressione generata utilizzando aree dei picchi. I risultati dell&#39;analisi di regressione sono utilizzati per convertire i dati grezzi in conteggi / sec a pg / sec modo la quantità di metallo associati con la proteina può essere determinata quantitativamente. La conversione viene eseguita dividendo il conteggi / sec dalla pendenza della regressione lineare (ad esempio, 334,6 (conteggi / sec) x (sec / pg) di rame). Come detto, questa tecnica può essere utilizzata per identificare metalloproteine ​​in campioni biologici complessi. Il cervello umano e nel plasma sono stati sottoposti a questa tecnica e le figure 3 e 4, rispettivamente, mostrano i risultati ottenuti. Il cervello umano separati da SEC-ICP-MS è mostrato nelle figure 3A-3C, ciascuna delle quali rappresenta un metallo diverso<html> interesse (Cu, Zn o Fe). Figure 4A-4C mostrano le tracce ottenute quando plasma umano è sottoposto a questa tecnica. La complessità e l&#39;abbondanza del campione avrà un impatto sul numero di picchi che si vedono. Come previsto il plasma è dominato da un paio di metalloproteine ​​tra ceruloplasmina e transferrina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figura 1. La calibrazione del Size Exclusion Chromatography - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa Utilizzando noto profilo di Metalloproteine ​​(A) eluizione per gli standard di metalloproteine ​​in base alle loro rispettive metalli.. (B) della curva di taratura di peso molecolare per gli standard di proteine ​​tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbumina (iv), Cu / Zn SOD (v) e concanavalina A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figura 2. Utilizzo della ferritina e Cu / Zn SOD come metalloproteine ​​standard per determinare la quantità di Cu, Fe o Zn associati con Metalloproteine ​​in un campione biologico complesso (A) profilo di eluizione per ferritina nel range di iniezione di 2.000 -. 60.000 mg / L di ferro. (B) e (C) il profilo di eluizione per Cu / Zn SOD nell&#39;intervallo di iniezione di 200 - 6.000 mg / L rispettivamente rame e zinco,. (D), (E) e (F) mostrano i risultati dell&#39;analisi di regressione per i metalli di ferro, rame e zinco, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. Cu, Fe e Zn Metalloproteome del cervello umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione degli standard di proteine ​​per ogni metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolare, indicato sotto il grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figura 4. Cu, Fe e Zn Metalloproteome per il plasma umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione delle norme proteiche per ciascun metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolaredicato sotto il grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

La cromatografia ad esclusione dimensionale con plasma accoppiato induttivamente - la spettrometria di massa (ICP-MS) è un potente strumento per misurare i cambiamenti nell'abbondanza di metalloproteine direttamente da campioni biologici. Qui descriviamo una serie di standard metalloproteici utilizzati per stimare la massa molecolare e la quantità di metallo associata a proteine sconosciute.

Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di quantificare diverse metalloproteine in standard complessi basandosi sull'uso di standard noti di metalloproteine. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali sul ruolo dei metalli in biologia. Ad esempio, come cambia lo stato metallico di una proteina in condizioni di malattia?Un vantaggio fondamentale di questa tecnica è che consente di misurare lo stato del metallo in una proteina nel suo stato nativo. La tecnica sarà dimostrata da Amber Lothian, studentessa di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, omogeneizzare i tessuti o i campioni di colture cellulari mediante passaggi manuali o sonicazione per cinque minuti utilizzando soluzione salina tamponata al Tris.Clarificare gli omogenati mediante centrifugazione a 16.000 ×g per cinque minuti. Dopo aver raccolto il sopranatante risultante, normalizzare la quantità totale di proteina determinando le concentrazioni proteiche come descritto nel protocollo del testo. Riscaldare e tarare lo spettrometro di massa con plasma accoppiato induttivamente, seguendo i protocolli del produttore.Diluire gli standard di metalloproteine per ottenere valori compresi nell'intervallo da zero a 500 microgrammi per litro, utilizzando acido nitrico all'uno per cento. Per ottenere standard in questo intervallo, non utilizzare diluizioni superiori a uno a venti. Impostare l'ordine delle iniezioni analizzando prima i sette livelli di calibrazione.Concentrazioni comprese tra zero e 500 microgrammi per litro, seguite dagli standard di metalloproteine. I sette livelli di calibrazione sono zero, uno, cinque, dieci, 50, 100 e 500 microgrammi per litro. Successivamente, selezionare gli elementi di interesse.Qui, utilizzare ferro, rame, zinco, cobalto e iodio, poiché sono gli elementi ai quali sono legati gli standard proteici. Selezionare gli elementi nel metodo di acquisizione aprendo la scheda del selettore di elementi e aggiungendo gli elementi e le masse isotopiche corrispondenti da analizzare.Quindi, eseguire l'analisi del campione con lo strumento. Il software dello strumento crea automaticamente le curve di calibrazione per ciascuno degli elementi analizzati. Utilizzare le curve di calibrazione per determinare la concentrazione del metallo nei campioni sconosciuti.Dai risultati dell'analisi su campione massivo, generare gli standard di metalloproteine che includono i tre elementi in tracce più abbondanti nei tessuti dei mammiferi, utilizzando una miscela di rame, superossido dismutasi a base di zinco e ferritina. Spurgare le pompe della cromatografia rapida ad alte prestazioni, o HPLC, con tampone di nitrato di ammonio 200 millimolare per cinque minuti a una portata di cinque millilitri al minuto. Una volta spurgato il sistema, impostare la portata a zero virgola uno millilitri al minuto.E collegare la colonna di esclusione laterale. Collegare l'estremità opposta della colonna al rivelatore UV, impostando la misura dell'assorbanza a 280 nanometri, utilizzando tubi per il picco. Aumentare gradualmente la portata della colonna a incrementi di zero virgola uno millilitri al minuto, fino a raggiungere una portata finale di zero virgola quattro millilitri al minuto.Nel frattempo, verificare i collegamenti dei tubi alla colonna per rilevare eventuali perdite. Monitorare la pressione del sistema per assicurarsi che non superi i limiti richiesti dalla colonna, osservando l'andamento della pressione nel cromatogramma visualizzato nel software. Lasciare la colonna in equilibrio al flusso richiesto per cinque-dieci volumi di colonna.Dopo l'equilibrazione, collegare gli strumenti per consentire l'analisi del campione. Impostare il metodo HPLC per pompare il tampone A sulla colonna a zero virgola quattro millilitri al minuto per 15 minuti. Posizionare l'ICPMS in modalità standby prima di modificare l'impostazione hardware.Una volta in modalità standby, spegnere la comunicazione per il campionatore automatico e cambiare l'introduzione del campione in un'altra modalità. Utilizzare un tubo in PEEK per collegare il flusso in uscita dal rivelatore UV direttamente al nebulizzatore dell'ICPMS. Accendere l'ICPMS e lasciare che lo strumento si riscaldi per 10-20 minuti.Dopo l'accensione del plasma, collegare il cavo remoto dello spettrometro di massa con plasma accoppiato induttivamente (ICPMS) sul retro del campionatore automatico dell'HPLC. Eseguire questa operazione solo dopo l'accensione del plasma. In caso contrario, il sistema HPLC si spegnerà automaticamente, poiché l'ICPMS non è acceso.Modificare il metodo ICPMS per raccogliere dati per LC-ICPMS cambiando innanzitutto il metodo di acquisizione da spettro a acquisizione risolta nel tempo. Successivamente, selezionare gli elementi da analizzare: ferro, rame, zinco, cobalto, iodio, così come qualsiasi altro elemento di interesse, e impostare i tempi di integrazione.Dopo aver selezionato gli elementi di interesse, regolare il tempo di acquisizione in modo da farlo corrispondere al tempo di corsa della cromatografia. Regolare manualmente l'ICPMS per la sensibilità e per le portate del gas elio nella cella di collisione, utilizzando un tampone cromatografico che scorre con cesio e antimonio inclusi nel tampone. Una volta che i conteggi degli ioni metallici si sono stabilizzati e i valori della deviazione standard relativa sono inferiori al cinque percento, il sistema è pronto per l'uso.Creare elenchi di esecuzione dei campioni sia nel software HPLC che in quello ICPMS. L'elenco di esecuzione dei campioni contiene l'ordine in cui ciascun campione deve essere iniettato, nonché il nome con cui verranno salvati i dati.Verificare che il numero totale di campioni nell'elenco corrisponda tra i due programmi. Avviare il lotto di campioni per lo spettrometro di massa con plasma accoppiato inductivamente (ICPMS) prima della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), poiché l'iniezione del campione da parte dell'HPLC attiverà l'ICPMS per iniziare l'acquisizione dei dati. Se questa procedura non viene eseguita nell'ordine corretto, si otterranno dati mancanti.Generare punti per la curva di calibrazione iniettando volumi variabili del campione standard misto di superossido dismutasi e ferritina. I volumi di iniezione variano da un microlitro a 30 microlitri. Infine, analizzare ciascun campione sconosciuto, come tessuto, plasma o coltura cellulare, prima di analizzare i dati come descritto nel protocollo testuale.L'illusione della ferritina su un intervallo compreso tra 2000 e 60.000 picogrammi di ferro iniettati sulla colonna è mostrata. È stata eseguita un'analisi di regressione utilizzando l'area del picco. I profili di illusione per rame, zinco e superossido dismutasi sono mostrati sia per il rame che per lo zinco.Anche le analisi di regressione generate utilizzando le aree dei picchi sono mostrate. I risultati dell'analisi di regressione vengono utilizzati per convertire i dati grezzi in conteggi al secondo in picogrammi al secondo, in modo che la quantità di metallo associata alla proteina possa essere determinata in modo quantitativo.Questa tecnica può essere utilizzata per identificare metallproteine in campioni biologici complessi. Qui viene mostrato un campione di cervello umano separato mediante SEC ICPMS. Ognuno dei quali rappresenta un diverso metallo di interesse.In particolare, rame, zinco o ferro. Qui mostrati sono i tracciati ottenuti quando il plasma umano viene sottoposto a questa tecnica. La complessità e l'abbondanza del campione influenzeranno il numero di picchi osservati.Come previsto, il plasma è dominato da alcune metalloproteine, tra cui ceruloplasmina e transferrina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come configurare uno strumento per misurare lo stato nativo delle metalloproteine in campioni complessi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata con successo in tre o quattro ore.Questo consente di analizzare da 20 a 36 campioni in un singolo giorno. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante utilizzare gli opportuni standard di metalloproteine, come la SOD rame-zinco se si è interessati a rame e zinco, oltre agli standard interni nel buffer, come il cesio, che permette di correggere eventuali deriva dello strumento nel tempo.Seguendo questa procedura, è possibile applicare anche altre forme di spettrometria di massa per rispondere a domande importanti. Ad esempio, quali sono le metalloproteine presenti nel mio campione? Questo può essere fatto mediante digestione standard e sequenziamento peptidico delle proteine tramite spettrometria di massa.In alternativa, analizzando le proteine intatte, nel loro stato nativo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrà aprire la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per comprendere il ruolo delle metalloproteine in malattie come il morbo di Alzheimer. Non dimenticare di lavorare con acido nitrico concentrato e campioni clinici.Deve essere indossata un'adeguata attrezzatura di protezione personale.

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