RNAi trigger consegna in

L'obiettivo generale di questo metodo è la somministrazione di inneschi di interferenza dell'RNA in Anopheles gambiae per avviare silenziamenti genici che iniziano durante lo stadio pupale dello sviluppo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dei vettori e a identificare geni coinvolti negli stadi di sviluppo pre-adulti o nei primi stadi dell'età adulta. Il principale vantaggio di questa tecnica è che offre ai ricercatori l'opportunità di effettuare studi funzionali rapidi a livello genomico, avviando il silenziamento genico durante l'intervallo di sviluppo, lo stadio pupale, in cui in passato non erano stati implementati protocolli di iniezione per l'interferenza dell'RNA.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché i passaggi dell'iniezione possono risultare difficili da padroneggiare a causa della precisione richiesta e della natura delicata delle pupe durante questa fase dello sviluppo. Dopo aver selezionato il gene di interesse, identificare una regione lunga da 200 a 800 paia di basi che si prevede non abbia effetti fuori bersaglio ed eseguire un'ampificazione PCR standard per ottenere un modello per la sintesi di RNA a doppio filamento, delimitato da una sequenza promotrice T7. Successivamente, sintetizzare l'RNA a doppio filamento e purificare i prodotti utilizzando un kit commerciale per sintesi in vitro.

Regolare la concentrazione finale di RNA a tre microgrammi per microlitro. Successivamente, utilizzare un comune gel di agarosio al 2% per confrontare mezzo microlitro di RNA a doppio filamento con il DNA stampo e marcatori standard. Dopo l'elettroforesi, verificare la qualità e la lunghezza della banda di RNA a doppio filamento.

Non dovrebbero essere presenti prodotti non specifici visibili. L'RNA a doppio filamento migrerà più lentamente del DNA stampo. Per la conservazione, preparare aliquote di RNA a doppio filamento e mantenerle a meno 20 gradi Celsius.

Cominciare preparando il colorante Fast Green FCF. In primo luogo, diluire il colorante al 0,1% in volume con acqua priva di RNasi. Successivamente, trasferire volumi di un microlitro della preparazione in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Riscaldare i tubi caricati a 65 gradi Celsius per circa tre ore per evaporare l'acqua. Successivamente, raffreddare i tubi per almeno 30 minuti prima di utilizzare i solidi del colorante. Poi, preparare aghi di vetro tirati per iniezione a partire da tubi di vetro borosilicato.

Impostare il tiratore di aghi su un diametro della punta compreso tra 10 e 30 micron. Per un tiratore di capillari NARISHIGE, impostare il primo riscaldatore su 100 e il secondo riscaldatore su 70. Quindi fissare l'ago capillare nel morsetto e procedere con il tiraggio.

Ora, preparare la stazione di iniezione. Selezionare una piattaforma che possa essere facilmente manovrata sotto il microscopio. Sulla piattaforma, fissare innanzitutto con del nastro un foglio di carta filtro spessa.

Successivamente, applicare con del nastro adesivo un filtro sottile sul filtro spesso. Poi, aggiungere ai tubi contenenti il colorante solido 10 microlitri di ciascun RNA a doppio filamento da iniettare e risospendere il colorante. Conservare questi tubi sul ghiaccio.

Ora, raccogliere le pupe da iniettare. Riempire una piastra di Petri da 60 millimetri con 10 millilitri di acqua deionizzata e trasferire circa 50 pupe di colore chiaro nella piastra, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Utilizzare esclusivamente pupe leggermente pigmentate, poiché le pupe che hanno già raggiunto livelli medi o scuri di indurimento cuticolare subiranno danni alla cuticola e avranno scarse percentuali di sopravvivenza.

Il primo passo per la microiniezione consiste nell'aprire l'ago. Sotto il microscopio, staccare l'estremità più distale dell'ago utilizzando pinzette fini. Successivamente, riempire l'ago con olio minerale utilizzando un ago da 30 gauge e una siringa.

Dopo aver riempito, espellere l'eccesso di olio utilizzando il microiniettore. Impostare il microiniettore in modo da aspirare volumi di 69 nanolitri. Successivamente, riempire anteriormente l'ago con l'RNA per iniezione preparato.

Verificare l'erogazione di RNA a doppio filamento per individuare eventuali problemi. L'otturazione della punta e gli aghi non adeguatamente fissati sono le principali cause di problemi. Una volta preparato l'injector, selezionare da uno a tre pupe e trasferirli sulla piastra di carta da filtro.

Utilizzando un pennello, posizionare la pupa in modo che la cuticola dorsale sia accessibile. Premendo sulla carta, verrà assorbita l'acqua in eccesso presente sulle pupe. Mantenendo ferma la pupa con un pennello umido, inserire l'ago nella cuticola dorsale tra l'addome e il torace, con un movimento da anteriore a posteriore e a un angolo di circa 30 gradi.

Quindi, iniettare uno o due impulsi di RNA a doppio filamento nell'emolinfa. La dispersione del colorante in tutto il corpo dovrebbe essere visibile se l'iniezione ha avuto successo. Durante l'iniezione nella pupa, è fondamentale che l'ago perfori soltanto la cuticola dorsale.

Se la puntura dell'ago attraversa la cuticola ventrale, si osserverà un accumulo di liquido marcato con colorante all'esterno della pupa, oppure il colorante si trasferirà sulla carta filtrante. In tali casi, la pupa deve essere scartata. Se il colorante non si distribuisce in tutto l'emolinfa, è molto probabile che la punta sia ostruita.

Spostare leggermente la punta e verificare se si è verificato il rilascio di RNA e colorante. Se non vi è alcun segno di rilascio del colorante, scartare la pupa. Successivamente, valutare la punta dell'ago ed eseguire un'altra iniezione su una nuova pupa.

Dopo aver iniettato con successo una pupa, utilizzare un pennello umido per staccarla delicatamente dall'ago ed immergerla nella piastra contenente acqua, dove completerà lo sviluppo. Posizionare la piastra con le pupe iniettate in una gabbia per zanzare o in un contenitore, nelle normali condizioni di allevamento. Come fonte alimentare per gli adulti, fornire una soluzione di glucosio al 10% (peso/volume) assorbita in una pallina di cotone.

Dopo l'ematizzazione degli adulti, confrontarli con i controlli. Ad esempio, gli insetti SRPN2 a doppio filamento devono essere valutati quotidianamente per la formazione di pseudotumori. A tale scopo, raffreddare gli adulti per due o tre minuti a meno 20 gradi Celsius e trasferirli su una piastra fredda a due gradi Celsius per l'osservazione.

Dopo aver osservato gli adulti, riporli nell'area di allevamento dell'insettaio. Una volta acquisita la tecnica, le pupe iniettate sono emerse con una frequenza di circa il 70%. In un sottoinsieme delle pupe iniettate, si è verificata un'emergenza parziale dallo sclerocisto, portando a zanzare non vitali. Non vi è stato alcun ritardo nei tassi di emergenza tra zanzare iniettate e non iniettate, e gli effetti dell'iniezione non sono variati in base al sesso.

Dieci giorni dopo l'eclosione, non si è osservato alcun cambiamento significativo nella sopravvivenza delle zanzare iniettate rispetto ai controlli non iniettati. L'inibitore della proteasi a serina, SRPN2, è stato utilizzato come controllo positivo, mentre il LacZ a doppio filamento è stato utilizzato come controllo negativo per le iniezioni di RNA a doppio filamento. Entro tre giorni dall'eclosione, i pseudotumori negli adulti iniettati con SRPN2 a doppio filamento erano evidenti mediante microscopia ottica.

Dopo otto giorni, i pseudotumori erano molto evidenti. Negli insetti adulti, i pseudotumori melanici erano osservabili attraverso la cuticola nella maggior parte degli animali iniettati con SRPN2 a doppio filamento, mentre nessun pseudotumore era osservabile nei controlli. A cinque giorni dall'iniezione, i livelli della proteina SRPN2 erano significativamente più bassi nelle zanzare iniettate con SRPN2 a doppio filamento, rispetto ai controlli iniettati con LacZ a doppio filamento e ai controlli non iniettati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la somministrazione di inneschi per l'interferenza dell'RNA in pupa di Anopheles gambiae, utilizzando questo protocollo di iniezione recentemente sviluppato. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa del movimento imprevedibile della pupa. Tuttavia, esercitarsi nella corretta posizione e stabilizzazione della pupa migliora notevolmente il tasso di successo delle iniezioni, nonché la qualità dell'iniezione.

Una volta padroneggiata la tecnica, queste iniezioni richiedono circa 30 secondi per ogni pupa. Con lo sviluppo di questa tecnica, abbiamo aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei vettori per esplorare e valutare la funzione genica durante le fasi di sviluppo pre-adulte e quelle iniziali dell'adulto nel vettore della malaria Anopheles gambiae. Dopo questa procedura, altri metodi come l'analisi mediante Western blot o la PCR quantitativa possono essere eseguiti per determinare il grado di silenziamento del gene bersaglio a livello di espressione proteica o trascrizionale, rispettivamente.

In definitiva, questa tecnica può aiutare a identificare i geni fondamentali per la trasmissione del parassita da parte delle zanzare, e questo approccio ci aiuterà a individuare nuovi bersagli e a ottenere nuove informazioni su come possiamo sviluppare strategie di controllo dei vettori più efficaci.