Name: Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Impara un metodo rapido di intubazione tracheale nei topi per somministrare bleomicina nei polmoni. Questa tecnica riproducibile non richiede attrezzature specializzate e riduce i tempi di recupero.

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Gli autori ringraziano Brian Johnson del Istologia ed Imaging Nucleo presso l&#39;Università di Washington per aiutare con la colorazione tricromica e l&#39;analisi. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni HL098067 e HL089455.

L&#39;animale cura e l&#39;uso comitati istituzionali (IACUC) presso l&#39;Università di Washington e Cedars-Sinai Medical Center hanno approvato il lavoro degli animali necessari per questi studi. 1. Preparazione <ol><li> Sterilizzare entrambe le pinze punta smussata e il divaricatore tramite autoclave. </li><li> Usando una cappa di sicurezza biologica, preparare uno stock di lavoro di BLM in PBS dalla polvere liofilizzata. Sonicare la soluzione per 10 minuti a 35 Khz per assicurare una miscelazione uniforme. Nota: Si raccomanda un volume totale di tra 30 e 45 ml per evitare variazioni pipettaggio sulla fascia bassa, e il soffocamento con volumi maggiori. </li><li> Preparare un lavoro pulito che comprende circa 1 m 2 per la procedura stessa, così come luoghi designati per gabbie sia prima che dopo la procedura. </li><li> Fissare la base della tavola procedimento al banco immediatamente davanti ricercatore ponendo 2 o 3 strisce di nastro laboratorio attraverso la base e sottocaricoying panchina. Vedere la Figura 1 per ulteriori specifiche sulla creazione di un bordo. </li><li> Legare una sola lunghezza di dimensioni 4,0 filo di sutura tra le due viti di posizionamento della scheda procedura. </li><li> Generare uno spirometro improvvisato rimuovendo e scartando il pistone da tre 1 ml siringhe, e depositando 60 ml di PBS nella parte superiore di ciascun cilindro per formare una chiusura ermetica. Fissare il mozzo del catetere vagamente ad una delle siringhe e posizionarlo su un lato della tavola. </li><li> Aspirare 300 ml di aria in una siringa da 1 ml e posizionarlo su un lato della tavola. </li><li> Tagliare un pezzo aggiuntivo di nastro di circa 6 pollici di lunghezza e metterlo da parte. Questo verrà utilizzato per fissare l&#39;animale alla scheda in fase 2.4. </li><li> Impostare una camera isoflurano. Attaccare O 2, isoflurano, e vuoto per porte appropriate sia sulla camera di esposizione ed il vuoto gioco. In alternativa, somministrare anestetico in un isoflurano compatibile biologicocappa di sicurezza. </li></ol> 2. intubazione <ol><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano nella camera fino a quando non perde conoscenza e la respirazione rallenta a un tasso adeguato. Un&#39;esposizione tipico include 4% isoflurano e 2% O 2 da 3 a 4 min, e il risultato ideale è 2 a 2,5 min di sedazione. Ciò corrisponde ad un tasso di respirazione di 1 respiro ogni 2 secondi. </li><li> In attesa che la sedazione per impostare in, aspirare tra 30 e 45 ml di BLM in una pipetta e metterlo da parte. </li><li> Quando si è pronti, sospendere il mouse sedato dai suoi incisivi superiori dal filo attaccato alle viti di posizionamento della piattaforma procedura. Assicurarsi che dorso dell&#39;animale in posizione piana rispetto alla superficie della piattaforma. </li><li> Facendo attenzione a non limitare la ventilazione, posizionare un pezzo di nastro liberamente attraverso il (caudale) parte inferiore della cavità toracica, appena sopra il diaframma. Il posizionamento deve essere abbastanza stretto per mantenere il corretto allineamento durante il procedure, ma non così stretta che limita la respirazione. </li><li> Accendere l&#39;illuminatore tra l&#39;80% e il 100% di intensità e orientare il collo d&#39;oca in modo che sia da 1 a 2 cm dalla superficie della pelle, vicino al plesso solare. Controllare periodicamente la punta di un collo d&#39;oca per il calore per garantire che essa non danneggia il mouse. </li><li> In piedi dietro la piattaforma, utilizzare le sterili, pinze estremità smussata per individuare la lingua. Facendo attenzione ad evitare gli incisivi inferiori, delicatamente presa e disegnare la lingua fuori della cavità orale. </li><li> Utilizzando la mano rimanente, inserire il divaricatore e utilizzarlo per appiattire la lingua contro il pavimento della cavità orale. Rilasciare le pinze, ma lasciare il divaricatore sul posto per i due passaggi successivi. </li><li> Orientare la luce in modo che la trachea è visibile guidando il collo d&#39;oca prossimalmente dal livello del plesso solare fino a raggiungere il livello dei bronchi mainstem. Nota: La trachea può essere facilmente distinta dall&#39;azione della respirazione, WHIch provoca la luce emessa fluttuare in intensità. Quando posizionato correttamente, questa struttura sarà distinguibile nel piano assiale di un perno centrale di luce con luce ambientale minimo nella cavità orale stessa. </li><li> Angle la siringa in modo che segua il percorso naturale della trachea, e abbassare la punta del catetere 22-G, con la siringa attaccata contenente la gocciolina, direttamente nel lume. La bolla PBS inizierà a salire e scendere ad ogni respiro sul posizionamento di successo. Nota: Questa azione può essere ritardata di alcuni secondi a causa della sedazione profonda. </li><li> Nutrire il catetere in un ulteriore 5 mm. Rimuovere la abbassalingua. </li><li> Spostare la siringa per la mano opposta, e impugnando il mozzo, rimuovere delicatamente la siringa. </li><li> Deposito tra 30 e 45 ml di BLM nel centro dell&#39;interno del mozzo del catetere, collegare la seconda siringa ed erogare 300 microlitri di aria nel mozzo. </li><li> Sostituire il secondosiringa con il primo contenente la bolla di PBS. La bolla continuerà a salire e scendere se la procedura è stata eseguita con successo. </li></ol> Cura 3. post-procedurale <ol><li> Rimuovere il catetere e il nastro, e mettere l&#39;animale in un luogo caldo e asciutto fino a quando non riprende conoscenza - di solito entro un paio di minuti. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nei casi in cui aerosol è impraticabile a causa della limitata disponibilità di reagente, la sicurezza, o il costo, amministrazione diretta tracheale è un metodo superiore per la consegna degli agenti esogeni nei polmoni 16 transtracheale instillazione è stato ampiamente utilizzato per raggiungere questo obiettivo.; Tuttavia, come con tutti gli interventi chirurgici, porta con sé anche il potenziale di complicazioni causate dalla procedura stessa, e non necessariamente l&#39;agente essendo instillato. 13...

Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, 1 modelli murini continuano ad essere prezioso per la modellazione di biologia umana e patogenesi della malattia. 2 Dal punto di vista allevamento, i topi sono facili da gestire, hanno un basso tempo di allevamento, una durata di vita accelerato, e sono relativamente poco costoso a casa. Con lo sviluppo di diversi ceppi genetici e strategie (ad es., Condizionali knock-out, topi reporter, approcci lineage tracing, ecc), così come l&#39;ampia gamma di reagenti disponibili (ad es., Anticorpi, proteine ​​ricombinanti, inibitori, ecc), i topi sono diventati un elemento essenziale organismo modello vertebrato per scoprire i processi di omeostasi e malattie umane. 3 I topi sono stati particolarmente preziosi per lo studio le malattie polmonari, tra cui lesione acuta polmonare (ALI) e fibrosi polmonare. 4 ALI negli esseri umani può essere causata da traumi, lesioni, o sepsi ed è caratterizzata da epiteliale eperdita endoteliale (es., edema), l&#39;infiammazione e la fibrosi nascente. In molti pazienti, ALI progredisce nella sua forma grave, sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), che si traduce spesso in fibrosi e la morte a causa di insufficienza respiratoria. 5,6 fibrosi polmonare è una progressiva, una patologia fatale caratterizzata dall&#39;eccesso deposizione di matrice extracellulare , in particolare collagene di tipo I, portando a deficit della funzionalità respiratoria. 7,8 somministrazione di bleomicina (BLM) è il modello più diffuso e meglio caratterizzato per indurre ALI e fibrosi negli animali da esperimento. 9 Sebbene BLM-indotta fibrosi polmonare nei roditori fa non ricapitolare completamente i fenotipi umani fibrotiche, 10 studi di topo con questo modello hanno portato alla scoperta di importanti fattori che influenzano l&#39;insorgenza e la progressione della malattia. 11 Mentre l&#39;esatto meccanismo (s) dietro fibrogenesi BLM-indotta sono sconosciuti, il danno avvioè pensato per sorgere dal contatto-dipendente rotture del DNA nelle cellule epiteliali che rivestono le vie aeree di conduzione e alveoli, in particolare, di tipo 1 pneumociti. 12 Il bisogno di contatto diretto tra BLM e l&#39;epitelio polmonare mette in evidenza l&#39;importanza di un robusto percorso di consegna , e queste preoccupazioni sono anche germano a una vasta gamma di trattamenti mirati per le vie aeree distali, tra cui proteine ​​ricombinanti, anticorpi, siRNA, virus, batteri, particelle, e altro ancora. Aspirazione orofaringeo (OPA) è stato ampiamente utilizzato per questo scopo 13, ma un importante una lacuna di OPA è che una parte dell&#39;agente erogata sia assorbito nel tratto gastrointestinale, determinando così imprecisione della dose somministrata. Un altro approccio ampiamente utilizzato è instillazione transtracheale, che coinvolge tracheostomia sotto forte anestesia per esporre la trachea e instillazione di un agente direttamente nelle vie respiratorie. 14 Tuttavia, non solo può taleuna procedura sia indesiderabile a causa della sua invasività, ma è anche in termini di tempo, richiede un bel po &#39;di allenamento, e provoca una lesione potente per le vie respiratorie sono stati sviluppati. 15,16 Diversi protocolli che coinvolgono l&#39;amministrazione diretta di agenti in trachea senza la necessità di un intervento chirurgico, 16,17,18,19,20 tempi di recupero ma questi metodi comportano estesi causato da anestetici potenti, l&#39;uso di attrezzature costose (es., otoscope / laringoscopio, disponibili in commercio tavole procedura, fibra ottica fili, ecc), un eccesso di manipolazione nella cavità orale, l&#39;incertezza del dosaggio. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice di somministrazione tramite intubazione che permette un ricercatore modo rapido, economico e affidabile infondere un reagente nel polmone murino con limitato rischio di danno residuo ai tessuti circostanti.

<table><tbody><tr><td>Bleomicina per iniezione, 30 unità/fiala</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>103720</td><td>Per ottenere i migliori risultati, BLM deve essere sospeso in PBS, aliquotato e conservato come aliquote liofilizzate monouso Abbassalingua</td></tr> con <tr><td>pinza con estremità</td><td></td><td></td><td></td>smussata</tr><tr><td>(ad es. elettrodo a lama Valleylab piegato, 2,4")&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>E1551G</td><td>Prima dell'uso, creare una curva di 45 gradi a 1,5 cm dalla punta della lama. Un depressore adatto può anche essere creato da qualsiasi attrezzo metallico di dimensioni simili.</td></tr><tr><td>Exel Safelet Catetere 22G X 1"</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso per tubercolina con punta a slittamento da 1 ml (200/sp, 1600/ca)</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore da 0,2 ml e puntali</td><td></td><td></td><td></td>filtranti</tr><tr><td>Illuminatore in fibra leggera. Modello 181-1: Modello 180 accoppiato con l'illuminatore standard a doppio collo d'oca</td><td>Dolan Jenner Industries, Inc.</td><td>181-1</td><td>Si sconsiglia l'uso di illuminatori a LED a bassa potenza in quanto non riescono a illuminare in modo sufficiente la trachea.</td></tr><tr>Scheda <td></td><td></td><td>per intubazione</td><td>Vedere il diagramma 1.</td></tr><tr><td>Nastro per etichette colorato: 0,5&nbsp; in. Ampio</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-15A</td><td></td></tr><tr><td>Ossigeno&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Il prodotto deve essere sterile</td></tr><tr><td>Bobina di sutura intrecciata nera in seta non sterile, 91,4 m, misura 4-0</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>macchina per anestesia da tavolo Attrezzatura medica per isoflurano</td><td>Highland Attrezzatura</td><td></td> medica <td>http://www.highlandmedical.net/</td></tr> <tr><td>Slide Top Camera di induzione per topo isoflurano</td><td>MIP / Tecnologie di anestesia</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>FORANO (isoflurano, USP) liquido per inalazione 100 mL&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Nanozoomer Sistema di Patologia Digitale</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di Quantificazione ELISA IgM&nbsp;</td><td>Laboratori di Bethyl</td><td>E90-101</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo migliore per rapid intubazione della trachea nei topi

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale per studiare le malattie polmonari umane. La tossicità della bleomicina è un modello comunemente usato per studiare sia il danno polmonare acuto che la fibrosi e sono stati sviluppati diversi metodi per la somministrazione di bleomicina (e altri agenti tossici) nei polmoni. Tuttavia, molti di questi approcci, come l'instillazione transtracheale, presentano svantaggi intrinseci, tra cui la necessità di forti anestetici e chirurgia di sopravvivenza. Questo articolo riporta un metodo rapido e riproducibile di intubazione intratracheale che prevede una lieve anestesia inalatoria, la visualizzazione della trachea e l'uso di uno spirometro surrogato per confermare l'esposizione. Come prova di concetto, ai topi C57BL/6 di 8-12 settimane sono stati somministrati 2,0 U/kg di bleomicina o un volume equivalente di PBS, e sia il danno che gli endpoint fibrotici sono stati misurati dopo l'esposizione. Questa procedura consente ai ricercatori di trattare un'ampia coorte di topi in un periodo relativamente breve con poche spese e cure post-procedura minime.

Topi intubati sono stati monitorati giornalmente per la perdita di peso e di angoscia, e si sono sacrificati 4, 10 o 17 giorni dopo tramite iniezione intraperitoneale di 2,5% 2,2,2- tribromoethanol. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato raccolto in tre lavaggi di PBS come descritto altrove 21 , e il polmone destro è stato fissato in formalina 10%, inclusi in paraffina, e colorati con tricromica di Masson dalla University of Washington Istologia ed Imaging...

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l&#39;amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un'infusione rapida, semplice e affidabile di reagenti nei polmoni di topi tramite intubazione. Il metodo limita inoltre il rischio di danni residui ai tessuti circostanti ed è economico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia polmonare di base e dei meccanismi delle malattie.Come lesione polmonare acuta e fibrogenesi. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, non richiede attrezzature specializzate né tempi di recupero prolungati. La procedura deve essere eseguita utilizzando strumenti sterilizzati.Pertanto, sterilizzare sia le pinzette a punta piatta che il depressore. In una cappa sterilizzata, preparare una soluzione di lavoro del reagente da somministrare mediante intubazione. Si raccomanda un volume in bolo compreso tra 30 e 45 microlitri.Sonicare la soluzione per 10 minuti a 35 kilohertz per assicurare un mescolamento uniforme. Ora, preparare l'area di lavoro. Destinare almeno un metro quadrato di spazio all'area di lavoro stessa.Oltre a posizioni distinte per gli animali sia prima che dopo la procedura. Preparare ora una tavola per la procedura. Questo modello personalizzato è ricavato da un foglio di alluminio e rinforzato con una staffa a T.Sono disponibili anche tavole commerciali simili. Utilizzando alcuni pezzi di nastro, fissare la base della tavola operativa al banco in modo che si trovi direttamente di fronte all'operatore. Quindi legare un tratto di sutura 4.0 tra le due viti di posizionamento della tavola operativa.Successivamente, costruire un spirometro. Rimuovere i pistoni da tre siringhe da un millilitro. Quindi caricare fino a 60 microlitri di PBS nella parte superiore della canna di ciascuna siringa.Fissare in modo approssimativo una di queste tre siringhe all'estremità di un catetere. Durante l'uso, l'aria proveniente dalla trachea farà salire e scendere il PBS all'interno della siringa. Posizionare il tutto accanto alla tavola delle procedure.Posizionare altre due siringhe aggiuntive a portata di mano come riserva. Successivamente, aspirare in una quarta siringa 300 microlitri di aria e posizionarla da un lato della tavola. Preparare anche alcuni pezzi di nastro lungo sei pollici per fissare l'animale alla tavola.Quindi, se necessario, preparare una camera per isoflurano. Collegare i tubi dell'ossigeno, dell'isoflurano e del vuoto alle porte appropriate della camera e del sistema di aspirazione. Iniziare anestetizzando il topo.È importante ricordare che fattori come l'età, il peso e lo stato di salute dell'animale possono modificare la risposta agli anestetici; pertanto, ogni laboratorio dovrebbe ottimizzare l'esposizione all'isoflurano in base alle proprie esigenze. Nel frattempo, caricare il bolo del reagente in una punta di pipetta e metterla da parte. Quando il topo sarà sedato, sospenderlo per gli incisivi superiori al filo presente sulla piattaforma operatoria, in modo che il dorso dell'animale giaccia piatto sulla superficie della piattaforma.Ora, avendo cura di non ostacolare la ventilazione, fissare con del nastro adesivo in modo lento la parte inferiore della cavità toracica, appena sopra il diaframma, alla piattaforma, per mantenere l'allineamento dell'animale durante l'intervento. Successivamente, impostare l'illuminatore flessibile tra l'80 e il 100%. Posizionare la luce a uno o due centimetri dalla superficie della pelle in prossimità del plesso solare e verificare regolarmente che non stia surriscaldando la pelle. Da dietro la piattaforma, utilizzare la pinzetta con estremità smussata per individuare la lingua.Quindi, avendo cura di evitare gli incisivi inferiori, afferrare delicatamente la lingua e tirarla fuori dalla cavità orale. Mentre si tiene ferma la lingua, appiattirla con il depressore nella mano non dominante, permettendo così alle pinze di rilasciare la presa. Ora, guidare il gooseneck approssimativamente dal plesso solare ai bronchi principali per illuminare la trachea.La trachea può essere facilmente distinta anche grazie all'azione della respirazione, che provoca una variazione dell'intensità della luce mentre questa esce dalla trachea. Quando è correttamente posizionata, la trachea appare come un fascio luminoso centrale, con una quantità minima di luce ambientale nella cavità orale. Il catetere non deve entrare nella cavità orale finché la visione della trachea non è ottimale.La trachea non può essere visualizzata mediante la manipolazione né della sorgente luminosa né del depressore. I ricercatori dovrebbero rilasciare la lingua e ripetere nuovamente la procedura. Successivamente, inclinare la siringa in modo da seguire il percorso naturale della trachea.Abbassi la punta del catetere da 22 gauge, con la siringa collegata contenente il PBS, direttamente nel lume. Ora, inserisca ulteriormente il catetere di cinque millimetri e rimuova il depressore linguale. Se posizionato correttamente, la bolla di PBS nel corpo della siringa inizierà a salire e scendere con ogni respiro.Sii paziente durante la ricerca di questo indicatore, poiché sia una sedazione profonda che leggera può modificare la frequenza della respirazione. Successivamente, sposta la siringa alla mano non dominante. Mentre tieni fermo il connettore, rimuovi delicatamente la siringa lasciando il catetere al suo posto.Dalla mano dominante, depositare il bolo di reagente preparato direttamente al centro del connettore del catetere. Quindi collegare la seconda siringa con 300 microlitri di aria ed espellere l'aria nel connettore. Questo aiuterà a garantire una buona distribuzione del bolo nei polmoni.Ora, rimuovere la siringa e sostituirla con una siringa contenente la bolla di PBS. La bolla continuerà a salire e scendere se la procedura è stata eseguita correttamente. A questo punto, rimuovere il catetere e il nastro.Posizionare l'animale in un luogo asciutto e caldo fino al ripristino della coscienza, il che avviene tipicamente entro un paio di minuti. I topi intubati sono stati monitorati giornalmente per la perdita di peso.I topi sono stati prelevati a quattro, 10 e 17 giorni dopo l'intubazione intratracheale con bleomicina. È stato effettuato il lavaggio broncoalveolare da questi polmoni ed è stato analizzato. Livelli elevati di IgM hanno dimostrato un aumento significativo dipendente dal tempo della permeabilità polmonare, indicativo di una disfunzione della barriera epiteliale e/o endoteliale.I polmoni destri sono stati fissati e colorati con la tricromia di Masson. È stata quantificata la risposta fibrogenica, un marcatore ben consolidato del contenuto totale di collagene. Le sezioni di istologia hanno evidenziato un ispessimento del tessuto interstiziale polmonare dipendente dal trattamento e un aumento delle lesioni fibrotiche.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un minuto se correttamente praticata. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la manipolazione dei tessuti molli circostanti la trachea non è necessaria né raccomandata. E ciò può compromettere sia la salute dell'animale sia l'integrità dell'esperimento.

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