Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Descriviamo un metodo relativamente semplice per ex vivo l'imaging dal vivo del tumore interazioni cellula-stroma all'interno di metastasi polmonari, utilizzando i reporter fluorescenti nei topi. Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, questa tecnica consente la visualizzazione di cellule vive per almeno 4 ore e potrebbe essere adattato per studiare altre malattie polmonari infiammatorie.

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le interazioni dinamiche dello stroma delle cellule tumorali all'interno delle metastasi polmonari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi del cancro, ad esempio come si stabiliscono le metastasi e quali tipi di cellule all'interno del microambiente sono coinvolti in questo processo? Il vantaggio principale offerto da questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice e veloce per l'imaging polmonare ex vivo che consente la visualizzazione di cellule vive per almeno quattro ore. Questa tecnica potrebbe aver migliorato la nostra comprensione dei meccanismi d'azione di varie terapie mirate per il trattamento delle metastasi polmonari. Abbiamo avuto un'idea per questa metodica quando stavamo esaminando le metastasi mediante imaging della sezione polmonare e stavamo lottando con un'estesa morte cellulare a seguito di questa procedura. Per preparare i polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo, inizia immobilizzando il topo su un coperchio di polistirene espanso coperto con un pezzo di ammollo e sterilizza l'animale con etanolo al 70%. Successivamente, usando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione epigastrica trasversale attraverso la pelle, seguita da un'incisione simile attraverso il peritoneo. Quindi, spostando la tavola di dissezione in posizione verticale, tagliare l'aorta discendente, in modo che il sangue si accumuli nell'addome e non nella cavità toracica. Taglia la piccola apertura nel diaframma per rilasciare il vuoto. Quindi, tagliare lungo la gabbia toracica per asportare il diaframma e visualizzare i polmoni. Usando le forbici chirurgiche, tagliare la pelle fino alla trachea sopra la gabbia toracica lasciando intatte le costole. Quindi, separare la pelle dalla gabbia toracica e rimuovere il tessuto connettivo circostante per esporre la trachea, facendo attenzione a non danneggiare la trachea stessa. Tagliare una piccola apertura di circa un millimetro di diametro nella trachea esposta, parallela agli anelli cartilaginei il più vicino possibile alla laringe senza tagliare completamente la trachea. Quindi, inserire delicatamente un ago calibro 20 da quattro a cinque millimetri nella trachea senza alcuna forza contraria. L'estremità dell'ago dovrebbe essere visibile attraverso la trachea. Riempire una siringa con 400 microlitri di agarosio a 37 gradi Celsius al 2% a bassa temperatura di fusione, quindi stabilizzare l'ago con una pinza. Mantenendo la tavola di dissezione verticale, instillare lentamente l'intera quantità di agarosio caldo attraverso l'ago nei polmoni. Una volta che i polmoni sono gonfiati, staccare la siringa mantenendo l'ago all'interno della trachea e versare circa 50 millilitri di PBS a 20 gradi Celsius sui polmoni per aiutare a fissare l'agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere l'ago e utilizzare una pinza per chiudere la trachea per evitare la fuoriuscita di agarosio non solidificato. Ora, apri ulteriormente il torace con la sternotomia e afferra la trachea con una pinza. Quindi, usando un paio di forbici chirurgiche, taglia completamente la trachea. Per rimuovere i polmoni, tirare delicatamente la trachea verso l'alto, tagliare il tessuto connettivo e l'esofago ed estrarre completamente i polmoni dalla cavità toracica. Immergere il fazzoletto a 37 gradi Celsius RPMI 1640 per lavare via il sangue in eccesso. Usando forbici e pinze, taglia i lobi