Name: Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Impara a isolare e coltivare progenitori di oligodendrociti da cortecce di ratto e a quantificare l'oligodendrogenesi in vitro. Questo metodo combina isolamento efficiente con analisi affidabile per studiare mielinizzazione e malattie demielinizzanti.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo veloce e affidabile per isolare OPC ratto e quantificare in oligodendrogenesis vitro in risposta a fattori sperimentali. Utilizzando selezione positiva, alte rese di OPC vitali e puri sono utilizzati direttamente a fini sperimentali. Questo metodo semplifica l&#39;isolamento, la coltura, e passi differenziazione in un arco di tempo 1 Settimana, e cellule fissate possono essere convenientemente conservato a 4 ° C per diverse settimane senza alcuna perdita ...

Efficiente conduzione nervosa nel sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) richiede mielinizzazione degli assoni dagli oligodendrociti. Durante lo sviluppo, oligodendrociti nascono da un pool di cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) che si pensa di migrare dalle zone ventricolari del prosencefalo sviluppo e tubo neurale 1. Dopo OPC migrazione differenziano in maturi, oligodendrociti mielinizzanti che non solo facilitare l&#39;utilizzo efficiente di propagazione degli impulsi, ma anche fornire gli assoni con il supporto trofico 2. L&#39;adulto CNS mantiene una popolazione abbondante di OPC che si disperdono in tutta la materia grigia e bianca che comprende circa il 5-8% di tutte le cellule 3. A seguito di un insulto demielinizzante, OPC migrano al sito di lesione, proliferano e si differenziano per sostituire guaine mieliniche persi o danneggiati in assoni esposti. Tuttavia, in alcune impostazioni malattia / infortunio, questo processo si trova ad essere inefficiente o può fallire completamente 4. Mentredemielinizzazione cronica è pensato di aggiungere al peso della malattia, oligodendrogenesis e rimielinizzazione efficiente può alleviare i sintomi 5. È stato quindi interessante studiare OPC in vitro per determinare l&#39;effetto di fattori sperimentali oligodendrogenesis. Insight nelle diverse fasi di differenziazione degli oligodendrociti è stato reso possibile tramite l&#39;identificazione di marcatori cellulari specifici stadi. Auto-rinnovamento delle cellule progenitrici precoci sono definite dalla loro espressione del fattore di crescita derivato dalle piastrine del recettore alfa (PDGFRα), neurale / glia antigene 2 (NG2) e A2B5 6-8. Come OPC iniziano il loro programma di differenziazione e si ritirano dal ciclo cellulare, che downregulate espressione di questi marcatori e cominciano a esprimere le proteine ​​indicativi di premyelinating oligodendrociti tra ciclico-nucleotide 3&#39;-fosfodiesterasi (CNPase) e O4. Infine, la loro differenziazione in oligodendroc più maturoYtes si caratterizza per l&#39;espressione di proteine ​​della mielina-associata, tra cui glicoproteina mielina-associata (MAG), proteolipid proteina (PLP), e proteina basica della mielina (MBP). MBP è una proteina periferica di membrana intracellulare e una componente importante della guaina mielinica. Topi privi MBP sviluppano una grave fenotipo in cui CNS mielinizzazione è significativamente diminuiti con conseguente tremori, convulsioni e morte precoce 9,10. Questo ruolo importante MBP in myelination ha portato al suo uso come marker di differenziazione degli oligodendrociti sia in vitro che in vivo 11. La quantificazione del MBP può essere effettuata mediante diverse metodologie differenti. RT-PCR e analisi Western Blot consentono per la quantificazione dei livelli di MBP sotto diversi regimi di trattamento. Immunocytochemistry è un approccio qualitativo comune che può anche essere quantitativa quando si utilizzano approcci microscopia basati su telecamere. Sebbene questi sistemi sono affidabili e fondamentale perlo studio della differenziazione degli oligodendrociti, ognuno ha i propri svantaggi che limitano il loro uso in screening di stupefacenti. In primo luogo, la quantità di OPC primari che sono necessari per la RT-PCR ed analisi Western blot riduce il numero di variabili che possono essere esaminati simultaneamente. Mentre il requisito cella per immunocitochimica è molto più basso, consistente lasso di tempo deve essere dedicato a ogni esperimento, se la quantificazione è l&#39;obiettivo. Numerose immagini devono essere catturate e poi quantificati per facilitare l&#39;analisi sperimentale. Questi avvertimenti diventano ostacoli importanti da considerare per gli studi che richiedono la valutazione elevato throughput. Qui si descrive un metodo che utilizza aspetti fondamentali sia dal immunocitochimica e metodologie Western Blot per mielina quantificazione, riducendo significativamente sia il numero di cellule necessario e il tempo per completare l&#39;analisi quantitativa.

<table><tbody><tr><td>Materiali Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS senza Ca2+ e Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x 10</td></tr><tr><td>cm Piastre di Petri in polistirene</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione ottica</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>Dissociazione Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotatore di tubi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione del tessuto neurale del rotatore del tubo di dissociazione (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Kit di dissociazione enzimatica</td></tr><tr><td>PBS con Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro cellulare</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>A2B5 Purificazione della colonna&nbsp; Microsfere </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td> Colonne LS per <td>anticorpi A2B5 legate a perline</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Colonne a selezione magnetica</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS con Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0,50%</td></tr> <tr><td><forte>Materiali di coltura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Triiodotironina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Clemastina fumarato sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Quetiapina emifumarato sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Siero Bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Oligoelementi B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 Supplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Visiplate nero a 24 pozzetti con coperchio</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Grado di coltura tissutale</td></tr> <tr><td><forte>Immunocitochimica e quantificazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>monoclonale di topo anti-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1.000 Diluizione</td></tr><tr><td>coniglio policlonale anti-Actin</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Diluizione</td></tr><tr><td>coniglio policlonale anti-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1.000 Diluizione</td></tr><tr><td>capra anti-topo 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Diluizione</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-topo</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Sistema di imaging a infrarossi</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione delle culture rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei oligodendrogenesis utilizzando dual-infrarossi fluorescenza scansione

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

L'oligodendrogenesi efficiente è l'obiettivo terapeutico di una serie di aree di ricerca tra cui le lesioni del midollo spinale, l'ipossia neonatale e le malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla e la mielite trasversa. La mielinizzazione è necessaria non solo per facilitare la rapida propagazione dell'impulso all'interno del sistema nervoso centrale, ma anche per fornire supporto trofico agli assoni sottostanti. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) possono essere studiate in vitro per aiutare a identificare i fattori che possono promuovere o inibire la differenziazione degli oligodendrociti. Ad oggi, molti dei metodi disponibili per valutare questo processo hanno richiesto un gran numero di cellule, limitando così il numero di condizioni che possono essere studiate in qualsiasi momento, o metodi di quantificazione ad alta intensità di lavoro. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento di un gran numero di OPC altamente puri insieme a un metodo rapido e affidabile per determinare l'oligodendrogenesi da più condizioni contemporaneamente. Le OPC sono isolate da cortecce neonatali di ratto P5-P7 e coltivate in vitro per tre giorni prima della differenziazione. Quattro giorni dopo il differenziamento, l'oligodendrogenesi viene valutata utilizzando un test a scansione a fluorescenza a doppio infrarosso per determinare l'espressione della proteina mielina.

OPC A2B5-positivi vengono isolati attraverso la selezione delle cellule positivo utilizzando un sistema di separazione della colonna magnetica. Prima della procedura di isolamento, l&#39;intero cervello viene rimosso da cuccioli di ratto che sono tra P5 e P7. Una volta che l&#39;intero cervello si stacca con successo dal cranio, bulbi olfattivi e del cervelletto vengono rimossi con pinza chirurgica sottili (Figura 1A). Per isolare tessuto corticale cerebrale ipotalamo, t...

Gli oligodendrociti sono le cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura dei loro precursori, le cellule progenitrici degli oligodendrociti, da cortecce di ratto, nonché un metodo quantitativo rapido e affidabile per valutare l'oligodendrogenesi in vitro in risposta a fattori sperimentali.

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare cellule progenitrici oligodendrocitiche di ratto e quantificare l'oligodendrogenesi in risposta a fattori sperimentali. Un'oligodendrogenesi efficiente rappresenta l'obiettivo terapeutico in numerosi ambiti di ricerca, tra cui lesioni del midollo spinale, ipossia neonatale e malattie demielinizzanti come la mielite trasversa e la sclerosi multipla. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel combinare un protocollo per l'isolamento di elevate quantità di OPC con un metodo rapido e affidabile per determinare l'oligodendrogenesi in diverse condizioni sperimentali simultaneamente.Per iniziare questa procedura, sterilizzare tutti gli strumenti da dissezione utilizzando un sterilizzatore a perle riscaldate. Successivamente, aggiungere da 15 a 20 millilitri di PBS in un tubo conico da 50 millilitri. Posizionare il tubo conico sul ghiaccio e utilizzarlo per contenere il tessuto corticale tritato durante la dissezione.Successivamente, aggiungere PBS freddo in una piastra Petri da 10 centimetri che verrà utilizzata per la dissezione al microscopio ottico. Dopo l'eutanasia dei ratto, tagliare la pelle dietro le orecchi

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Primaria, umani fetali di derivazione cerebrale, le cellule progenitrici multipotenti...

Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale

Questo video mostra la procedura per isolare i neuroni gangliari retinici (RGN) dalla retina di un ratto e cocoltivarli con cellule gliali che inguainano l'olfatto. Questo metodo consente di studiare il potenziale neuro-rigenerativo degli OEG dopo una lesione neurale.

Coculturazione dei neuroni gangliari retinici con glia inguainante olfattiva

Il video dimostra un protocollo per differenziare le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti e indurre la mielinizzazione in una co-coltura con neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG). Gli OPC sono trasdotti con vettori lentivirali che codificano per una proteina di segnalazione che regola la mielinizzazione. Le OPC trasdotte vengono co-coltivate con neuroni DRG per valutare la differenziazione in oligodendrociti e la mielinizzazione indotta dalla proteina di...

Un test di mielinizzazione indotta da trasduzione in vitro per cellule precursori di oligodendrociti

Fonte: Schott, J. T., {et al. Preparazione di colture progenitrici di oligodendrociti di ratto e quantificazione dell'oligodendrogenesi mediante scansione a fluorescenza a doppio infrarosso. J. Vis. Exp. (2016).  Questo video dimostra l'uso dell'imaging a doppia fluorescenza per valutare la differenziazione degli oligodendrociti da cellule precursori (OPC) isolate dal cervello di un cucciolo di ratto. Il processo include il fissaggio delle cellule, l'etichettatura di marcatori specifici con...

Imaging a doppia fluorescenza per identificare gli oligodendrociti differenziati

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocoltura di neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati con glia inguainante olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assonale adulta. J. Vis. Exp. (2020).Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione della rigenerazione assonale in neuroni gangliari retinici di ratto axotomizzati (RGN) co-coltivati con cellule gliali di rivestimento olfattivo umano immortalizzate. Gli RGN sono immunomarcati, con soma rossi e assoni verdi. Le immagini...

Imaging e quantificazione della rigenerazione assonale nei neuroni del ganglio retinico di ratto assotomizzati

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Impara a isolare e coltivare progenitori di oligodendrociti da cortecce di ratto e a quantificare l'oligodendrogenesi in vitro. Questo metodo combina isolamento efficiente con analisi affidabile per studiare mielinizzazione e malattie demielinizzanti.

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione (Video) | JoVE Journal

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

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