Name: Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Scopri l'analisi della retrotrasposizione LINE-1 a livello di singolo nucleo nelle cellule HepG2 mediante FISH. Questo metodo consente di valutare con precisione i tassi e i pattern di retrotrasposizione genomica.

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Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni del National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 e ES017274) e di AstraZeneca a KSR.

NOTA: Tutte le fasi deve essere effettuata a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato. Si prega di fare riferimento alla sezione Reagenti per i dettagli su come preparare i singoli reagenti. 1. Etichettatura L1 Sonde NOTA: Le sonde possono essere etichettati, mediante l&#39;etichettatura chimica o PCR. <ol><li> etichettatura chimica <ol><li> Rendere 0,7-1% gel di agarosio in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE), il calore in un forno a microonde fino a fuso, permettono il gel raffreddare, quindi aggiungere etidio bromuro (0,5 mg / ml). Versare in vassoio gel, aggiungere pettini e consentire il gel solidificare a temperatura ambiente. </li><li> Etichettare la sonda Sneo (1-2 mg) con CY3 o FITC a 37 ° C per 1 ora secondo il protocollo del produttore. NOTA: Sneo indica la S pliced ​​gene mycin Neo espresso dopo un ciclo completo di retrotrasposizione. La sonda è ~ 1000 bp in termini di dimensioni. Sneo può essere PCR amplificato da qualsiasi vettore o da genomic DNA. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su streptavidina-CY3 / FITC reagenti di etichettatura. </li><li> Mescolare la soluzione della sonda Sneo etichettato con il tampone 1x DNA di carico, carico in ciascun pozzetto e correre a 75-100 volt per 15-20 minuti. </li><li> Visualizza la banda sonda con una viola Ultra-(UV) Illuminatore. Si noti che le dimensioni della sonda Sneo può essere regolato e che serratura nuclei acido (LNA) può anche essere aggiunto (Figura 2). </li><li> Cut etichettato sonda Sneo dal gel con una lama pulita, solubilizzare e purificare la sonda Sneo dal gel utilizzando un kit PCR Clean-Up secondo il protocollo del produttore. ATTENZIONE: coprire ogni parte esposta del corpo con schermi di protezione (ad esempio, camici da laboratorio e UV chiaro maschera) durante la visualizzazione e il taglio del gel. Vedere la Tabella di materiali e reagenti per le informazioni di gel purificare prodotti di PCR. </li><li> Re-run 5 pl di Sneo etichettati sonda con una sonda Sneo non-marcato su un gel di agarosio 0,7% (vedi 1.1.1) per Conaumento dimensione aziendale e perdita di intensità del segnale (figura 2). </li><li> Quantificare la quantità di sonda Sneo etichettato misurando l&#39;assorbanza a 260 nm e diluire la sonda Sneo a 10 ng / aliquote microlitri di nucleasi libero H 2 O. aliquote conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> PCR Labeling (metodo alternativo per l&#39;etichettatura sonda) <ol><li> Combinare primer specifici Sneo (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;e 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) con PCR reagenti in un unico tubo: 13,6 ml nucleasi libero H 2 O; 0,1 microlitri dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ml dTTP (10 nM); 0.05 ml dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ml Vai Tag 5x tampone; 0,4 ml Vai Tag polimerasi; 1 ml modello Sneo (10 ng). Vedere la Tabella dei materiali e reagenti per informazioni sui reagenti PCR. </li><li> Regolare la quantità di ciascun reagente moltiplicando per il numero totale di campioni. </li><li> Utilizzare il seguente parametro ciclismo PCRs per amplificare ed etichette Sneo sonde: 95 ° C per 2 min; 35 cicli di 95 ° C per 30 sec, 62 ° C per 30 sec, 72 ° C per 60 sec; 72 ° C per 2 min; Tenere a 4 ° C a tempo indeterminato. NOTA: La temperatura di ricottura può essere regolato o gradiente di PCR può essere completata per determinare temperature di ricottura ottimali per altre sonde. </li><li> Fare gel 0,7-1% come nella sezione 1.1.1, carico e visualizzare la band sonda come nella sezione 1.1.4. </li><li> Tagliare e purificare la sonda Sneo etichettato come nella sezione 1.1.5. </li><li> Re-run 5 pl di Sneo etichettati sonda con Sneo sonda di un marcato aumento di confermare le dimensioni e la perdita di intensità del segnale (vedi figura 2). </li><li> Quantificare la quantità di sonda Sneo etichettati da assorbanza misurando a 260 nm e diluire la sonda Sneo a 10 ng / aliquote microlitri di nucleasi libero H 2 O. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione spread cromosomiche <ol><li> Generare cloni stabili che esprimono vettore backbone (Control) o retrotransposition L1 competente utilizzando metodologie di selezione standard. 12,16 Mentre reporter non episomiale stati usati per correlare risultati con studi di trascrizione, potrebbero anche essere utilizzati vettori episomiale. Crescere cellule che esprimono stabilmente il controllo o L1 vettore (1 x 10 6 cellule per 10 cm piastra, con regolazioni in formato piatto fatte in base alle esigenze) in terreni di crescita completa. Per le cellule HepG2, utilizzare RPMI-1600, 10% FBS e 200 ug / ml di igromicina. Grow culture al 70% di confluenza a 37 ° C e 5% CO 2. NOTA: La scelta del mezzo di crescita dipende dal tipo di cellula. Dato che i plasmidi usati qui portano cassette di selezione sia per igromicina e neomicina, la selezione dei cloni stabili potrebbe essere fatto anche con neomicina dopo scelta su igromicina, ma la quantità di neomicina deve essere ottimizzato per stabilire livelli di tolleranza per ciascun tipo di cellula. </li><li> Aggiungere Colcemid (0,4 mg / ml) per mezzo di coltura e incubare per 90 minuti per arrestare le cellule al Metase. Se utilizzando diversi tipi cellulari, determinare la concentrazione ottimale di Colcemid e del tempo di esposizione (60, 90, e 120 min) per metafase arresto ottimale empiricamente. </li><li> Lavare le cellule 2x con 10 ml di PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize aggiungendo 3-5 ml di 0,25% tripsina soluzione alle cellule e incubare per 5 minuti per staccare le cellule. Inattivare la tripsina con una pari quantità di supporti contenenti il ​​10% FBS. </li><li> Centrifugare le cellule per 2 min a 1000 xga 4 ° C, aspirare il terreno dal pellet cellulare e lavare le cellule con DPBS. Aspirare tutti DPBS, lasciando 200 ml di DPBS per risospendere le cellule. Assicurarsi che le cellule sono mescolate bene e che tutti i grumi sono disperse. Utilizzare sfarfallio o delicato pipettaggio di mescolare e disperdere grumi ed evitare vortex. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica (cioè, 75 mM KCl) che è pre-riscaldato a 37 ° C e goccia a goccia durante la rotazione del tubo 15 ml orizzontale e incubare a 37 ° C per 20 min. Vedere la Tabella dei materiali e Reagents per informazioni su come ottenere e rendere soluzione ipotonica. </li><li> cellule centrifugare a 120 xg per 5 minuti a 4 ° C e ripetere i passaggi 2,4-2,5 3x lasciando circa 200 ml di soluzione ipotonica per risospendere le cellule dopo ogni lavaggio. Assicurarsi che al termine dei 3 lavaggi, il pellet è visibilmente bianca e gonfia. </li><li> Risospendere il pellet in 200 ml di soluzione di Carnoy fissativo e fare 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluizioni in soluzione Carnoy fissativo. Goccia 10 ml di ciascuna diluizione su un vetrino pulito e asciutto da circa 1 cm sopra ed esporre immediatamente il lato libero-diffusione di vapore caldo da acqua bollente per 30 sec. Vedi tabella dei materiali e reagenti per le informazioni su come fare soluzione Carnoy fissativo. </li><li> Asciugare gli spread a temperatura ambiente, macchia con 0,1 mg / ml Hoechst-33342 per immersione per 15-20 minuti in Coplin vaso e lavare 3x con DPBS. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come rendere la soluzione Hoechst-33342. </li> &lt;li&gt; Visualizza estende su microscopio a fluorescenza / contrasto di fase a 40X di ingrandimento. Dopo l&#39;ottimizzazione preparazione diffusione, spread non devono essere colorati con Hoechst-33342. Vedi estende su microscopio a contrasto di fase a 10X di ingrandimento per determinare la qualità diffusione e la separazione come indicato nella sezione Risultati (vedi figura 3). </li><li> Selezionare e cerchio buone spread con Diamond Point Marker sul lato opposto della slitta (cioè, si sviluppa senza side). </li><li> Conservare diffonde a -20 ° C per un massimo di un mese. Evitare l&#39;esposizione all&#39;umidità. </li></ol> 3. ibridazione in situ fluorescente (FISH) <ol><li> Stabilizzazione e disidratazione spread NOTA: Equilibrare metafase cromosoma si diffonde a temperatura ambiente, se conservati a -20 ° C. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come ottenere e fare reagenti. <ol><li> Incubare metafase cromosoma si diffonde con 200 microlitri RNasi A per1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare i vetrini in tampone 2x-SSC due volte per 5 minuti ciascuno seguito da risciacquo con 10 mM soluzione HCl. </li><li> Incubare spread con 1% di pepsina per 10 minuti a 37 ° C, lavare con H 2 O deionizzata e lavare due volte con tampone 2x-SSC per 5 minuti ciascuna. </li><li> Incubare spread con 4% paraformaldeide per 10 minuti e lavare in tampone SSC 2x due volte per 5 minuti ciascuno. </li><li> Disidratare diffondere incubando per 2 min in serie etanolo: 70%, 80% e 95% di etanolo. </li><li> diapositive asciugare all&#39;aria. </li></ol></li><li> Ibridazione diffonde con L1 sonde -labeled retrotrasposizione (cioè, Sneo) ATTENZIONE: Per le sonde dirette marcato, tenere lontano dalla luce in ogni momento. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come ottenere e fare reagenti. <ol><li> Aggiungere 30 ng di Sneo al tampone di ibridazione, di calore a 72 ° C per 10 minuti e raffreddare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 30 ml di soluzione della sonda Sneo all&#39;each diffusione, coprire con coprioggetto e sigillare i bordi con mastice. Garantire l&#39;assenza di formazione di bolle. </li><li> Riscaldare il vetrino a 72 ° C per 5 min su un blocco di calore, gradualmente scendere la temperatura a 37 ° C, e incubare durante la notte in una camera umidificata al buio a 37 ° C. </li></ol></li><li> Lavaggio e visualizzazione (o l&#39;aggiunta di anticorpo secondario) ATTENZIONE: Per le sonde dirette marcato, tenere lontano dalla luce in ogni momento. NOTA: vedere tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come preparare. Si consiglia l&#39;uso di un volume sufficiente a coprire l&#39;intero cromosoma diffusione. Si ricorda che il volume in eccesso sarà perso quando si aggiunge vetrino. <ol><li> Immergere i vetrini in tampone SSC 2x per rimuovere coprioggetto. </li><li> Lavare i vetrini per immersione in tampone 2x-SSC a 45 ° C per 5 min. </li><li> Lavare i vetrini per immersione in tampone di lavaggio a 45 ° C per 5 min, 2x. </li><li> Lavare i vetrini per immersione in tampone SSC 0,1x a 45 ° C per 10 min. </li><li>Lavare i vetrini per immersione in 2x SSC tampone a 45 ° C per 10 min. NOTA: Posizionare una vaschetta Coplin contenente tampone raccomandato in un bagno d&#39;acqua, regolare la temperatura a 45 ° C. </li><li> scivoli raffreddare a temperatura ambiente ed equilibrare i vetrini in tampone di rilevamento. </li><li> Per le sonde marcate diretti, passare al punto 3.4.10. </li><li> Per le sonde marcate indiretti, blocco nel tampone di bloccaggio per 20-30 min e lavare 3 volte in DPBS. </li><li> Incubare con 50 ml di anticorpo secondario (ad esempio, 5 mg / ml di streptavidina-FITC, o αCY3 in tampone di bloccaggio) per 1 ora. </li><li> Lavare i vetrini in 2x SSC per 5 minuti due volte. </li><li> Controcolorare con Hoechst 33342-soluzione (0,1 mg / ml) per 10 min. NOTA: questa colorazione viene fatto per macchiare cromosomi di co-localizzazione con sonda. </li><li> Lavare in DPBS 3x, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio, inserire un vetrino e sigillare i bordi con smalto. </li><li> Analizzare L1 retrotrasposizione utilizzando microscopio a fluorescenza a 40X magnification. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano assenza potenziali interessi in competizione.

Metodologie come il sequenziamento dell&#39;intero genoma, inversa PCR e Southern blotting sono stati impiegati per studiare L1 retrotrasposizione. Sebbene queste metodologie sono estremamente utili nel localizzare dove si verificano inserimenti L1 all&#39;interno di genomi, una sfida confusione per tutti loro è la necessità per la programmazione in-silico per riassemblare sequenze. La metodologia FISH descritta qui è concepito per integrare questi metodi, soprattutto nel caso di studi che ric...

Umana Lungo intersperse nucleare Element-1 (Linea-1 o L1) è un elemento mobili ed autonome che si propaga all&#39;interno del genoma attraverso un &quot;copia e incolla&quot; meccanismo di retrotrasposizione. Un tipico L1 umano è lunga ~ 6 kb e consiste di un 5&#39;UTR (Regione Untranslated) che serve come un promotore, due telai di lettura aperti (ORF): L1 -ORF1 e L1 -ORF2, e un 3&#39;UTR con polyA . coda L1 proteina -ORF1 ha tre ambiti distinti: un dominio della bobina a bobina, RNA riconoscimento Motif e dominio C-terminale, mentre la proteina L1 -ORF2 ha endonucleasi, trascrittasi inversa e cisteina domini ricchi 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 presenta attività chaperone acidi nucleici, mentre L1 -ORF2 fornisce attività enzimatiche, con entrambe le proteine ​​necessarie per la retrotrasposizione 1,2,6. Un ciclo di L1 retrotransposition inizia con la trascrizione dal 5&#39;UTR di L1 </em&gt; mRNA bicistronico dalla RNA polimerasi II, traslocazione nel citoplasma, e la traduzione. Nel citoplasma, L1 -ORF1 mostre sia -Binding cis dove si confeziona il proprio RNA o -Binding trans dove confeziona altri RNA (vale a dire, seno / SVAS / pseudogeni) per formare una particella ribonucleoproteina (RNP) con L1 -ORF2p 7, 8. RNP traslocano nel nucleo dove l&#39;attività endonucleasi di L1 -ORF2p nick DNA genomico (gDNA) per esporre un OH - gruppo 9, che è a sua volta utilizzato per la trascrittasi inversa per innescare e invertire RNA sintetizzare il DNA dalla fine del 3 &#39;. Durante la sintesi inverso, il secondo filamento di DNA viene scalfito 7-20 bp dal sito originale nick per creare interruzioni sfalsati che sono riempiti per formare le firme sequenza di inserzione L1 (per esempio, TTTTAA) chiamati duplicazioni del sito di destinazione (TSD) 9,10. Questo processo è noto come primo obiettivo trascrizione inversa (TPRT) e porta a Insertisu di copie complete o tronco di L1 / altri DNA con TSDS a entrambe le estremità della sequenza inserita. L1 retrotrasposizione ha anche dimostrato di essere mediata attraverso TPRT come non omologa end-joining in alcuni tipi di cellule 11. Il vettore L1 retrotransposition impiegato nei nostri studi è non-episomiale e consiste contrassegnati L1 -ORF1 e 2p guidata da promotori CMV-L1-5&#39;UTR combinate (Figura 1) 12. Le versioni precedenti di questo costrutto sono stati descritti in studi utilizzando lievito e colture di cellule umane 13,14,15. Due promotori CMV distinti situati al 5 &#39;e 3&#39; estremità del vettore, con estremità 3 &#39;collocato in orientamento inverso per guidare l&#39;espressione di neomicina dopo splicing e integrazione. L&#39;indicatore retrotransposition cassette all&#39;estremità 3 &#39;è costituito da un neomicina gene inserito antisenso per L1 -ORFs e reso inattivo mediante separazione in due metà da una globin introni con donatore impiombato (SD) e siti accettore impiombato (SA) (Figura 1). Dopo integrazione in un cromosoma, L1 è trascritto dal promotore comune per produrre un mRNA che consiste di un mRNA bicistronico e inattiva mRNA neomicina. Durante l&#39;elaborazione RNA, l&#39;introne globina è impiombato dal gene neomicina per ripristinare un gene neomicina completamente funzionale. L&#39;mRNA ibrido è confezionato in un RNP in cis e traslocato nel nucleo dove è integrato nel genoma sia come lunghezza totale o troncate inserimenti utilizzando TPRT. Qui si descrive un metodo che utilizza ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde specificamente dirette al gene neomicina impiombato (Sneo) per monitorare i modelli -retrotransposiition L1 e tassi di inserimento a livello di nucleo singolo. L&#39;efficienza e la specificità di rilevazione è stata confermata usando retrotrasposizione competente e costrutti incompetenti e sonde per detect Sneo o la neomicina e globina giunzione introne 16. Questa metodologia rappresenta per alcune delle carenze di analisi retrotrasposizione a base di coltura cellulare, ad esempio più inserimenti, resistenza colonia e l&#39;espansione del clone favorevole.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Labelling Probes</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x tampone incolore</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Regola la concentrazione di dATP, dGTP, dCTP a 2&nbsp; mM e dTTP a 1,5&nbsp; mM in acqua priva di nucleasi.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotina (0,5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0,5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0,5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td> Kit di etichettatura MIRUS FISH Kit di etichettatura MIRUS MIR3625 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH</td> Kit di pulizia <td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Qualsiasi reagente per la pulizia della PCR può essere utilizzato al posto del kit</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> di pulizia PCR NucleoSpin <td>Qualsiasi macchina per termociclatore può essere utilizzata per amplificare il prodotto dell'etichetta.</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Preparazione delle creme cromosomiche</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Aggiungere Colcemid direttamente al terreno di coltura fino a una concentrazione finale di 0,4&nbsp; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Diluire 1&nbsp; Soluzione M KCl a 75&nbsp; Soluzione mM per preparare la soluzione ipotonica</td></tr><tr><td>Soluzione fissativa</td><td></td><td></td> Carnoy <td>Mescolare 3 volumi di metanolo e 1 volume di acido acetico per ottenere la soluzione fissativa Carnoy. Prepara Fresh ogni volta.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Sciogliere Hoechst-33342 in PBS alla concentrazione finale di 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Marcatore a punta di diamante</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>vetrini smerigliati</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Per detecare le cellule, incubare la cellula in tripsina per 5 minuti e inattiva con lo stesso volume di terreno completo.</td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Blocco</td><td></td><td></td> termico <td>Qualsiasi blocco termico può essere utilizzato per questo scopo, anche se si consigliano blocchi montati per vetrini riscaldanti.</td></tr><tr><td>Bicchiere (600&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Riempire il becher con acqua, scaldare fino a ebollizione, utilizzare il vapore caldo per far scoppiare i cromosomi.</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>Qualsiasi microscopio può essere utilizzato per osservare la qualità della diffusione.</td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti e materiali per FISH</td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Croride di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Solfato</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sperma di salmone DNA</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolvere Hoechst-33342 in PBS alla concentrazione finale di 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Sigillante per cemento di gomma/citobond&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Sette barattoli Coplin</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Camera umidificata scura</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico digitale a secco</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td></td>a<td>fluorescenza</td></tr><tr><td>20x citrato di sodio-soluzione salina (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Unire 175 g di NaCl e 88,2&nbsp; g di citrato trisodico con 800 ml di H2O. Agitare regolando a pH 7. Una volta che tutti i sali si sono sciolti, regolare il volume a 1 L e filtrare con 0,22 &micro; m Carta da filtro. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml di Rnasi A</td><td></td><td></td><td>Diluire 20 volte il tampone SSC in 2 volte il tampone SSC. Sciogliere la RNasi A in 2 tamponi SSC a una concentrazione finale di 1&nbsp; mg/ml. Prepara una soluzione fresca ogni volta.</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td></td><td></td> all'1% <td>Sciogliere la pepsina (P/V) in 10 mM di HCl fino a una concentrazione finale di soluzione all'1%. Prepara fresco ogni volta.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Pesare 4,0 g di PFA nella cappa aspirante, aggiungere 50 ml di 1xPBS, riscaldare a 60&nbsp; &deg; C mescolando e regolare il pH con gocce di NaOH fino a quando tutto il PFA si dissolve e la soluzione diventa limpida. Regola il volume a 100&nbsp; ml, filtrare 0,22 &micro; m Carta da filtro e conservare 5 ml di aliquote a -20&nbsp; C. Aliquotazione di disgelo di PFA a 37 gradi C per 10-15 min per gli utilizzi successivi. Regolare la dimensione del filtro in base alla quantità di paraformaldeide.</td></tr><tr><td>Combinare</td><td></td><td></td><td>100 ml di formammide (20%) con 2,5 ml di 20x SSC, regolare a pH 7 con 1,0 M di HCl e portare il volume a 500 ml con H2O di grado molecolare.</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di ibridazione <td>Combina il 50% di formammide, il 10% di destrano solfato, lo 0,1% di SDS e 300 ng/ml di DNA spermatico di salmone in 2 tamponi SSC. La quantità di formammide determina quanto sono focalizzati i cromatidi; Titolate la quantità.</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di rilevamento <td>Diluire 20x il tampone SSC a 4x e aggiungere lo 0,2% di Tween-20 per creare un buffer di rilevamento.</td></tr><tr><td>Combina</td><td></td><td></td> il <td>5% di albumina sierica bovina (BSA) con lo 0,2% di Tween-20 in 4 tamponi SSC.</td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td>disidratante</td><td>Prepara soluzioni di etanolo al 70%, 80% e 95%.</td></tr></tbody></table>

analisi di line-1 retrotrasposizione al nucleo livello singolo

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

L'elemento nucleare lungo intervallato-1 (Linea-1 o L1) rappresenta circa il 17% del DNA presente nel genoma umano. Mentre la maggior parte degli L1sono inattivi a causa di troncamenti 5', ~80-100 di questi elementi rimangono competenti per la retrotrasposizione e si propagano in diverse posizioni in tutto il genoma tramite intermedi di RNA. Mentre si ritiene che gli L1 più vecchi abbiano come bersaglio le regioni ricche di AT del genoma, i bersagli cromosomici degli L1 più recenti e più attivi rimangono scarsamente definiti. Qui descriviamo la metodologia di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) che può essere utilizzata per tracciare i modelli di inserzione di L1 e i tassi di incorporazione ectopica di L1 a livello di singolo nucleo. In questi esperimenti, sono state impiegate sonde di neomicina marcate con fluoresceina isotiocianato/cianine-3 (FITC/CY3) per tracciare la retrotrasposizione di L1 in vitro in cellule HepG2 che esprimono stabilmente L1 ectopico. Questa metodologia previene gli errori nella stima dei tassi di retrotrasposizione posti dalla tossicità e tiene conto del verificarsi di inserzioni multiple in un singolo nucleo.

Un diagramma schematico del vettore retrotrasposizione L1 è presentato in Figura 1. Il vettore costituito da un gene neomicina in orientamento antisenso per L1 ORF che è interrotta da un introne globina in orientamento senso e intramezzato da SD e siti SA. Quando stabilmente integrato in un cromosoma, L1 mRNA è trascritto dal combinato CMV e promotore L1-5&#39;UTR (Figura 1). Durante l&#39;elaborazione RNA, l&#39;introne globin...

Qui ci avvaliamo di una metodologia per monitorare FISH LINE-1 retrotrasposizione a livello di nuclei singolo degli spread dei cromosomi di linee cellulari HepG2 esprimono stabilmente sintetica LINE-1.

Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare e analizzare i tassi e i modelli di retrotrasposizione di L-1 a livello di singolo nucleo mediante ibridazione fluorescente in situ, o FISH. Il principale vantaggio di questa metodologia consiste nel fatto che consente allo sperimentatore di evitare sopravvalutazioni o sottostime dei tassi e dei modelli di retrotrasposizione e, quando integrata con altre metodologie, permette lo studio della retrotrasposizione di L-1 a livello di singoli nuclei. A eseguire oggi questo procedimento è il dottor Pasano Bojang, ricercatore senior del laboratorio.Per iniziare, dopo aver preparato un gel di agarosio allo 0,7%-1% in tampone TAE seguendo il protocollo indicato nel testo, etichettare la sonda SNeo con CY3 o FITC e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora seguendo le istruzioni del produttore. Mescolare la soluzione della sonda SNeo etichettata con il buffer di caricamento del DNA 1X e caricare nei pozzetti del gel di agarosio. Quindi eseguire l'elettroforesi a 75-100 volt per 15-20 minuti.Utilizzando un illuminatore UV, visualizzare la banda della sonda. Con una lama pulita, tagliare la sonda SNeo marcata dal gel. Successivamente, uti

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Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

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