Name: Trattare Topi SCA1 con solubile in acqua composti non-specifico Boost mitocondriale Funzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Scopri un metodo per valutare composti attivatori mitocondriali solubili in acqua nel trattamento dell'atassia spinocerebellare di tipo 1 nei topi. Questa tecnica aiuta a studiare il miglioramento del comportamento cerebellare e della citoarchitettura.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Harry Orr dell'Università del Minnesota per il suo generoso dono di topi transgenici. Vorremmo anche ringraziare i seguenti alunni dello Skidmore College per il loro lavoro nell'esecuzione degli esperimenti precedenti: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson e Cheyanne Slocum. Inoltre, vorremmo ringraziare lo Skidmore College per aver finanziato lo sviluppo di questi metodi.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Se si utilizzano questi metodi come descritto, sono in grado di rilevare e alleviare ossidativa disfunzione mitocondriale fosforilazione mediata in modelli murini malattie neurodegenerative cerebellari. I saggi biochimici e comportamentali combinate sono metodi poliedrici per determinare l&#39;entità del contributo mitocondriale per cerebellare patologia malattia neurodegenerativa. Trattando i topi con l&#39;acido succinico per stimolare il metabolismo e aumentare la funzione mitocondriale, siamo in grado di mostrare un...

I mitocondri sono i principali produttori di adenosina trifosfato (ATP), un coenzima essenziale per energia cellulare, con la maggioranza di ATP mitocondriale prodotto mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS) utilizzando la catena di trasporto degli elettroni. Il cervello, dato le sue alte richieste metaboliche e la sua dipendenza da fosforilazione ossidativa per alimentare l&#39;attività neurale, è altamente sensibile alla disfunzione mitocondriale. Come risultato, disfunzione mitocondriale viene attivato durante il processo di invecchiamento 1 ed è implicato nella patogenesi di molteplici patologie neurodegenerative 2, 3, 4. Pertanto, ne consegue che i mitocondri sono bersagli terapeutici interessanti per neurodegenerazione. In questo protocollo, abbiamo adottato l&#39;uso di atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) come una malattia neurodegenerativa modello per lo studio dei mitocondril erettile e lo sviluppo di terapie mitocondriali mirati. SCA1 è causata da una mutazione polyglutamine (polyQ) repeat espansione nel prodotto del gene atassina-1 che innesca progressiva degenerazione dei neuroni di Purkinje del cervelletto e neuroni di altre regioni del cervello. La linea di topo transgenico qui utilizzato (designato come il mouse SCA1), che esprime una polyQ-mutante ataxin-1 transgene sotto il controllo di un promotore specifico Purkinje cellule, permette l&#39;analisi mirata della componente Purkinje cellule di SCA1 5. I topi sottoposti a SCA1 graduale degenerazione delle cellule di Purkinje e sviluppare andatura atassica 6. La disfunzione mitocondriale complesso e l&#39;efficacia del trattamento mitocondriale mirati possono essere valutati con una batteria di saggi molecolari e comportamentali. La disfunzione mitocondriale complesso è misurata ex vivo mediante saggi di respirazione che consentono di rilevare il consumo di ossigeno alterata all&#39;interno del tessuto cerebellare inla presenza di substrati catena di trasporto degli elettroni e inibitori 7. Test di respirazione sono stati precedentemente usato con il tessuto permeabilizzate, isolati mitocondriali, e tutto il tessuto 7, 8, 9. Essi consentono per la valutazione diretta della funzione mitocondriale a differenza di metodi di raccolta dei dati morfologici, come la microscopia elettronica a trasmissione o immunofluorescenza. L&#39;uso di tutto il tessuto piuttosto che mitocondri isolati impedisce selezione di parte dei mitocondri sani che si possono verificare durante il processo di isolamento 7. Adattate al protocollo, come illustrato, il saggio la respirazione è un metodo prezioso per rilevare la disfunzione mitocondriale in cerebellari stati di malattia neurodegenerative. attivatori non specifici del metabolismo possono essere usati per dedurre disfunzione mitocondriale in modelli di topi transgenici di diseas neurodegenerativeee aiutare lo sviluppo di nuove terapie. Quercetina, coenzima Q10 e creatina sono stati tutti in grado di migliorare la patologia malattia neurodegenerativa in pazienti e in modelli animali di malattia neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Qui vi presentiamo un attivatore metabolico romanzo, acido succinico, per stimolare il metabolismo e aumentare la funzione mitocondriale nella malattia neurodegenerativa. Per assicurarsi che l&#39;attivatore attraversa la barriera ematoencefalica, HPLC è stato impiegato per rilevare consegna al tessuto neurale nei topi trattati 17. Per valutare gli effetti terapeutici dei composti idrosolubili metabolicamente mirata come acido succinico, una batteria di paradigmi comportamentali e studi immunopatologici può essere utilizzato. due per i deficit di coordinazione motoria trovati nelle malattie neurodegenerative cerebellare, il test della pista impronta, test del fascio e il dosaggio verga rotazione accelerando vengono utilizzati per rilevare salvataggio di patologia comportamentale 6, 18, 19. Queste misure sono integrate con la valutazione immunopatologico di citoarchitettura cerebellare valutando lo spessore molecolare strato (definito come Purkinje dendritica delle cellule lunghezza pergolato) e Purkinje conta soma celle all&#39;interno di un lobulo definito di tessuto cerebellare 6, 20, 21. Qui vi presentiamo diversi metodi neuropatologici e comportamentali per il rilevamento e il trattamento della disfunzione mitocondriale con composti solubili in acqua metabolicamente mirato. Usiamo ex vivo l&#39;analisi della respirazione mitocondriale per analizzare disfunzione mitocondriale nel tran SCA1il mouse sgenic. Inoltre, abbiamo dimostrato che i sintomi della malattia e la patologia sono migliorate l&#39;acido succinico richiamo mitocondriale solubile in acqua, implicando ulteriori disfunzione mitocondriale nella progressione della malattia SCA1.

<table><tbody><tr><td>Adenosina difosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Potassio-lattobionato</td><td>Bio-zuccheri</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Acido succinico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetrametil-p-fenilendiammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mezzo di montaggio</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ anticorpo (anti-atassina-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo secondario anti-topo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo secondario anti-coniglio</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Calbindin (capra)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controllo dei topi transgenici</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>topi SCA1</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>Topi wildtype</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L Microtomo</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sledge Microscopio</td></tr><tr><td>confocale Fluoview FV1200</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo-gelatina vetrini</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Unità di controllo dell'elettrodo Oxytherm</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta P.T.F.E.</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>contattare l'autore corrispondente per informazioni</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cell counter plugin (for ImageJ)</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (software rotarod)</td><td>PPP& G</td><td></td><td>contattare l'autore corrispondente per informazioni</td></tr><tr><td>Phidget21.dll (necessario per il software rotarod)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

trattare topi sca1 con solubile in acqua composti non-specifico boost mitocondriale funzione

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

La disfunzione mitocondriale svolge un ruolo significativo nel processo di invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative tra cui diversi atassie ereditarie spinocerebellari e di altri disturbi del movimento segnato da una progressiva degenerazione del cervelletto. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la disfunzione mitocondriale in atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) e valutare l&#39;efficacia del targeting farmacologica della respirazione metabolica attraverso l&#39;acido succinico composto idrosolubile per rallentare la progressione della malattia. Questo approccio è applicabile ad altre malattie cerebellari e può essere adattato ad una serie di terapie idrosolubili. Ex vivo l&#39;analisi della respirazione mitocondriale viene utilizzata per rilevare e quantificare i cambiamenti correlati alla malattia in funzione mitocondriale. Con prove genetiche (dati non pubblicati) e la prova proteomica di disfunzione mitocondriale nel modello SCA1 del mouse, si valuta l&#39;efficacia del trattamento con l&#39;solubile in acqua metabolica richiamo sL&#39;acido uccinic sciogliendo questo composto direttamente in acqua potabile gabbia casa. La capacità del farmaco di passare la barriera emato-encefalica può essere dedotta mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). L&#39;efficacia di questi composti può quindi essere testato l&#39;utilizzo di più paradigmi comportamentali tra cui il rotarod accelerazione, prova trave e analisi impronta. integrità Cytoarchitectural del cervelletto può essere valutata mediante saggi di immunofluorescenza che rilevano nuclei delle cellule di Purkinje e dendriti delle cellule di Purkinje e soma. Questi metodi sono tecniche robuste per determinare la disfunzione mitocondriale e l&#39;efficacia del trattamento con composti solubili in acqua in malattia neurodegenerativa cerebellare.

Attraverso il targeting farmacologico dei mitocondri cerebellare con acido succinico siamo in grado di prevenire la disfunzione mitocondriale in un modello murino della cerebellare SCA1 malattia neurodegenerativa. Il donatore di elettroni canonica di succinato deidrogenasi, acido succinico, è stato sciolto in acqua potabile gabbia casa di topi SCA1 per un mese, con inizio comportamentale valutazione durante la seconda settimana di trattamento e di valutazione neuropatologico dopo il trat...

Presentiamo un protocollo biochimico e comportamentale per valutare l'efficacia dei composti idrosolubili mirati ai mitocondri per il trattamento dell'atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) e di altre malattie neurodegenerative cerebellari.

Trattare Topi SCA1 con solubile in acqua composti non-specifico Boost mitocondriale Funzione

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare e quantificare gli effetti terapeutici degli attivatori mitocondriali idrosolubili sul comportamento cerebellare e sul tessuto nei topi con atassia cerebellare spinale di tipo uno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'atassia cerebellare spinale, come ad esempio se i deficit mitocondriali contribuiscono alla patologia della malattia e la malattia potrebbe essere ostacolata da un attivatore mitocondriale solubile in acqua. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'acido succinico è un composto idrosolubile economico approvato dalla FDA che può essere somministrato direttamente nel cervello attraverso l'acqua potabile.Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi alla terapia di altre malattie neurodegenerative perché i deficit nei complessi di fosforilazione ossidativa mitocondriale si trovano in diverse malattie neurodegenerative, tra cui l'Alzheimer e la malattia di Huntington. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà con l'impostazione iniziale dei paradigmi comportamentali che potrebbero dover essere adattati per ottenere risultati coerenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile perché i passaggi comportamentali possono essere difficili da riprodurre da una sezione scritta del metodo, ma sono facili da replicare con l'aiuto di una registrazione visiva.Per iniziare questa procedura, posizionare la pista con una leggera angolazione verso l'alto verso la scatola di casa, foderata con biancheria da letto e cibo ricompensa. Quindi allinea un foglio di carta bianca sulla pista. Lascia che il mouse si acclimati alla scatola di casa per cinque minuti.Quindi prendi un singolo soggetto e dipingi le zampe posteriori sinistra e destra rispettivamente con vernice non tossica a base d'acqua blu e rossa. Successivamente, posiziona il soggetto all'inizio della passerella e lascialo camminare verso la scatola di casa. Una volta che il soggetto ha raggiunto la scatola di casa, chiudi la botola e lascialo rimanere all'interno della scatola di casa per un minuto prima di tornare alla rispettiva gabbia di casa.Quindi pulisci la pista e la scatola di casa con il 30% di etanolo e sostituisci la lettiera, il cibo premio e la carta della pista per la prossima prova. Allo stesso tempo, raccogli la carta della pista dopo l'esperimento e ispeziona la prova. Una prova di impronta di successo è definita come un minimo di cinque impronte sequenziali in cui il soggetto cammina verso la scatola d'oro senza girarsi o fermarsi.Ora imposta l'apparato del fascio secondo le specifiche della croce a barre con sei diversi raggi. A un'estremità del raggio è stata allestita una scatola domestica oscurata con cibo ricompensa. Per addestrare i soggetti sulla trave, assemblare l'apparecchio con la trave tre.Posiziona delicatamente il soggetto all'estremità del raggio opposta alla scatola di casa. E lascialo camminare attraverso la trave. Concedi a ciascun soggetto fino a tre prove di due minuti per ottenere una corsa di successo.Che è definito come attraversare la trave ed entrare nella casella di casa entro due minuti. Il quarto giorno di allenamento alla trave, assemblare l'attrezzo con la trave uno. E imposta la scatola principale.Posizionare una videocamera davanti all'apparecchio e verificare che l'apparecchio a tutto raggio possa essere chiaramente ripreso in video. Consenti al mouse di attraversare il raggio, filmando ogni prova e registrando il numero di prove riuscite per soggetto per raggio. In questa fase, acclimatare i soggetti al loro serbatoio di corsia per 10 minuti prima dell'inizio della prova.Durante questo periodo di acclimatazione, preparare l'apparato rotarod pulendo ogni corsia dell'apparecchio con etanolo al 30%. Quindi, apri il software rotarod. Impostare le impostazioni di avvio su quattro giri/min, le impostazioni di accelerazione su cinque minuti e le impostazioni di velocità finale su 40 giri/min per fornire un'accelerazione costante da quattro a 40 giri/min per un periodo di cinque minuti.Dopo il periodo di acclimatazione, posizionare i soggetti sulla rotarod nelle rispettive corsie mentre l'asta ruota a quattro giri/min. Una volta che tutti i soggetti sono nelle rispettive corsie, inizia la prima prova. Registrare la latenza da diminuire utilizzando il software dello strumento.Un timer secondario può essere utilizzato come backup. Dopo il completamento della prova, lasciare che ciascun soggetto riposi nei rispettivi serbatoi di corsia per 10 minuti prima della prova successiva per prevenire l'affaticamento. In questa procedura, collegare il tubo della scatola di controllo della temperatura di un microtomo a slitta dal palco a un rubinetto del lavandino.Utilizzare la scatola di controllo della temperatura per raffreddare il tavolino del microtomo a 28 gradi Celsius. Quindi impostare la manopola dello spessore di sezionamento su 50 micrometri. Quindi tamponare una porzione di soluzione OTC di dimensioni ridotte sul palco.Prima che l'OTC si congeli, utilizzare una pinza per posizionare l'emisfero in modo che la superficie di taglio sagittale medio sia rivolta verso il basso sullo strato OTC. Orientare rapidamente e delicatamente il tessuto in modo che la punta laterale dell'emisfero sia rivolta verso la lama. Superiore al palcoscenico.Lavorando a strati, aggiungere ulteriore OTC attorno al tessuto e lasciare che l'OTC si congeli completamente prima di aggiungere lo strato successivo. Quindi aggiungere uno strato sottile di OTC sopra il fazzoletto e congelarlo. Successivamente, sezionare il tessuto con uguale peso corporeo distribuito sulla lama di taglio.Raccogli le sezioni usando un pennello da artista. E posizionarli in una piastra a pozzetti adeguatamente etichettata contenente un XPBS. Tra le sezioni, se necessario, reimpostare lo spessore di taglio a 50 micrometri.Dopo il sezionamento, sostituire il PBS in ciascun pozzetto della piastra con una soluzione di urea. E posizionare il piatto sul ghiaccio. Quando è pronta, trasferire la piastra in un blocco riscaldante impostato sulla temperatura di ebollizione per far bollire le sezioni in soluzione di urea in modo da smascherare gli epitopi per l'immunomarcatura.Tra una fase di ebollizione e l'altra, raffreddare con ghiaccio la piastra contenente le sezioni di tessuto. Dopo l'ebollizione, lavare le sezioni tre volte, sostituendo la soluzione attuale con un XPBS e agitando le sezioni per 10 minuti. Quindi bloccare le sezioni con una soluzione di siero d'asino incubandole nel siero per un'ora con una leggera agitazione a temperatura ambiente.Le sezioni possono ora essere colorate. Una volta etichettate, montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina al 2% con un mezzo di montaggio per ridurre il fotosbiancamento. Copritutto, scivolare e asciugare per una notte a quattro gradi Celsius.Successivamente sigillare i vetrini coprioggetto con smalto per unghie e conservarli a quattro gradi Celsius. Utilizzando un microscopio confocale a scansione, individuare la fessura primaria del cervelletto sotto la luce del campo luminoso. La fase più critica del test amminico consiste nell'individuare con precisione il tessuto cerebellare nei moduli cinque e sei A che fiancheggiano la fessura primaria.L'analisi dei modelli di colorazione e dei lobuli incoerenti garantirà la variabilità del risultato. Con un obiettivo 10X, scansiona ed eccita in sequenza i canali DAPI, Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594. Utilizzando rispettivamente un laser a diodi a 405 nanometri, un laser a gas argon a 488 nanometri e un laser a diodi a 559 nanometri, in combinazione con un divisore di fascio dicroico DM 488559 nanometrico.Quindi separare e raccogliere la luce emessa utilizzando rispettivamente i divisori di fascio SDM 490 e SDM 560 e un filtro passa-banda BA 575675. L'acido succinico è stato disciolto nell'acqua potabile della gabbia domestica di topi SCA1 per quattro settimane a partire dalle 17 settimane di età. I topi SCA1 iniziano a mostrare il fenotipo dell'atassia a cinque settimane di età.Le valutazioni comportamentali sono state condotte durante il periodo di trattamento come segue. Saggio dell'impronta durante la settimana 17. Beam assay durante la settimana 18 e rotarod accelerato durante la settimana 19.A 20 settimane di età i topi sono stati sacrificati e il tessuto cerebellare è stato raccolto per i test di aminopatologia, HPLC e respirazione. Ecco i dati rappresentativi del test dell'impronta che mostrano un cancello wild type trattato con veicolo, un cancello SCA1 trattato con veicolo e un cancello SCA1 trattato con acido succinico. Qui i dati dell'analisi del fascio mostrano il miglioramento delle prestazioni del fascio dei topi SCA1 con trattamento con acido succinico.Il trattamento con acido succinico migliora significativamente le prestazioni di accelerazione del rotarod dei topi SCA1, come dimostrato dall'aumento della latenza alla caduta. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di applicare la tecnica in modo coerente a ciascun soggetto in più prove. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la respirazione mitocondriale per rispondere a ulteriori domande, come il miglioramento della respirazione attraverso singoli complessi di fosforilazione ossidativa in seguito alla somministrazione di acido succinico.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire saggi comportamentali e neuropatologici. Che valutano il miglioramento del comportamento cerebellare e della citoarchitettura.

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