RNAi trigger consegna in Anopheles gambiae Pupe

L'obiettivo generale di questo metodo è la somministrazione di trigger di interferenza dell'RNA in Anopheles gambiae per avviare knockdown genici che iniziano durante la fase di sviluppo pupale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei vettori e scoprire i geni che svolgono un ruolo durante le fasi di sviluppo pre-adulto o precoce. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre ai ricercatori l'opportunità di eseguire rapidi studi di genomica funzionale, iniziando il knockdown del gene durante l'intervallo di sviluppo, lo stadio pupale, quando i protocolli di iniezione di interferenza dell'RNA non sono stati implementati in passato.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di iniezione possono essere difficili da padroneggiare a causa della precisione richiesta e della natura delicata delle pupe durante questa fase di sviluppo. Dopo aver selezionato il gene di interesse, identificare una regione da 200 a 800 coppie di basi che si prevede non abbia effetti fuori bersaglio ed eseguire l'amplificazione PCR standard per ottenere un modello di sintesi di RNA a doppio filamento affiancato da una sequenza di promotore T7. Quindi sintetizzare l'RNA a doppio filamento e ripulire i prodotti utilizzando un kit commerciale in vitro.

Regolare la concentrazione finale di RNA a tre microgrammi per microlitro. Successivamente, utilizzare un gel di agarosio standard al 2% per confrontare mezzo microlitro di RNA a doppio filamento con il DNA stampo e i marcatori standard. Una volta esaurita, controllare la qualità e la lunghezza della banda di RNA a doppio filamento.

Non dovrebbero esserci prodotti non specifici visibili. L'RNA a doppio filamento migrerà più lentamente del DNA stampo. Per la conservazione, preparare aliquote di RNA a doppio filamento e mantenerle a meno 20 gradi Celsius.

Inizia con la preparazione del colorante Fast Green FCF. Innanzitutto, diluire il colorante allo 0,1% in volume in acqua priva di RNasi. Quindi, trasferire un microlitro di volumi del preparato in provette per microfuge da 1,5 millilitri.

Riscaldare i tubi caricati a 65 gradi Celsius per circa tre ore per far evaporare l'acqua. Quindi raffreddare i tubi per almeno 30 minuti prima di utilizzare i solidi coloranti. Quindi, preparare gli aghi per iniezione di vetro estratti da tubi di vetro borosilicato.

Impostare l'estrattore dell'ago per un diametro della punta compreso tra 10 e 30 micron. Per un estrattore capillare NARISHIGE, impostare il primo riscaldatore su 100 e il secondo riscaldatore su 70. Quindi bloccare l'ago capillare e procedere con la trazione.

Ora, prepara la stazione di iniezione. Seleziona una piattaforma che possa essere facilmente manovrata al microscopio. Sulla piattaforma, per prima cosa stendi con del nastro adesivo una carta da filtro spessa.

Quindi, sulla carta da filtro spessa, fissare con del nastro adesivo una carta da filtro sottile. Successivamente, ai tubi solidi del colorante, aggiungere 10 microlitri di ciascun RNA a doppio filamento da iniettare e risospendere il colorante. Conservare questi tubi sul ghiaccio.

Ora, raccogli le pupe da iniettare. Riempi una capsula di Petri da 60 millimetri con 10 millilitri di acqua deionizzata e trasferisci circa 50 pupe di colore chiaro nella capsula, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Utilizzare solo pupe leggermente pigmentate, poiché le pupe che hanno già raggiunto livelli di abbronzatura medio-scuri subiranno danni alle cuticole e avranno scarsi tassi di sopravvivenza.

Il primo passo per la microiniezione è aprire l'ago. Al microscopio, rompere la punta molto distale dell'ago usando una pinza fine. Quindi riempire nuovamente l'ago con olio minerale utilizzando un ago calibro 30 e una siringa.

Una volta riempito, espellere l'olio in eccesso utilizzando il microiniettore. Impostare il microiniettore per estrarre volumi di 69 nanolitri. Quindi, riempire frontalmente l'ago con l'RNA di iniezione preparato.

Testare l'erogazione di RNA a doppio filamento per individuare eventuali problemi. L'ostruzione della punta e gli aghi fissati in modo inadeguato sono le principali fonti di problemi. Una volta preparato l'iniettore, prelevare da una a tre pupe e trasferirle allo stadio di carta da filtro.

Usando un pennello, orientare la pupa in modo che la cuticola dorsale sia accessibile. Premendo sulla carta, l'acqua in eccesso sulle pupe verrà assorbita. Mantenendo ferma la pupa con un pennello bagnato, usa un movimento da anteriore a posteriore per inserire l'ago nella sua cuticola dorsale tra l'addome e il torace, con un angolo di circa 30 gradi.

Quindi, iniettare uno o due impulsi di RNA a doppio filamento nell'emolinfa. La dispersione del colorante in tutto il corpo dovrebbe essere visibile se l'iniezione è riuscita. Durante l'iniezione della pupa, è fondamentale che l'ago fori solo la cuticola dorsale.

Se la puntura dell'ago si estende attraverso la cuticola ventrale, il ristagno di liquido etichettato con il colorante sarà evidente all'esterno della pupa, oppure il colorante si trasferirà sulla carta da filtro. In questi casi, la pupa deve essere scartata. Se il colorante non si distribuisce in tutta l'emolinfa, è molto probabile che la punta sia ostruita.

Muovi leggermente la punta e determina se si è verificato un rilascio di RNA e colorante. Se non ci sono indicazioni di rilascio di colorante, scartare la pupa. Quindi, valuta la punta dell'ago ed esegui un'altra iniezione su una nuova pupa.

Dopo aver iniettato con successo una pupa, usa il pennello bagnato per liberarla delicatamente dall'ago e spostarla nel piatto d'acqua dove completerà lo sviluppo. Metti il piatto di pupe iniettate in una gabbia o contenitore per zanzare in normali condizioni di allevamento. Per una fonte di cibo per adulti, fornire glucosio in una soluzione al 10% in peso per volume imbevuta di un batuffolo di cotone.

Dopo che gli adulti sono emersi, confrontali con i controlli. Ad esempio, gli insetti SRPN2 a doppio filamento dovrebbero essere valutati quotidianamente per la formazione di pseudotumori. Per fare questo, raffredda gli adulti per due o tre minuti a meno 20 gradi Celsius e trasferiscili su una piastra fredda a due gradi Celsius per la visualizzazione.

Dopo aver visto gli adulti, riportali nell'area di allevamento degli insetti. Una volta padroneggiata la tecnica, le pupe iniettate sono emerse con una frequenza di circa il 70%In un sottogruppo delle pupe iniettate, si è verificata un'emergenza parziale dal caso pupale, portando a zanzare invisibili. Non c'è stato alcun ritardo nei tassi di emergenza tra le zanzare iniettate e non iniettate e gli impatti dell'iniezione non variavano in base al sesso.

Dieci giorni dopo l'emergenza, non c'è stato alcun cambiamento notevole nella sopravvivenza delle zanzare iniettate rispetto ai controlli non iniettati. L'inibitore della serina proteasi, SRPN2, è stato utilizzato come controllo positivo e il LacZ a doppio filamento è stato utilizzato come controllo negativo per le iniezioni di RNA a doppio filamento. Entro tre giorni dall'emergenza, gli pseudotumori negli adulti iniettati con SRPN2 a doppio filamento erano evidenti tramite microscopia ottica.

Dopo otto giorni, gli pseudotumori erano molto evidenti. Nelle zanzare allo stadio adulto, gli pseudotumori melanotici erano osservabili attraverso la cuticola della maggior parte degli animali iniettati con SRPN2 a doppio filamento, mentre non erano osservabili pseudotumori nei controlli. Cinque giorni dopo l'iniezione, i livelli di proteina SRPN2 erano significativamente più bassi nelle zanzare iniettate con SRPN2 a doppio filamento, rispetto ai controlli iniettati con LacZ a doppio filamento e ai controlli non iniettati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la consegna dell'innesco dell'interferenza dell'RNA nelle pupe di Anopheles gambiae, utilizzando questo protocollo di iniezione di nuova concezione. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa del movimento imprevedibile della pupa. Tuttavia, praticare il corretto posizionamento e stabilizzazione della pupa migliora notevolmente il tasso di successo dell'iniezione, nonché la qualità dell'iniezione.

Una volta padroneggiata la tecnica, queste iniezioni richiedono circa 30 secondi per pupa. Con lo sviluppo di questa tecnica, abbiamo aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei vettori per esplorare e valutare la funzione genica durante le fasi di sviluppo pre-adulto e della prima età adulta nel vettore della malaria Anopheles gambiae. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi Western blot o la PCR quantitativa per determinare l'entità del knockdown del gene bersaglio a livello di espressione proteica o trascritta, rispettivamente.

In definitiva, questa tecnica può aiutare a identificare i geni che sono critici per la trasmissione dei parassiti da parte delle zanzare e questo approccio ci aiuterà a identificare nuovi bersagli e fornire nuove intuizioni su come creare strategie di controllo dei vettori più efficaci.