Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di effettuare osservazioni quantificabili della presenza temporale e spaziale della fushion della vescicola esocitica neuronale e della ramificazione degli assoni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come quando e dove la fusione delle vescicole inserisce il materiale della membrana nella membrana plasmatica in espansione durante lo sviluppo neuronale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina l'imaging di cellule vive per acquisire sia un'elevata risoluzione spaziale e temporale in singole cellule che approcci biochimici per acquisire informazioni basate sulla popolazione.

Dopo aver coltivato e simulato i neuroni corticali con Netrin-1 o un controllo secondo il testo del protocollo. Aspirare il PBS dal primo pozzetto di una condizione e sostituirlo con 250 microlitri di tampone di omogeneizzazione. Incubare su ghiaccio per cinque minuti, quindi utilizzare un sollevatore cellulare, omogeneizzare le cellule su ghiaccio.

Aspirare il PBS dal pozzetto successivo della stessa condizione e aggiungere la miscela recentemente omogeneizzata al pozzetto che aumenterà le concentrazioni proteiche. Quindi, trasferire la soluzione omogeneizzata in una provetta per microfuge pre-raffreddata da 1,6 millilitri su ghiaccio e aggiungere il 20% di Triton X-100 per raggiungere una concentrazione finale dell'1%Quindi, con una pipetta da 1.000 microlitri, triturare la miscela dieci volte riducendo al minimo le bolle. Incubare le provette con ghiaccio per due minuti per solubilizzare le proteine.

Quindi centrifugare a 6,010 RCF a 4 gradi Celsius per 10 minuti per pellettare il materiale non solubilizzato. Trasferire il surnatante allo stato di lie in un nuovo tubo raffreddato da 1,6 millilitri su ghiaccio. Successivamente, utilizzare il test di Bradford per determinare la concentrazione proteica.

Quindi, utilizzare il tampone di omogeneizzazione con Triton X-100 all'1% e il tampone campione 5X integrato con BME per diluire i campioni a una concentrazione finale di 3-5 milligrammi per millilitro. Dividere ogni campione sperimentale in modo uniforme in due provette. Quindi incubare un campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti e l'altro a 100 gradi Celsius per 30 minuti.

Capovolgere le provette in modo intermittente per mantenere i campioni in soluzione. Quindi eseguire la pagina SDS e il Western blotting secondo il protocollo di testo. Dopo aver impostato il microscopio TIRF e il campione e aver trovato un piano focale neuronale secondo il protocollo di testo.

Avviare il software del laser e collegarlo al software di controllo del laser. Impostare l'illuminazione su campo ampio e selezionare l'obiettivo. Quindi impostare l'indice di rifrazione del campione e regolare l'intensità del laser deselezionando TTL per il laser 491.

L'ottimizzazione dei parametri di imaging è importante durante l'imaging di vescicole esocitiche intatte sul pavimento per evitare la deriva della messa a fuoco e la fototossicità, producendo immagini con un elevato rapporto segnale/rumore sufficiente per l'analisi. Regolare il cursore su 100 e quindi riportarlo a un valore compreso tra 20 e 40. Quindi ricontrolla il TTL.

Quindi, concentrarsi nuovamente sul campione in illuminazione a luce trasmessa. Quindi, nel software di imaging, selezionare l'illuminazione laser 491 e aprire l'otturatore. Posizionare il condensatore capovolto sul banco ottico in modo da non graffiare la lente.

Regolare con precisione il punto focale del laser sul soffitto e, con il condensatore rimosso, centrare il punto al centro del diaframma a campo chiuso. Quindi sostituire il condensatore e nel software TIRF inviare la profondità di penetrazione a 110 nanometri. Quindi passa dall'illuminazione ad ampio campo alla modalità di illuminazione TIRF per l'imaging.

Ora, utilizzando l'epifluorescenza ad ampio campo, trova le cellule che esprimono il fluorescenza VAMP2 attraverso gli oculari. Quindi, per ridurre il fotobleaching e la fototossicità, regolare i parametri di imaging per massimizzare il rapporto segnale/rumore e la gamma dinamica utilizzando un tempo di esposizione e un'intensità laser minimi. Impostare la messa a fuoco automatica continua per cella.

Quindi acquisire un set di immagini time lapse con acquisizione che avviene ogni 0,5 secondi per cinque minuti. Per la condizione di stimolazione di Netrin-1 in una cappa a flusso laminare, aggiungere a una concentrazione finale di 500 nanogrammi per millilitro di Netrin-1 a una piastra di cellule e rimettere la piastra nell'incubatore per un'ora prima dell'imaging. Quantificare la frequenza degli eventi esocitici normalizzati per area cellulare e tempo.

In ImageJ, aprire le pile di immagini trascinando il file nella finestra o scegliendo File, Apri, nome file. Per rimuovere i segnali fluorescenti stabili che non rappresentano eventi di fusione delle vescicole, utilizzare Immagine, Stack, Progetto Z, Tipo di proiezione Intensità media. Per creare una proiezione Z media dell'intera pila.

Sottrai l'immagine media risultante da ciascuna immagine nel timelapse utilizzando Processo, Calcolatore di immagini, Immagine 1 la tua pila, Operazione Sottrai immagine due. Il risultato è una proiezione Z appena creata. Questo enfatizzerà gli eventi esocitici.

Ora, a occhio, contare gli eventi di fushion esocitico, che possono essere identificati come punti di segnali fluorescenti limitati dalla diffrazione che si diffondono rapidamente quando il fluoren VAMP2 si diffonde all'interno della membrana plasmatica. Evidenzia la prima immagine con Immagine, Regola, Soglia e regola il cursore fino a quando l'intera cella non viene evidenziata. Quindi, in Analizza, scegli Imposta misurazioni e controlla l'area e l'etichetta di visualizzazione.

Con lo strumento di tracciamento della bacchetta, impostare l'area cellulare con soglia e premere M per misurare. Trasferisci i dati raccolti su un foglio di calcolo secondo il protocollo di testo. Dopo due giorni in vitro, posizionare la capsula di imaging con fondo di vetro contenente neuroni non trasfettati in una camera ambientale umida pre-riscaldata.

Utilizza un microscopio dotato di un obiettivo a sei piani DX apocromatico 1.4 NA DIC e di un condensatore ad alta apertura numerica per la migliore qualità e risoluzione dell'immagine. Successivamente, con l'illuminazione a luce trasmessa, regolare il piano focale per trovare i neuroni attraverso gli oculari. Per l'imaging DIC della ramificazione degli assoni, la corretta impostazione dell'illuminazione del dispositivo di raffreddamento sarà fondamentale per l'ottimizzazione dell'immagine ed è fondamentale per produrre risultati analizzabili.

Quindi, con i neuroni di interesse all'interno del campo visivo, utilizzare la funzione di acquisizione multi-area nel software di imaging per trovare e salvare le posizioni XYZ di almeno sei cellule. Ora, aggiungere a una concentrazione finale di 250 nanogrammi per millilitro di Netrin-1 o altro fattore di interesse per simulare le cellule e premere start acquisizione multi-area. Acquisisci in sequenza le immagini in ogni posizione ogni 20 secondi per 24 ore.

Mettere in pausa l'acquisizione e rifocalizzare la focalizzazione se necessario. All'interno del software di imaging, rivedere le immagini scegliendo App, Rivedi dati multidimensionali e aprire il file desiderato. Identificare i rami stabili degli assoni che si sono formati durante la sessione di imaging.

Utilizzare lo strumento regione di traccia per misurare un ramo stabile dell'assone dalla base dell'assone alla punta. Dopo aver trattato i neuroni con Netrin e tossina botulinica e fissazione e immunocolorazione, e immunocolorazione per beta-3 tubolina e actina secondo il protocollo di testo. Utilizzare un microscopio invertito per raccogliere immagini di epifluorescenza ad ampio campo.

Apri una pila di immagini in ImageJ e per analizzare manualmente la linea ramificata usi, la linea segmentata e traccia l'assone che è definito come il neurite più lungo che si estende dal soma. Con Analizza, Strumenti, ROI Manager, salva il tracciamento degli assoni come regione di interesse. Quindi traccia e salva ogni ramo dell'assone, che è definito come un neurite maggiore o uguale a 20 micrometri di lunghezza.

Includere nell'analisi solo i rami primari. Qui è mostrato un Western blot dopo il completamento del test del complesso SNARE resistente alla SDS. Sondato per SNAP25, Syntaxin 1A e VAMP2.

Le proteine SNARE in complesso, un monomero identificabile sono mostrate qui. Un esempio di un evento esocitico mediato dal fluroen VAMP2 che si verifica nel tempo in un neurone corticale è mostrato qui. Gli inserti ingranditi denotano il soma, un ramo assonale e un cono di crescita assonale che mostrano l'utilità spaziale di questo test.

I cerchi fanno esplodere singoli eventi di fusione esocitica, che possono essere visti tramite la microscopia TIRF. Questa imaging DIC time lapse mostra la formazione stimolata da Netrin di un ramo dell'assone in tempo reale. Queste posizioni indicano la sporgenza iniziale da un sito di diramazione.

Questi rappresentano rami stabili completamente formati di almeno 20 micrometri misurati dall'assone principale alla punta del ramo. In questo esperimento, i neuroni corticali a 3 DIV sono stati trattati con Netrin-1, che stimola la ramificazione, o con la tossina botulinica A, che scinde SNAP25, un componente del complesso SNARE e blocca l'esocitosi. I risultati dimostrano che l'esocitosi mediata da SNARE è necessaria per la ramificazione Netrin dipendente.

Una volta padroneggiato, l'imaging DIC può essere completato in un'unica sessione di imaging notturna. L'imaging TIRF dei singoli eventi esocitici può essere gestito in 4-5 ore. Il protocollo di biochimica della formazione complessa SNARE può essere eseguito in due ore.

Durante il tentativo di queste procedure, è importante ricordarsi di tenere il ritmo e di non affrettare ogni singolo passo. Ogni procedura richiede attenzione e pazienza per ottenere i migliori risultati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la cotrasfezione di componenti di vescicole marcate con carichi candidati etichettati per rispondere a ulteriori domande.

Ad esempio, qual è il carico delle vescicole esocitiche? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la neuritogenesi, la ramificazione degli assoni e altre fasi della morfogensi in qualsiasi coltura neuronale dissociata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare e quantificare la natura spaziale e temporale degli eventi di fusione delle vescicole esocitiche neuronali corrispondenti ai cambiamenti nella morfogenesi neuronale.

Non dimenticare che lavorare con la tossina botulinica o con laser ad alta potenza può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare indumenti di sicurezza adeguati e utilizzare il meccanismo di blocco di sicurezza del microscopio.