Name: Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Scopri metodi combinati di microscopia e biochimica per studiare l'esocitosi SNARE nella ramificazione assonale dipendente da Netrin-1 nei neuroni corticali. Questa tecnica consente analisi spaziali e temporali ad alta risoluzione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) e F31-NS087837 (CW).

Dichiarazione di etica della ricerca: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali descritti nel presente documento sono soggetti alle norme e ai regolamenti del Comitato UNC sulla cura degli animali e agli standard NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Preparazione e placcatura di dissociato neuroni corticali <ol><li> Euthanize femmine tempestivi incinta di CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale. Rimuovere cervelli interi dai teschi dei embrionali giorno 15,5 (E15.5) topi e microdissect cortecce da ciascun emisfero. Per le istruzioni dettagliate per quanto riguarda la microdissezione della corteccia embrionali di topo vedere Viesselmann et al 8. </li><li> Mettere non più di 4 cortecce in 1 ml di media sezionare in una sterile 1,6 ml provetta. Aggiungere 120 ml di 10x tripsina e capovolgere il tubo 3 - 5 volte per mescolare. </li><li> Utilizzando un emocitometro, contano le cellule alle sementi piatti di coltura cellulare. Nota: 1 emisfero corticale fornisce approximately tre milioni di cellule. <ol><li> Per il saggio biochimico complesso SNARE SDS-resistente, piatto sei milioni di cellule per piastra da 35 mm e di utilizzare due piatti per ogni condizione. Nota: Questo è semplificata utilizzando 6 pozzetti quando si confrontano più condizioni. </li><li> Per i saggi di ramificazione, neuroni piastra di acido nitrico lavati coprioggetto circolare ad una densità di 250.000 cellule per piastra da 35 mm, DIC imaging piastra assone ramificazione ad una densità di 150.000. Questi densità di evitare il sovraffollamento e semplificano l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Per vivere la microscopia TIRF cellulare, risospendere due milioni di neuroni per trasfezione in nucleofection soluzione a temperatura ambiente. <ol><li> Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare per provetta contenente 10 mg di VAMP2-pHlourin plasmide di espressione e l&#39;elettroporazione con un Nucleofector secondo il fornitore protocollo 9. </li><li> Dopo trasfezioni aggiungere immediatamente 500 ml di mezzi tripsina tempra, rimuovere la sospensione dalle cellule cuvetta e piastra in un covosità di 400.000 cellule per 35 millimetri piatto fondo di vetro PDL rivestite. </li></ol></li><li> Piastra tutti i neuroni corticali in 2 ml di media liberi siero. </li></ol> 2. SNARE complesso formazione Assay Nota: i complessi SNARE SDS-resistenti sono stati elaborati ed analizzati come originariamente descritto 10 con le modifiche descritte di seguito. Per gli anticorpi alternativi convalidati a quelli usati qui, vedere la sezione materiali. <ol><li> Stimolare i neuroni corticali E15.5 2 giorni in vitro (DIV) con 250 / ml netrina-1 o sham controllo ng per 1 ora prima di lisi. </li><li> Prima di trattare campioni, centrifuga raffreddare a 4 ° C, e impostare la temperatura bagnomaria a 37 ° C, e blocco termico a 100 ° C. </li><li> Rimuovere piatti cellule da incubatore e disporli sul ghiaccio. <ol><li> Aspirare il terreno dalle cellule, sostituirli con ~ 2 ml di ghiaccio freddo fosfato salina tamponata (PBS) delicatamente 2 volte per 1 - 2 min a lavaggio. </li><li> Per questo test, utilizzare 2 pozzi per condition. </li><li> Aspirare PBS dal primo pozzo di una condizione e sostituire con 250 microlitri tampone di omogeneizzazione. Lasciare in ghiaccio per 5 minuti, e quindi utilizzando un sollevatore cellulare, omogeneizzare le cellule in ghiaccio. </li><li> Aspirare il PBS dal pozzo successivo della stessa condizione e aggiungere la miscela recentemente omogeneizzato al pozzo. Ciò consentirà di aumentare le concentrazioni di proteine. Ripetere l&#39;operazione per tutte le condizioni. </li><li> Al termine, pipetta omogeneizzata soluzione di un pre-raffreddata 1.6 ml provetta su ghiaccio e aggiungere 20% TritonX-100 per ottenere una concentrazione finale di 1% TritonX-100. Triturare mescolare 10 volte con 1.000 ml pipetta, riducendo al minimo le bolle. </li></ol></li><li> Incubare le provette in ghiaccio per 2 minuti per solubilizzare le proteine. Dopo l&#39;incubazione, centrifugare per 10 minuti a 6.010 rcf a 4 ° C a pellet materiale non solubilizzata. Spostare il surnatante lisato nella nuova raffreddata provetta 1.6 ml su ghiaccio. </li><li> Eseguire l&#39;analisi concentrazione di proteine ​​usando Bradford test 11 e diluire campioni ad un finaconcentrazione proteica l da 3 - 5 mg / ml con tampone di omogeneizzazione restante supplementato con 1% TritonX-100 e tampone 5x supplementato con B-Mercaptethanol (BME). </li><li> Dividere ogni campione sperimentale in modo uniforme in 2 tubi. Incubare un campione a 37 ° C per 30 min (SNARE complessi), e l&#39;altro a 100 ° C per 30 min (monomeri SNARE). Capovolgere i tubi in modo intermittente per mantenere i campioni in soluzione. </li><li> Congelare i campioni a -20 ° C fino al momento di separare tramite SDS-PAGE. Prima di eseguire campioni tramite elettroforesi utilizzando tecniche standard, ribollitura campioni precedentemente bolliti per 5 minuti a 100 ° C, ma scongelare 37 ° C campioni a temperatura ambiente. </li><li> duplicati Run di campioni (30 - 40 mg di proteine ​​per campione) sia un 8% e un gel 15%; l&#39;8% prevede la separazione ideale del complesso, mentre il 15% viene utilizzato per quantificare monomeri di proteine ​​SNARE (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa). Mantenere fonte di alimentazione a 70 V fino a quando la linea di tintura è attraverso il stacre gel e tensione di aumento a 90V. Eseguire gel fino a quando il colorante corre via. </li><li> Per conservare monomeri, trasferire proteine ​​a 0,2 micron membrana di nitrocellulosa sul ghiaccio con tampone di trasferimento a freddo con il 20% di metanolo (MeOH) aggiunto, a 70 V per 45 min. </li><li> Membrana secco in un piatto coperto per 2 ore a O / N a RT (O / N fornisce i risultati migliori). </li><li> Block SNARE membrane complessi a 10% di sieroalbumina bovina (BSA) per 1 ora a RT. </li><li> Preparare anticorpi primari (che riconoscono specifici componenti complessi militare) alla diluizione di 1: 1.000 e sonda O / N a 4 ° C in un agitatore rotativo. <ol><li> Risciacquare macchie in Tris Buffered Saline più 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 volte per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Preparare soluzioni fluorescenti anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 20.000 in 1% BSA in TBS-T e sonda per 1 ora, coperta a RT. Ripetere il punto 2.12.1 dopo 1 ora. </li><li> Immagine Macchie su una macchina di scansione a fluorescenza dotato di suite di software e quantificare sia il co proteina SNAREmplex (bande immunoreattive sopra 40kDa) e fasce monomero (bande immunoreattive a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa per SNAP-25, VAMP2 e syntaxin-1, rispettivamente) utilizzando le istruzioni del produttore per il disegno ROI rettangolari. </li></ol> 3. Imaging esocitica Eventi tramite microscopia TIRF Nota: Questo protocollo richiede attrezzature microscopia specializzata compresa una camera ambientale per mantenere la temperatura, l&#39;umidità e CO 2, un microscopio TIRF invertito equipaggiato con un&#39;illuminazione epifluorescente, a / alta apertura numerica (NA) dell&#39;obiettivo TIRF alto ingrandimento, una fase automatizzata XYZ, e un sensibile Charge Coupled Device (CCD) rivelatore. Questo protocollo utilizza un microscopio rovesciato completamente automatizzato dotato di un obiettivo di un Solid State 491 nm laser 100x 1.49NA TIRF e un Moltiplicando CCD Electron (EM-CCD). Tutta l&#39;apparecchiatura è controllata da imaging e controllo laser software. Prima dell&#39;inizio della potenza protocollo di imaging sul envirambientali sotto camera, palcoscenico, lampada, computer e macchina fotografica. <ol><li> Selezionare obiettivo all&#39;interno del software di imaging. Una volta che l&#39;obiettivo è in posizione, fissare il riscaldatore obiettivo intorno al collare. </li><li> Verificare che l&#39;obiettivo è abbassato completamente prima di fissare l&#39;incubatrice fase nello slot fase. Versare l&#39;acqua distillata nelle insenature fase di incubazione in modo uniforme per evitare fuoriuscita. </li><li> Accendere il sistema di incubazione. Aprire la valvola al serbatoio di CO 2 e confermare la pressione è appropriato per il sistema secondo le istruzioni del produttore. Consentire camera di un certo tempo per raggiungere il 5% di CO 2 e 37 ° C. Prima di aggiungere il piatto di imaging, collocare un piatto vuoto in incubatrice per evitare la condensazione dell&#39;acqua sull&#39;obiettivo. </li><li> Accendere la sorgente laser. </li><li> Aprire fase incubatore e aggiungere olio per immersione alla lente. Collocare il campione in incubatrice e stabilizzare con le armi di stabilità o un peso piatto. Sollevare l&#39;obiettivo finché l&#39;olio entra in contatto con il fondo del campione. switch di illuminazione a luce trasmessa e trovare piano focale neuronale attraverso gli oculari. </li><li> Avviare il software laser e connettersi al software di controllo del laser. Impostare l&#39;illuminazione a widefield e selezionare l&#39;obiettivo utilizzato (100X 1.49 NA TIRF è raccomandato). Impostare indice di rifrazione del campione (cellule ~ 1.38). Regolare l&#39;intensità del laser deselezionando &quot;TTL&quot; per il laser 491 nm. Regolare il cursore per 100 poi riportarlo verso il basso per un valore compreso tra 20 - 40%. Ricontrollare &quot;TTL&quot;. </li><li> Focus sul nuovo campione nell&#39;illuminazione luce trasmessa. Vai a software di imaging e selezionare l&#39;illuminazione laser 491 nm e otturatore aperto. Belle regolare il punto focale del laser sul soffitto e centrare il punto al centro del diaframma di campo chiuso con il condensatore rimosso. Mettere a condensatore a testa in giù sul banco ottico, in modo da non dell&#39;obiettivo zero. </li><li> Sostituire condensatore e andare a software TIRF e impostare la profondità di penetrazione (PD) a 110 nm. Passare dalla illuminazione widefield a TIRF illumModalità inazione per l&#39;imaging. </li><li> Trova VAMP2-pHluorin cellule che esprimono attraverso gli oculari usando epifluorescenza widefield con sorgente luminosa epifluorescente. <ol><li> Regolare parametri di imaging (tempo di esposizione, il guadagno e la potenza laser) per massimizzare il rapporto segnale-rumore e gamma dinamica utilizzando il tempo di esposizione minima e intensità del laser per ridurre photobleaching e fototossicità (ad esempio: esposizione tra 50 - 100 msec, con un 15 - 30 guadagnare al 30% della potenza massima laser). </li><li> Impostare autofocus continuo per cella. Acquisire un&#39;immagine timelapse insieme con l&#39;acquisizione che si verificano ogni 0,5 secondi per 5 min. Per la condizione stimolata netrina-1, aggiungere 500 ng netrina-1 / ml al piatto di cellule in una cappa a flusso laminare e restituire il piatto per l&#39;incubatore per 1 ora prima di imaging. </li></ol></li><li> Per quantificare la frequenza degli eventi esocitosi normalizzati per area delle cellule e il tempo, pile di immagini aperte in ImageJ trascinando il file nella finestra o andare su File&gt; Apri&gt; Nome file (Figura0; 2A Riquadro 1). <ol><li> Per rimuovere i segnali fluorescenti stabili che non rappresentano eventi di fusione delle vescicole, creare una proiezione media z dell&#39;intero stack con Immagine&gt; Pila&gt; Z-Project&gt; tipo di proiezione: intensità media. Sottrarre questa immagine media da ogni immagine in timelapse usando il processo&gt; Calcolatrice Immagine&gt; Image1: lo stack di funzionamento: Sottrarre Image2 appena creato proiezione media z. Questo sottolinea eventi esocitosi (Figura 2A Inset 2 - 3). </li><li> Conte eventi di fusione esocitosi di occhio. Eventi esocitica sono definiti come la comparsa di un segnale di fluorescenza diffrazione limitata, che diffonde rapidamente VAMP2-pHluorin diffonde all&#39;interno della membrana plasmatica (Figura 2A Inset 6). </li><li> Utilizzare il comando Soglia per evidenziare la prima immagine utilizzando Immagine&gt; Regola&gt; Soglia&gt; regolare scorrimento fino a quando l&#39;intera cella è evidenziata soglia (Figura 2A Riquadro 7-8). </li><li> sotto AnaLyze, scegliere SetMeasurements e controllare la regione e l&#39;etichetta di visualizzazione. Selezionare l&#39;area cellulare thresholded utilizzando lo strumento bacchetta rintracciamento e premere &#39;m&#39; per misurare (Figura 2A Riquadro 7-8). </li><li> Trasferire entrambi contano gli eventi di fusione esocitosi, le misure della superficie delle cellule, e il tempo di imaging trascorso ad un foglio di calcolo per calcolare il numero di eventi esocitica / mm 2 / ora (Figura 2A Inset 9). </li></ol></li></ol> 4. interferenza differenziale contrasto (DIC) Timelapse Microscopia di Axon Branching Nota: Un protocollo completa e la dimostrazione di un approccio generale per l&#39;imaging DIC è disponibile 12. Mentre questo protocollo utilizza DIC, altri metodi di microscopia a luce trasmessa possono essere utilizzati per gli stessi scopi (per esempio: contrasto di fase). <ol><li> A 2 DIV, posto fondo di vetro piatto di imaging che contiene neuroni untransfected in camera ambientale pre-riscaldato a mantenere un ENV umidoironment con il 5% di CO 2 e 37 ° C. Utilizzare un microscopio dotato di 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC lente dell&#39;obiettivo e alta condensatore NA per la migliore qualità e la risoluzione dell&#39;immagine. </li><li> Regolare il piano focale per trovare i neuroni attraverso gli oculari che utilizzano illuminazione a luce trasmessa. </li><li> Utilizzando la funzione Multi acquisizione dell&#39;area su software di imaging, trovare e salvare le posizioni XYZ di almeno 6 celle. Posizionare il palco in modo che i neuroni di interesse in forma all&#39;interno del campo visivo per i migliori risultati. <ol><li> Stimolare con 250 ng / ml netrina-1 e premere il tasto &#39;start acquisizione più zona&#39;. Sequenziale acquisire immagini in ogni posizione ogni 20 sec per 24 ore, fermandosi acquisizione e rifocalizzazione, se necessario. </li></ol></li><li> Rivedere le immagini nel software di imaging che utilizzano Applicazioni&gt; Commenta Multi Dimensional dati&gt; nome del file aperto. Identificare rami stabili assone (20 micron di lunghezza) che si formano durante la sessione di imaging. Utilizzare lo strumento draw line per misurare un branc stableaxonh dalla base presso l&#39;assone fino alla punta per garantire la durata di qualifica di 20 micron è soddisfatta. <ol><li> In un foglio di calcolo, registrare il numero di telaio dopo stimolazione netrina quando sporgenze membrana iniziano in aree in cui i rami più tardi si formano così come il numero di fotogramma dopo stimolazione netrina quando rami nascenti raggiungono i 20 micron di lunghezza. </li><li> Moltiplicare il numero di fotogrammi tra protrusione e la formazione ramo da 20 secondi per calcolare il tempo di formazione per ogni ramo. </li></ol></li></ol> 5. Manipolazioni tossina fisso immunofluorescenza cellulare <ol><li> A 2 DIV, il trattamento di neuroni in condizioni sperimentali con 250 ng / ml netrina-1 e / o 10 nM botulinica una tossina (BoNTA), che scinde il SNAP25 proteine ​​SNARE e inibisce efficacemente SNARE esocitosi mediata 13, oltre a 250 ng / ml netrin- 1. Lasciare una serie di neuroni non trattati come condizione di controllo. ATTENZIONE: BoNTA richiede l&#39;uso di occhi e protezione respiratoria durante la preparazione e l&#39;usosoluzioni. Mantenere tutti i materiali contaminati come materiali biologicamente pericolosi e autoclave nel più breve tempo possibile. </li><li> Alle 3 DIV (trattamento post 24 ore) i media aspirato, e sostituire immediatamente con almeno 1 ml di soluzione PHEM (vedi Tabella 1 per i dettagli) riscaldato a 37 ° C. Incubare per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare 3x con PBS (per la futura tenuta l&#39;uso con parafilm e conservare a 4 ° C). </li><li> Luogo coprioggetto in scuro, camera di colorazione umidificata e permeabilize le membrane cellulari per 10 min a fresco diluito 0,2% TritonX-100 in PBS (fatta dal 10% TritonX-100 magazzino). </li><li> Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e sciacquare con 50 ml di 1x con PBS. Blocco per 30 min a ~ 50 ml di 10% di sieroalbumina bovina in PBS (BSA-PBS) o il 10% Bollito Donkey siero in PBS a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare con PBS 1x di nuovo. Incubare coprioggetto in 50 ml di anticorpo primario (1: 1.000 βIII tubulina, per confermare l&#39;identità neuronale) in 1% BSA-PBS per 1 ora a RT, nell&#39;oscurità. </li><li> Eseguire 3x 5 min lavaggi in PBS. Incubare vetrini in 50 ml di anticorpo secondario spettralmente-distinta per tubulina (1: 400), e falloidina fluorescenti (a seconda del eccitazione: 488 falloidina a 1: 400, 647 falloidina a 1: 100) in 1% BSA-PBS per 1 ora . </li><li> Lavare 3x 5 min in PBS 1x e montare su vetrini coprioggetto nei mezzi di montaggio. </li><li> Vacuum eccesso mezzo di montaggio dai bordi del coprioggetto e sigillare con smalto trasparente. </li><li> Raccogliere le immagini epifluorescenza grandangolari su un microscopio invertito con un obiettivo 40X 1.4NA, capacità epifluorescente e EM-CCD. <ol><li> analizzare manualmente ramificazione utilizzando ImageJ. Aperte pile di immagini in ImageJ trascinando il file nella finestra o andare su File&gt; Apri&gt; Nome file (Figura 4A inserto 1). </li><li> Utilizzando la linea&gt; linea segmentato, tracciare l&#39;assone, definito come la neurite più lungo che si estende dal soma (Figura 4A inserto 2 - 3). </li><li>Utilizzando Analizza&gt; Strumenti&gt; ROI Manager, salvare l&#39;assone tracciando come una regione di interesse. Tracciare e salvare ogni ramo assone, definita come una neurite ≥20 micron di lunghezza. Includi rami solo primari (escrescenze che spuntano direttamente dal assone) per l&#39;analisi (Figura 4A inserto 3 - 4). </li><li> Premere &#39;m&#39; per misurare le regioni salvati di interesse, e trasferire le lunghezze in pixel di un foglio di calcolo per calcolare la lunghezza di micron. </li><li> Dividere il numero di rami assoni ≥20 micron di lunghezza, per la lunghezza dell&#39;assone in micron diviso per 100 per ottenere il numero di rami assoni per 100 micron di lunghezza. </li></ol></li></ol>

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<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+Is+Required+for+Commissural+Axon+Guidance+in+the+Developing+Vertebrate+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+netrin-1+in+the+guidance+of+cortical+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents.</a> Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La ramificazione degli assoni è un processo fondamentale dello sviluppo neurologico ed è alla base della vasta neuroconnettività del sistema nervoso dei mammiferi. La comprensione dei meccanismi coinvolti nell'espansione localizzata della membrana plasmatica è parte integrante della nostra comprensione del neurosviluppo sia normale che patologico. L'uso di un approccio su più fronti che incorpora sia le metodologie a livello di popolazione che a livello di singola cellula migliora la riproducibilità e aumenta la risoluzi...

Stime recenti suggeriscono che il cervello umano contiene 1011 neuroni con 1014 connessioni sinaptiche1, evidenziando l'importanza della ramificazione degli assoni in vivo. I segnali di guida degli assoni extracellulari come la netrina-1 guidano gli assoni verso i partner sinaptici appropriati e stimolano la ramificazione assonale, aumentando così la capacità sinaptica2-5. L'arborizzazione assonale netrin-1-dipendente comporta una sostanziale espansione della membrana plasmatica6, che abbiamo ipotizzato richieda la consegna di ulteriori componenti di membrana tramite la fusione delle vescicole esocitiche SNARE dipendenti dal complessoSNARE 7. 
Studiare il ruolo dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni dipendenti dalla netrina-1 è complicato da diversi fattori. In primo luogo, l'eterogeneità dei neuroni corticali aumenta la dimensione del campione necessaria per identificare effetti significativi, complicando le tecniche a singola cellula come l'imaging. In secondo luogo, sebbene le tecniche biochimiche permettano l'osservazione dei cambiamenti che si verificano a livello di popolazione, mancano della risoluzione temporale e spaziale necessaria per localizzare l'espansione della membrana plasmatica all'assone nel lasso di tempo della ramificazione degli assoni. Infine, sebbene i rami degli assoni si formino nel corso delle ore, i cambiamenti cellulari che contribuiscono all'estensione assonale possono iniziare in pochi minuti e verificarsi nell'ordine dei secondi, estendendo così l'ambito temporale per la considerazione sperimentale. 
Delineiamo un approccio multi-tecnica che affronta queste diverse scale temporali e spaziali dell'esocitosi e della ramificazione degli assoni, e quindi migliora la nostra comprensione dei meccanismi cellulari fondamentali. L'utilizzo di questi approcci fornisce prove che supportano un ruolo critico per l'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni.

<table><tbody><tr><td>Piastre trattate per colture tissutali a 6 pozzetti</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; devono essere trattati con acido nitrico per 24 ore, risciacquati in acqua deionizzata 2 volte e asciugati prima dell'uso. Deve essere rivestito con 1 mg/ml di poli-d-lisina e risciacquato prima della placcatura delle cellule.</td></tr><tr><td>Soluzione di nucleofeczione Amaxa</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/trasfezione</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/elettroporatore</td><td>Programma Lonza</td><td></td><td>O-005</td></tr><tr><td>35 mm Piastre per l'imaging di cellule vive con fondo in vetro</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>deve essere rivestito con 1 mg/ml di poli-d-lisina e risciacquato prima di placcare le celle</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Olympus IX81-ZDC2 Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda LS lampada allo xeno</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore ambientale Stage top</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA Obiettivo TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor Sistema di imaging a infrarossi</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Utilizzato per la scansione di macchie</td></tr><tr><td>Studio di immagini suite software</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Utilizzato per la scansione sul sistema a infrarossi Odyssey; Image Studio lite utilizzato per l'analisi offline dei blot</td></tr><tr><td>Metamorph per Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>versione 7.7.6.0</td><td>Software utilizzato per tutte le immagini e l'analisi del timelapse DIC</td></tr><tr><td>Software di controllo TIRF CELL</td><td>Software Olympus</td><td></td><td>utilizzato per controllare i laser per l'imaging TIRF</td></tr><tr><td>Fiji (Immagine J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Versione 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Piano Apocromatico 1.4 NA</td><td>Obiettivo Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Apochromat</td> Terreni neurobasali <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Soluzione base per terreni di estinzione privi di siero e tripsina</td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Terreni privi di siero e terreni di tempra della tripsina</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Terreni privi di siero</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>soluzione al 10% in 1x PBS per il blocco dei vetrini; soluzione al 5% in TBS-T per il blocco delle membrane nitrocellulosiche.</td></tr><tr><td>10x&nbsp; tripsina</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propyl Gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo Grado fotometrico</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo (grado non ottico)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoetonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>Disciolto in acqua sterile a 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Tossina botulinica A BoNTA</td><td>List Biological Laboratories</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit policlonale anti umano VAMP2</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale di topo anti ratto Syntaxin1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Capra policlonale anti umano SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Topo monoclonale anti umano & beta; III-tubulina&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488 falloidina, o Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-dye anticorpi secondari</td><td>LI-COR</td><td>P/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 asino anti-topo, 680 asino anti coniglio, 680 asino anti capra</td></tr><tr><td>0.2 &#956; m dimensione dei pori membrana nitrocellulosica</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% Bis-Acrilimide</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Alternative Validated Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sinaptobrevina monoclonale di topo 2 (VAMP2)</td><td>Sistemi sinaptici</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr>Sistemi <td>sinaptici</td>,<td>monoclonali di topo SNAP25</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna durante axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Durante lo sviluppo neurale, gli assoni in crescita si estendono a più partner sinaptici elaborando rami assonali. La ramificazione degli assoni è promossa da segnali di guida extracellulari come la netrina-1 e si traduce in un drammatico aumento della superficie della membrana plasmatica assonale. La ramificazione dell'assone netrina-1-dipendente probabilmente comporta il controllo temporale e spaziale dell'espansione della membrana plasmatica, i cui componenti sono forniti attraverso la fusione delle vescicole esocitiche. Questi eventi di fusione sono preceduti dalla formazione di complessi SNARE, comprendenti un v-SNARE, come VAMP2 (proteina di membrana associata alla vescicola 2), e t-SNARE di membrana plasmatica, sintassina-1 e SNAP25 (proteina 25 associata al sinaptosomio). Di seguito è descritto un approccio su più fronti utilizzato per esaminare il ruolo dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni. Il punto di forza dell'approccio combinato è l'acquisizione di dati a una gamma di risoluzioni spaziali e temporali, che vanno dalla dinamica degli eventi di fusione di singole vescicole in singoli neuroni alla formazione del complesso SNARE e alla ramificazione degli assoni in popolazioni di neuroni in coltura. Questo protocollo si avvale di approcci biochimici consolidati per analizzare i livelli dei complessi endogeni SNARE e della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) di neuroni corticali che esprimono VAMP2 marcati con una GFP sensibile al pH (VAMP2-pHlourin) per identificare i cambiamenti dipendenti dalla netrina-1 nell'attività esocitaria nei singoli neuroni. Per chiarire la tempistica della ramificazione dipendente dalla netrina-1, viene utilizzata la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) time-lapse di singoli neuroni nell'ordine di ore. L'immunofluorescenza cellulare fissa abbinata a neurotossine botuliniche che scindono il meccanismo SNARE e bloccano l'esocitosi dimostra che la ramificazione dell'assone dipendente dalla netrina-1 richiede un'attività esocitica mediata da SNARE.

Utilizzando tecniche biochimiche in vitro per saggiare la quantità di SDS-resistenti complessi SNARE in una popolazione di neuroni. La figura 1 mostra la conseguente Western Blot a seguito del completamento del SDS-resistente SNARE saggio complesso sondato per SNAP-25, syntaxin1A e VAMP2. TIRF Microscopia a livello della membrana delle cellule basali fornisce immagini ad alta risoluzione di singoli ev...

Le tecniche di microscopia ottica abbinate a saggi biochimici chiariscono il coinvolgimento dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni netrina-dipendente. Questa combinazione di tecniche consente l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano la ramificazione degli assoni e il cambiamento della forma cellulare.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è effettuare osservazioni quantificabili dell'occorrenza temporale e spaziale della fusione delle vescicole esocitiche neuronali e della ramificazione assonica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio quando e dove l'inserzione di materiale di membrana, mediata dalla fusione delle vescicole, avviene nella membrana plasmatica in espansione durante lo sviluppo neuronale. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel combinare l'immagine di cellule vive per ottenere un'elevata risoluzione spaziale e temporale a livello di singola cellula e approcci biochimici per ottenere informazioni basate su popolazioni cellulari.Dopo aver coltivato e stimolato i neuroni corticali con Netrina-1 o un controllo secondo il testo del protocollo, aspirare il PBS dal primo pozzetto di una condizione e sostituirlo con 250 microlitri di buffer di omogeneizzazione. Incubare sul ghiaccio per cinque minuti, quindi, utilizzando un raschietto per cellule, omogeneizzare le cellule sul ghiaccio.Aspirare il PBS dal pozzetto successivo della stessa condizione e aggiungere la miscela recentemente omogeneizzata al pozzetto per aumentare le concentrazioni proteiche. Successivamente, trasferire la soluzione omogeneizzata in una provetta microfuga da 1,6 millilitro preraffreddata su ghiaccio e aggiungere Triton X-100 al 20% per raggiungere una concentrazione finale dell'1%. Quindi, con una pipetta da 1.000 microlitri, triturare la miscela dieci volte minimizzando la formazione di bolle. Incubare le provette sul ghiaccio per due minuti per solubilizzare le proteine.Quindi centrifugare a 6.010 RCF a 4 gradi Celsius per 10 minuti per ottenere un pellet del materiale non solubilizzato. Trasferire il soprannatante liquido in un nuovo tubo da 1,6 millilitri pre-raffreddato, posto sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare il saggio di Bradford per determinare la concentrazione proteica.Quindi, utilizzare un buffer di omogeneizzazione contenente Triton X-100 all'1% e buffer campione 5X integrato con BME per diluire i campioni a una concentrazione finale di 3-5 milligrammi per millilitro. Dividere ogni campione sperimentale in modo equo in due provette. Successivamente, incubare un campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti e l'altro a 100 gradi Celsius per 30 minuti.Invertire occasionalmente i tubi per mantenere i campioni in soluzione. Successivamente, eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE e il Western blotting seguendo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver configurato il microscopio TIRF e il campione e aver individuato un piano focale neuronale seguendo il protocollo indicato nel testo.Avviare il software del laser e connettersi al software di controllo del laser. Impostare l'illuminazione a campo largo e selezionare l'obiettivo. Successivamente, impostare l'indice di rifrazione del campione e regolare l'intensità del laser deselezionando TTL per il laser 491.L'ottimizzazione dei parametri di acquisizione è importante durante l'immagine di vescicole esocitiche con pavimento intatto per evitare deriva del fuoco e fototossicità, producendo al contempo immagini con un rapporto segnale-rumore sufficientemente elevato per l'analisi. Regolare il cursore su 100 e quindi riportarlo a un valore compreso tra 20 e 40. Successivamente, verificare nuovamente il TTL.Successivamente, riportare l'attenzione sul campione utilizzando l'illuminazione in luce trasmessa. Quindi, nel software di acquisizione, selezionare l'illuminazione con laser a 491 nm e aprire l'otturatore. Posizionare il condensatore capovolto sul banco ottico per evitare di graffiare la lente.Regolare finemente il punto focale del laser sul soffitto e, con il condensatore rimosso, centrare il punto rispetto al diaframma del campo chiuso. Quindi reinserire il condensatore e nel software TIRF impostare la profondità di penetrazione a 110 nanometri. Successivamente, passare dall'illuminazione in campo chiaro alla modalità di illuminazione TIRF per l'acquisizione delle immagini.Ora, utilizzando la microscopia a fluorescenza in campo chiaro, individuare al microscopio le cellule che esprimono VAMP2 fluorescente. Successivamente, per ridurre il fotoblanco e la fototossicità, regolare i parametri di acquisizione per massimizzare il rapporto segnale-rumore e la dinamica, utilizzando il tempo di esposizione e l'intensità del laser più bassi possibili. Impostare l'autofocus continuo per ogni cellula.Quindi acquisire un set di immagini in lapse temporale con acquisizioni ogni 0,5 secondi per cinque minuti. Per la condizione stimolata con Netrin-1 in un'incubatrice a flusso laminare, aggiungere Netrin-1 fino a una concentrazione finale di 500 nanogrammi per millilitro in una piastra di cellule e reinserire la piastra nell'incubatrice per un'ora prima dell'acquisizione delle immagini. Per quantificare la frequenza degli eventi esocitici normalizzati per area cellulare e tempo.In ImageJ, aprire gli stack di immagini trascinando il file nella finestra oppure selezionando File, Apri, nome del file. Per rimuovere segnali fluorescenti stabili che non rappresentano eventi di fusione delle vescicole, utilizzare Immagine, Stack, Proiezione Z, tipo di proiezione Intensità Media. Per creare una proiezione Z media dell'intero stack.Sottrarre l'immagine media risultante da ciascuna immagine del timelapse utilizzando Elabora, Calcolatrice immagine, Immagine 1 la propria serie, Operazione Sottrai immagine due. Il risultato sarà una nuova proiezione Z. Questo evidenzierà gli eventi esocitici.Ora ad occhio nudo, conta gli eventi di fusione esocitica, che possono essere identificati come punti di segnali fluorescenti a diffrazione limitata che si diffondono rapidamente man mano che il fluoruro VAMP2 si diffonde all'interno della membrana plasmatica. Evidenzia la prima immagine con Immagine, Regola, Soglia e regola il cursore finché l'intera cellula non risulta evidenziata dalla soglia. Quindi, sotto Analizza, scegli Imposta misurazioni e seleziona area ed etichetta di visualizzazione.Con lo strumento di tracciamento della bacchetta, impostare l'area cellulare sogliata e premere M per effettuare la misurazione. Trasferire i dati raccolti in un foglio di calcolo seguendo il protocollo descritto nel testo. Dopo due giorni di coltura in vitro, posizionare la piastra per imaging con fondo in vetro contenente neuroni non trasfettati in una camera ambientale umidificata preriscaldata.Utilizzare un microscopio dotato di un obiettivo DIC planapocromatico 1,4 NA a sei DX e di un condensatore ad alta apertura numerica per ottenere la migliore qualità e risoluzione dell'immagine. Successivamente, con l'illuminazione a luce trasmessa, regolare il piano focale per individuare i neuroni attraverso gli oculari. Per l'acquisizione di immagini DIC della ramificazione assonica, una corretta configurazione dell'illuminazione raffreddata sarà fondamentale per l'ottimizzazione delle immagini ed essenziale per produrre risultati analizzabili.Quindi, con i neuroni di interesse all'interno del campo visivo, utilizzare la funzione di acquisizione multizona del software di imaging per individuare e salvare le posizioni XYZ di almeno sei cellule. A questo punto, aggiungere una concentrazione finale di 250 nanogrammi per millilitro di Netrin-1 o di un altro fattore di interesse per stimolare le cellule e premere il pulsante per avviare l'acquisizione multizona. Acquisire in sequenza le immagini in ogni posizione ogni 20 secondi per 24 ore.Sospendere l'acquisizione e rifocalizzare secondo necessità. All'interno del software di imaging, esaminare le immagini selezionando Applicazioni, Esamina Dati Multidimensionali e aprire il file desiderato. Identificare rami assonali stabili formati durante la sessione di imaging.Utilizzare lo strumento di regione traccia per misurare un ramo assonico stabile dalla base dell'assone fino alla punta. Dopo aver trattato i neuroni con Netrina e tossina botulinica, fissati e immunomarcare, ed eseguito l'immunomarcatura per beta-3 tubulina e actina secondo il protocollo descritto nel testo. Utilizzare un microscopio invertito per acquisire immagini di epifluorescenza a campo ampio.Aprire uno stack di immagini in ImageJ e, per analizzare manualmente le ramificazioni, utilizzare lo strumento linea, linea segmentata e tracciare l'assone, definito come la neurite più lunga che si estende dal soma. Tramite Analizza, Strumenti, Gestore ROI, salvare il tracciamento dell'assone come area di interesse. Successivamente, tracciare e salvare ciascun ramo dell'assone, definito come una neurite di lunghezza maggiore o uguale a 20 micrometri.Includere solo i rami primari nell'analisi. Qui è mostrato un immunoblot dopo il completamento del saggio del complesso SNARE resistente agli SDS. Probes per SNAP25, Syntaxin 1A e VAMP2.Proteine SNARE in complesso, i monomeri identificabili sono mostrati qui. Un esempio di un evento esocitico mediato da VAMP2 fluorogeno che si verifica nel tempo in un neurone corticale è mostrato qui. Gli ingrandimenti indicano il soma, un ramo assonale e un cono di accrescimento assonale, mostrando l'utilità spaziale di questo saggio.I cerchi indicano singoli eventi di fusione esocitica, visibili mediante microscopia TIRF. Questa sequenza temporale di immagini DIC mostra in tempo reale la formazione di un ramo assonico stimolata da Netrina. Queste posizioni indicano la protrusione iniziale da un sito di ramificazione.Questi rappresentano rami stabili completamente formati, lunghi almeno 20 micrometri, misurati dal corpo assonale principale fino all'estremit&agrave; del ramo. In questo esperimento, neuroni corticali a 3 DIV sono stati trattati con Netrina-1, che stimola la ramificazione, oppure con tossina botulinica di tipo A, che scinde SNAP25, un componente del complesso SNARE e blocca l'esocitosi. I risultati dimostrano che l'esocitosi mediata dal complesso SNARE &egrave; necessaria per la ramificazione dipendente dalla Netrina.Una volta acquisita padronanza, l'acquisizione di immagini in DIC può essere completata in una singola sessione notturna. L'acquisizione di immagini in TIRF di singoli eventi esocitici può essere eseguita in 4-5 ore. Il protocollo biochimico per la formazione del complesso SNARE può essere effettuato in due ore.Nel tentativo di eseguire queste procedure, è importante ricordare di procedere con calma e non affrettare alcun singolo passaggio. Ogni procedura richiede attenzione e pazienza per ottenere i migliori risultati. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la cotrasfezione di componenti di vescicole marcati con cargo candidati marcati, per rispondere a ulteriori domande.Come si può identificare il carico delle vescicole esocitiche? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la neuritogenesi, la ramificazione assonica e altre fasi della morfogenesi in qualsiasi coltura neuronale dissociata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come osservare e quantificare la natura spaziale e temporale degli eventi di fusione delle vescicole esocitiche neuronali, correlati ai cambiamenti nella morfogenesi neuronale.Ricordare che lavorare con la tossina botulinica o con laser ad alta potenza può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione adeguati e utilizzare il meccanismo di blocco di sicurezza del microscopio durante l'esecuzione di questa procedura.

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Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi (Video) | JoVE Journal

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

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