Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish
19 febbraio 2016
Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di immunolocalizzare le proteine che vengono attivate nell'embrione di zebrafish. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo e della biologia cellulare, come la localizzazione e l'attivazione di proteine fosforilate in un intero embrione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può localizzare la segnalazione calcio-dipendente in un intero embrione mediante l'immunocolorazione delle proteine attivate dal calcio.
Dopo aver ottenuto embrioni wild type o transgenici secondo il protocollo di testo, aggiungere lo 0,003% di PTU agli embrioni nell'acqua del sistema per bloccare la pigmentazione e incubare fino allo stadio di sviluppo desiderato. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio corretto, aggiungere MESAB al piatto per anestetizzare il pesce. Una volta che i pesci sono stati anestetizzati, rimuovere quanta più acqua possibile del sistema, quindi aggiungere PFA e PBS freschi al 4% e incubare a temperatura ambiente per tre o quattro ore.
Dopo l'incubazione, rimuovere il PFA e utilizzare il metanolo al 100% per sostituirlo. Quindi, conservare gli embrioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per almeno 48 ore. Per eseguire l'immunocolorazione, posizionare un minimo di 10 embrioni per ogni condizione sperimentale in provette da microcentrifuga da 1,5 millimetri etichettate.
Quando gli embrioni si sono depositati sul fondo della provetta, rimuovere e scartare il metanolo e utilizzare lavaggi progressivi di concentrazioni decrescenti di etanolo in PBTx per reidratare gli embrioni. Rimuovere l'ultimo lavaggio in PBTx e aggiungere 0,5 millilitri di siero di capra normale al 10% o NGS in PBTx. Quindi, incubare a temperatura ambiente per almeno un'ora con un leggero dondolio.
Successivamente, rimuovere la soluzione e aggiungere da 0,2 a 0,5 millilitri di una diluizione 1 su 5 di anticorpo monoclonale anti-tubulina acetilata di topo e 10% NGS e PBTx. Incubare gli embrioni con un leggero dondolo a temperatura ambiente per una notte. Al mattino, rimuovere ed eliminare l'anticorpo ed eseguire tre lavaggi utilizzando 0,5 millilitri di 2% NGS e PBTx con un leggero dondolio per cinque minuti ciascuno.
Abbassare le luci a soffitto e aggiungere 500 microlitri a ciascun campione di una diluizione di 1 su 500 di anticorpo secondario coniugato fluorescente in 10% NGS e PBTx. Incubare al buio a temperatura ambiente per quattro ore con un leggero dondolio. Dopo l'incubazione, lavare gli embrioni tre volte.
Per la co-immunocolorazione, aggiungere una diluizione di 1 su 20 dell'anticorpo anti-fosfo CaMKII. Incubare al buio con un leggero dondolio durante la notte. La mattina successiva, dopo aver lavato gli embrioni con 2% NGS e PBTx tre volte, aggiungere una diluizione di 1 su 5 di IgG di capra coniugata fluorescente rosso 568 anti-coniglio e 10% NGS e PBTx.
Dopo l'incubazione al buio a temperatura ambiente per quattro ore, lavare gli embrioni tre volte e conservarli in PBTx o al 50% di glicerolo in PBS a seconda della procedura di imaging. Per montare gli embrioni per l'imaging, posizionare da uno a cinque embrioni su un vetrino. Usa quattro frammenti di vetrino coprioggetto impilati numero uno su entrambi i lati del pesce per creare una camera.
E metti sopra un vetrino coprioggetti. Con la lente ad immersione in olio 100X e la luce trasmessa metti a fuoco un singolo embrione. Spegni la luce.
Accendere il microscopio confocale con i laser appropriati e attivare la messa a fuoco remota. Aprire il programma confocale e nella barra di acquisizione, selezionare l'obiettivo appropriato. Quindi, nella barra di base XY, fare clic sul pulsante 1024 per impostare la dimensione dell'immagine.
Nella barra del laser e del rilevatore, fare clic sulle caselle rosse 488 e verde 568 per accendere il rilevatore laser per ciascun canale e impostare il foro stenopeico su medio. Quindi, nella barra del guadagno, regolare il guadagno per ciascun canale per visualizzarlo. Successivamente, nella barra delle impostazioni di acquisizione, fare clic su Live per iniziare ad acquisire le immagini.
Nella barra delle impostazioni della vista, deseleziona la casella Forza zoom integrale al centro nella finestra live. Nella barra delle impostazioni di acquisizione nella scheda Z, scorrere i livelli dell'immagine. Dopo aver selezionato il numero di livelli da incorporare nell'immagine, spostatevi in un punto al centro del piano Z.
Nella scheda Z, fai clic sulla piccola casella di riferimento rossa. In questo modo la RFA verrà azzera nel punto scelto come centro. Nella casella denominata Dimensione passo, selezionare lo spessore degli strati.
Presta attenzione alla casella delle dimensioni del file e cerca di limitare i file a un gigabyte. Per trovare l'estremo superiore dell'immagine, fai clic sul cerchio accanto alla parte superiore e spostati tra i livelli Z. Ora fai clic sul cerchio accanto in basso e il computer riporterà l'immagine al livello come centro.
Quindi, nella casella delle impostazioni di acquisizione, fare nuovamente clic su live per interrompere l'acquisizione laser. In questo pannello, fai clic sulle caselle rosse con l'etichetta media e pila Z. Queste caselle diventeranno verdi.
Nella casella delle impostazioni di acquisizione, fare clic su singolo per acquisire l'intera serie di immagini. Monitora lo stato di avanzamento durante la scansione in entrambi i canali e nell'intero stack Z. Per salvare, fare clic sulla finestra del volume e fare clic su Salva con nome e assegnare un nome al file.
Per eseguire il rendering del volume del file, mentre lo stack Z è ancora aperto, selezionare il menu a discesa dei dati e fare clic su rendering del volume. Salva il file renderizzato come file dot tif. Questa figura mostra l'immunocolorazione per P-CaMKII e la tubulina acetilata, che è un marcatore standard per le ciglia nella vescicola di Kuppfer o KV del pesce zebra. L'alimentazione delle ciglia primarie genera un flusso circolare di fluido, che porta ad un aumento del calcio nelle cellule ciliate che rivestono il KV e all'attivazione di CaMKII in posizioni discrete, come si vede qui.
Queste figure mostrano il P-CaMKII come appare sulla superficie apicale delle cellule ciliate che rivestono regioni specifiche dei dotti perinefrici tra 24 e 72 ore dopo la fecondazione o HPF. A un giorno di sviluppo, l'orecchio embrionale di zebrafish fissato con PFA e metanolo mantiene le sue strutture e consente il rilevamento della colorazione CaMKII alla base e lungo la lunghezza del kinocilum. A 72 HPF, l'orecchio interno è stato controcolorato con falloidina Alexa 488 e tubulina anti-acetilata con Alexa 568.
La fissazione con metanolo PFA ha preservato sia la F-actina che la tubulina. Questo pesce da 30 HPF ha espresso una GFP mirata alla membrana, che verrebbe persa con la fissazione del metanolo. La fissazione del PFA ha comportato una diminuzione del segnale P-CaMKII rispetto alla fissazione con PFA e metanolo.
Tuttavia, in questa fase di sviluppo, il segnale è abbastanza forte da essere rilevato senza metanolo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare embrioni freschi e agenti liberi freschi.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come localizzare le fosfoproteine negli embrioni di zebrafish.
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Panoramica
In questo articolo vengono descritte le tecniche per l'immunomarcatura di epitopi fosforilati in embrioni interi di pesce zebra e per l'esecuzione della localizzazione confocale fluorescente a due colori. Questi metodi possono definire la localizzazione e la cinetica di proteine specifiche in strutture cellulari, come le ciglia primarie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
Sfondo
- Immunolocalizzazione di proteine in embrioni di pesce zebra.
- Comprensione dell'attivazione di proteine fosforilate.
- Localizzazione della segnalazione dipendente dal calcio.
- Importanza dello studio di embrioni interi per ottenere informazioni sullo sviluppo.
Scopo dello studio
- Immunolocalizzare le proteine attivate negli embrioni di pesce zebra.
- Indagare domande fondamentali nella biologia dello sviluppo e nella biologia cellulare.
- Definire la cinetica dell'attivazione proteica in un intero embrione.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di embrioni di zebrafish di tipo selvatico o transgenici.
- Applicazione di PTU allo 0,003% per bloccare la pigmentazione.
- Incubazione degli embrioni fino allo stadio di sviluppo desiderato.
- Immunomarcatura con PFA al 4% e PBS per la localizzazione delle proteine.
Risultati principali
- Localizzazione riuscita di proteine di segnalazione dipendenti dal calcio.
- Visualizzazione di proteine fosforilate nelle strutture cellulari.
- Cinetiche definite dell'attivazione proteica durante lo sviluppo.
- Migliorata comprensione della dinamica proteica in embrioni interi.
Conclusioni
- Le tecniche permettono uno studio dettagliato della localizzazione e dell'attivazione delle proteine.
- La colorazione immunoistochimica negli embrioni di pesce zebra è efficace per la ricerca in biologia dello sviluppo.
- Questi metodi possono fornire informazioni sui meccanismi di segnalazione cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La colorazione immunoistochimica di epitopi fosforilati in embrioni interi di pesce zebra permette la visualizzazione diretta della dinamica dei segnali negli organi ciliati, supportando la validazione degli bersagli nelle vie dello sviluppo. Questo approccio riduce i rischi meccanicistici collegando le modifiche post-traduzionali agli esiti fenotipici in un modello vertebrale. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta localizzando proteine attivate, come la CaMKII fosforilata, in strutture quali la vescica di Kupffer, il rene e l’orecchio interno.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche localizzando le proteine fosforilate nelle cellule ciliate.
- Valore operativo: Conferma l'interazione con il bersaglio mediante co-localizzazione con la tubulina acetilata, un marcatore delle ciglia.
- Valore predittivo: Favorisce la chiarificazione del percorso segnale attraverso la visualizzazione dell'attivazione della segnalazione dipendente dal calcio nel KV.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti in zebrafish.
- Output quantitativo: Consente misurazioni dell'intensità di fluorescenza di epitopi fosforilati in regioni anatomiche definite.
- Scalabilità: Permette l'elaborazione di multi-embryoni per un rilevamento del segnale riproducibile in diverse condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Si allinea ai modelli di ciliopatia valutando i segnali dipendenti dalle ciglia nel dotto di Kupffer e nell'orecchio interno.
- Continuità traslazionale: Collega i meccanismi di segnalazione embrionale agli esiti funzionali postnatali.
- Progressione aggiustata per il rischio: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla modulazione del bersaglio nei tessuti in via di sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo dati di attivazione con risoluzione spaziale nei tessuti dei vertebrati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi mediante la visualizzazione diretta della localizzazione di proteine fosforilate nelle strutture embrionali.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso immunomarcatura standardizzata di organi ciliati in preparati interi.
- Analisi: Genera letture quantitative di fluorescenza nel dotto di Kupffer (KV), nei reni e nell'orecchio interno per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il segnale delle ciglia embrionali a modelli preclinici di ciliopatie e malattie renali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la mappatura di epitopi fosforilati attraverso diverse fasi dello sviluppo e modelli genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando gli eventi di fosforilazione alla localizzazione nei cigli.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di fissazione e incubazione con anticorpi.
- Valore strategico: Migliora la fiducia nella selezione degli obiettivi validando l'attivazione del percorso in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione degli obiettivi corretta rispetto al rischio, basata su dati di segnalazione embrionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in embriologia del pesce zebra e tecniche di immunofluorescenza.
- Dipende da infrastrutture per microscopia confocale con regolazione del laser per la rilevazione a doppio canale.
- Necessita della standardizzazione della diluizione degli anticorpi e dei tempi di incubazione tra diversi laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi background genetici e stadi di sviluppo.
- È limitato dalla sensibilità della conservazione dell'epitopo ai metodi di fissazione, poiché la PFA da sola riduce il segnale di fosfo-CaMKII.
