Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare cellule progenitrici di oligodendrociti di ratto e quantificare l'oligodendrogenesi in risposta a fattori sperimentali. L'oligodendrogenesi efficiente è l'obiettivo terapeutico in numerose aree di ricerca, tra cui le lesioni del midollo spinale, l'ipossia neonatale e le malattie demielinizzanti come la mielite trasversa e la sclerosi multipla. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina un protocollo per l'isolamento di un gran numero di OPC con un metodo rapido e affidabile per determinare l'oligodendrogenesi in più condizioni sperimentali contemporaneamente.

Per iniziare questa procedura, sterilizzare tutte le apparecchiature di dissezione utilizzando uno sterilizzatore a microsfere riscaldato. Quindi, aggiungere da 15 a 20 millilitri di PBS in un tubo conico da 50 millilitri. Posiziona il tubo conico sul ghiaccio e usalo per trattenere il tessuto della corteccia a dadini durante la dissezione.

Quindi, aggiungere il PBS freddo a una capsula di Petri di 10 centimetri che verrà utilizzata per la dissezione al microscopio ottico. Dopo aver sacrificato i cuccioli di ratto, taglia la pelle dietro le orecchie lungo la linea mediana usando piccole forbici. E staccare i lembi di pelle all'indietro.

Quindi, taglia il cranio lungo la linea mediana dal tronco encefalico agli occhi. E fai attenzione a non tagliare troppo in profondità per preservare la struttura della corteccia sottostante. Successivamente, fai due tagli laterali inferiori al cervelletto inserendo piccole forbici chirurgiche nel forame magno.

Praticare un ulteriore taglio tra gli occhi anteriormente ai bulbi olfattivi. Sbucciare con cura ogni metà del cranio. Togliete l'intero cervello e mettetelo in una capsula di Petri di 10 centimetri riempita di PBS freddo.

Sotto un microscopio ottico da dissezione, rimuovere i bulbi olfattivi e il cervelletto con una pinza chirurgica fine. Capovolgi il cervello in modo che la superficie ventrale sia visibile. Quindi, utilizzando una pinza dritta sottile, eseguire una dissezione smussata posizionando le punte delle pinze chiuse tra la corteccia e l'ipotalamo a una profondità di circa due terzi del cervello.

Aprire le pinze una volta posizionate, quindi ripetere la procedura per l'altro emisfero. Dopodiché, stuzzica la corteccia dalle regioni dell'ipotalamo e del mesencefalo. Rimuovere l'ipotalamo, il talamo e il mesencefalo tenendo il mesencefalo sulla sua superficie posteriore e sbucciandolo verso l'estremità anteriore del cervello.

Successivamente, recidere le connessioni anteriori. Usando una pinza di dissezione piegata fine, rimuovere l'ippocampo e recidere la sua connessione con la corteccia. Quindi, rimuovere lo striato rimanente raschiando dalla corteccia sottostante con un movimento diagonale verso l'esterno.

Elimina i vasi sanguigni e le meningi dalla superficie ventrale della corteccia. Quindi, capovolgi il cervello in modo che la superficie dorsale sia visibile. Sbucciare le meningi dalla corteccia sottostante dove si trova il bulbo olfattivo.

Ripeti le procedure per un totale di tre o quattro cuccioli di ratto. E metti tutte le cortecce sezionate in una capsula di Petri. Tritateli con una lama di rasoio sterilizzata fino a ottenere dei pezzi di un millimetro per un millimetro.

Quindi raccogliere i fazzoletti risciacquando il piatto con PBS prima di rimetterlo sul ghiaccio. Ora, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur collegata a un controller per pipette, dissociare meccanicamente il tessuto pipettandolo da dieci a quindici volte o fino a quando i pezzi di tessuto non si sono ridotti di dimensioni e la soluzione è diventata torbida. Quindi, rimettere il campione nell'incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius per 15 minuti con rotazione continua.

Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBS a ciascun campione e filtrare l'omogenato attraverso un filtro per pori da 40 micrometri posizionato su una provetta da 50 millilitri. Quindi, sciacquare il filtro con altri uno o due millilitri di PBS. Raggruppare tutti i campioni di omogeneizzato in una provetta conica da 50 millilitri e acquisire una conta cellulare complessiva.

Dopo aver eseguito la conta cellulare, dividere uniformemente l'omogenato nelle provette coniche da 15 millilitri e centrifugarle per 10-12 minuti a 300 g. Adescare ogni colonna LS aggiungendo cinque millilitri di tampone della colonna. E raccogliere il flusso attraverso un tubo conico da 15 millilitri.

Una volta che il tampone della colonna è completamente passato attraverso la camera superiore, applicare 1000 microlitri di sospensione cellulare su ciascuna colonna e lasciare che le cellule scorrano per gravità. Quindi, rimuovere ogni colonna e posizionarla in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di tampone per colonna e immergere il tampone attraverso la colonna a una velocità elevata per rimuovere le cellule legate e liberarle dalla colonna.

Per placcare le cellule, diluirle con mezzi di proliferazione OPC a 60.000 cellule per millilitro. Pipettare 500 microlitri di cellule lungo il lato di ogni pozzetto nero e chiaro di una piastra a 24 pozzetti. Mescolare le cellule scuotendo la piastra orizzontalmente, con un movimento a forma di otto.

In questa procedura, posizionare un puntale da 200 microlitri su una pipetta di vetro Pasteur per assicurarsi che il pozzetto non venga danneggiato durante l'aspirazione. Quindi, aspirare i terreni dai pozzetti di coltura un gruppo di trattamento alla volta per evitare di seccare le cellule. Successivamente, aggiungere lentamente 500 microlitri di miscela master di trattamento lungo il lato del pozzetto utilizzando una pipetta da un millilitro.

Incubare le colture ed eseguire uno scambio completo di terreni di trattamento con nuovi terreni di trattamento ogni due o tre giorni. Al termine del periodo di trattamento desiderato, aspirare il fluido. Aggiungere lentamente 400 microlitri di PFA sul lato del pozzetto per fissare le cellule.

E incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, aspirare il PFA e aggiungere lentamente 500 microlitri di D-PBS sterile per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio altre due volte e non aspirare il lavaggio finale.

Ora, portare la piastra a temperatura ambiente, aspirare i pozzetti e aggiungere 250 microlitri di D-PBS contenente il cinque percento di NGS e lo 0,1 percento di Triton x-100. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora agitando delicatamente gli orbitali. Preparare la soluzione di incubazione primaria diluendo l'anticorpo monoclonale di topo anti MBP e l'anticorpo policlonale di coniglio anti olig2 in D-PBS contenente il cinque percento di NGS.

Quindi, incubare gli anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte per 16-18 ore con un leggero agitamento orbitale. Durante il lavaggio della piastra, preparare la soluzione di incubazione secondaria diluendo gli anticorpi anti topo 680 e anti coniglio 800 in D-PBS contenente il cinque percento di NGS. Successivamente, aspirare il lavaggio finale e aggiungere 250 microlitri di soluzione di incubazione secondaria.

Proteggere la piastra dalla luce e incubarla a temperatura ambiente per un'ora agitando delicatamente gli orbitali. Successivamente, scansiona la lastra utilizzando un sistema di imaging in grado di rilevare emissioni di fluorescenza a 700 nanometri e 800 nanometri. Come punto di partenza, impostare l'offset focale a tre e le sensibilità a un punto cinque per MBP, cinque punti zero per l'actina e tre punti cinque per olig2.

Regolare i valori di sensibilità secondo necessità per evitare la sovraesposizione del segnale. In questo schema, il saggio DIFS inizia con OPC di ratto positivi ad A2B5 appena isolati e placcati su recipienti di coltura codificati PLL. Queste colture vengono proliferate per tre giorni in presenza di 20 nanogrammi per millilitro di PDGFAA, e poi trattate con fattori sperimentali in terreni freschi privi di PDGF il giorno zero.

Il terreno di trattamento viene completamente reintegrato il secondo giorno. E le cellule vengono fissate con il 4% di paraformaldeide il quarto giorno. Qui, l'immunocitochimica per olig2 e MBP è stata eseguita sulle colture rappresentative il giorno zero e il giorno quattro utilizzando Dapi come colorante anti-nucleare.

Queste colture mostrano una colorazione costitutiva per il marcatore cellulare del lignaggio di oligodendrociti, Olig2, nei giorni zero e quattro. Mentre la colorazione per il marcatore di oligodendrociti maturi MBP era evidente solo entro il quarto giorno. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come purificare, coltivare e differenziare OPC di ratto A2B5 positivi al fine di quantificare l'effetto di fattori sperimentali sull'oligodendrogenesi.

L'identificazione dei fattori che promuovono l'oligodenrogenesi è di particolare rilevanza per lo studio delle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla. Una volta padroneggiate, le tecniche qui descritte possono aiutare a identificare tali fattori e, in ultima analisi, a sviluppare terapie migliori.