Name: Isolamento di CD146 + cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Impara l'isolamento di cellule stromali mesenchimali CD146+ residenti nei polmoni di ratto. Questo metodo combina digestione enzimatica, separazione a gradiente di densità e selezione con microsfere magnetiche.

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JJPC è supportato da una borsa di studio post-dottorato del Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Il MAM riceve una borsa di studio per merito dalla Fondazione Accademica Nazionale Tedesca - Studienstiftung des Deutschen Volkes ed è sostenuto da una borsa di studio dell'EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). La BT è supportata dal CIHR, dalla Canadian Lung Association, dalla Stem Cell Network e dal Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Animal Care dell&#39;Università di Ottawa (animale protocollo etica í-1696). Cura degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali. 1. Isolamento di cellule polmonari mesenchimali stromali <ol><li> Preparare la miscela di enzimi in un tubo da 50 ml: pesare 30 U proteasi neutra, 2.500 U Collagenasi I e 500 U DNAsi I. Tali importi sono sufficienti per i polmoni di un topo adulto o dei ratti. Preparare il giorno di isolamento e conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> cuccioli di ratto a Sacrifice giorno 13 di un&#39;iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (0,2 ml, 65 mg / ml). Utilizzare il pizzico riflesso di punta per stabilire incoscienza. La morte dell&#39;animale è assicurata con l&#39;apertura del torace, come indicato di seguito. </li><li> Sterilizzare la pelle spruzzando l&#39;animale con il 70% di etanolo e aprire con cautela la gabbia toracica con le forbici chirurgiche, a partire il diaframma e il taglio verso il lato rostrale, facendo molta attenzione a nondanneggiare i polmoni. Stendere la cassa toracica aperta con fascette emostatici, o in alternativa, tagliare via la gabbia toracica per consentire l&#39;accesso al torace. </li><li> Exsanguinate l&#39;animale rimuovendo cuore. Per rimuovere il cuore, cogliere il timo e il cuore con le piccole pinze e tagliare questi via con le forbici chirurgiche. Subito dopo, assorbire il sangue con una garza fino non più sangue esce l&#39;aorta e l&#39;arteria polmonare recisa. </li><li> Rimuovere i polmoni dal torace come segue: tenere la trachea con piccole pinze, poi recidere la trachea con le forbici chirurgiche sul lato rostrale. Tirando delicatamente il pacchetto polmone fuori del torace, tagliare qualsiasi tessuto connettivo sul lato dorsale lungo la gabbia toracica per liberare i polmoni. </li><li> Sever polmoni dal aorta e dell&#39;esofago tagliando lungo la membrana con le forbici chirurgiche. Ora che i polmoni sono completamente liberi dal torace rimuovere il sangue residuo delicatamente con una garza. </li><li> Rimuovere la trachea e bronchi con surforbici gici e trasferire con attenzione i lobi polmonari ad un tubo da 50 ml contenente freddo da 35 ml 30% di citrato-fosfato-destrosio Adenina (CPDA-1) anticoagulante (26,30 g citrato trisodico diidrato, 3,27 g di acido ascorbico monoidrato, 2,22 g monosodico fosfato monobasico, 31.80 g D-glucosio, 0,275 g adenina in 1 L purificato H 2 O; filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron membrana prima dell&#39;uso) in tampone fosfato (PBS) per rimuovere il sangue e detriti. </li><li> Dopo 5 min risciacquo nel 30% CPDA-1 / PBS, trasferire il polmone in un tubo da 50 ml contenente 35 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS) (RT), capovolgere delicatamente per rimuovere citrato. Trasferimento in una provetta contenente 35 ml di Dulbecco PBS + sodio-glucosio piruvato + (DPBS ++) (RT). Ogni fase di risciacquo dovrebbe durare circa 5 min. Nota: DPBS ++ può essere ordinato in commercio o così composto 21: cloruro di calcio diidrato 132,4 mg, magnesio cloruro esaidrato 100 mg, cloruro di potassio (anidro) 200 mg, potassio fosfato monobasico (anidro) 200 mg, cloruro di sodio (anidro) 8,000 mg, sodio fosfato bibasico (anidro) 1,144.5 mg, D-glucosio 1000 mg, piruvato di sodio 36 mg in 1 L H 2 O purificato, pH 7.3. filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron membrana prima dell&#39;uso. </li><li> Sciogliere il mix dell&#39;enzima aggiungendo 10 ml DPBS ++ (preriscaldata a 37 ° C) e invertendo delicatamente fino a completa dissoluzione. </li><li> Trasferire i polmoni in un tubo da 50 ml e tagliare il polmone sulla parete del tubo utilizzando un bisturi fino finemente macinate. Aggiungere la miscela enzimatica al tessuto (10 ml enzima miscela / per topo adulto / dei ratti polmone), chiudere la provetta e incubare a 38 ° C con agitazione (sia in un miscelatore termico, un bagno d&#39;acqua o acqua bagno con regolare agitazione manuale). La durata dipende dal tipo di tessuto: il tessuto fetale 60 min, giovane / adulto tessuto 90-120 min, fibrotica tessuti adulti 120-150 min. </li><li> Arrestare il digestione chelanti cationi bivalenti with 200 microlitri di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,15 M, pH 7.4. Filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron membrana prima dell&#39;uso). </li><li> Aggiungere siero bovino 20 ml 5% fetale (FBS) / PBS e passare l&#39;intera sospensione attraverso 100 micron colino cella in un nuovo tubo 50 ml. Lavare il tubo e la cella filtro con 10 ml 5% FBS / PBS, portando il volume totale di 40 ml. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg, RT. </li><li> Rimuovere il surnatante (pellet deve essere chiaramente visibile), risospendere in 40 ml 5% FBS / PBS e ripetere la centrifugazione passo 1.13. </li><li> Risospendere in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) e lo strato accuratamente in 3 ml supporti gradiente di densità (1.073 g / cm 3) in una provetta da 15 ml 14. Per ottenere una buona interfase, è fondamentale che la stratificazione della sospensione singola cella avviene con un angolo °&gt; 45 a velocità molto bassa. </li><li> Centrifugare 20 min a 900 xg, medio (5/10) accelerazione, senza decelerazione, 19 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule presenti nella interphase e risospendere in 10 ml di PBS sterile. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg, 21 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di pre-riscaldato medio completato cultura L-MSC (minimo supporto essenziale Aquila, modifica alfa (αMEM), integrato con 2 mmol L-glutammina per 500 ml αMEM, 20% vol / vol FBS e 1% vol / vol penicillina / streptomicina / amfotericina B. </li><li> Ripetere la fase di centrifugazione 1.18. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere in 10 ml di pre-riscaldato terreno fresco. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore automatico di cellule e piatto ad alta densità, poiché la maggior parte delle cellule in questa fase non sono aderenti plastica. L&#39;esatta densità di placcatura dipende dalla specie animale e all&#39;età, ad esempio, le cellule di un polmone di topo adulto sono seminate a 10 5 cellule / cm 2, mentre le cellule da un polmone ratti non sono sufficientemente densa ad una densità di semina di 1-2 x 10 4 cellule / cm 2 </sup&gt;. Utilizzare 0,2 ml L-MSC cultura medio / cm 2. </li><li> Culture L-MSC in un umidificata 5% O 2, 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C. </li><li> Cambiare media 24 ore dopo la semina iniziale, e successivamente ogni 3 giorni dopo il risciacquo una volta con PBS. Le cellule devono essere coltivate fino 80-90% di confluenza, che richiede 3-5 giorni in media seconda all&#39;animale di origine. Superiore confluenza promuoverà differenziazione in fibroblasti. </li></ol> 2. selezione di celle CD146 + Lung mesenchimali stromali <ol><li> Rivestimento di biglie magnetiche con anticorpo secondario <ol><li> Coat le perline magnetici con anticorpo secondario biotinilato, in un rapporto di 10 mcg perline anticorpo secondario / 100 ml magnetico in un fondo rotondo sterile 2 ml esageratamente in condizioni sterili. Utilizzare 10 microlitri anticorpo secondario per attesi cellule di 0,5 x 10 6, e utilizzare un minimo di 100 l perline magnetici e 10 mg di anticorpi. Nota: Il rapporto ditibodies utilizzati per volume di perline possono differire tra i produttori, si prega di consultare le istruzioni del produttore per le perline di scelta. Per questo protocollo, si prega di fare riferimento alla tabella 1 per le perline e gli anticorpi che sono stati utilizzati per l&#39;ottimizzazione di questo protocollo. </li><li> Incubare in un mixer campione rotante per 30 minuti a 30 giri / min (rpm), a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le sfere in 1,5 ml di sterile 0,1% albumina sierica bovina (BSA) / PBS e trasferimento in un 3 ml tubo tondo di fondo (citometria a flusso tubo). Lavare il esageratamente con un ulteriore 1,5 ml 0,1% BSA / PBS e trasferire al tubo 3 ml. </li><li> Posizionare il tubo su un magnete appropriato e attendere 2 min finché tutti perle sono attaccati alla parete posteriore del tubo e la soluzione rimane chiaro. Rimuovere il deflusso e ripetere lavaggio con 3 ml 0,1% BSA / PBS due volte. </li><li> Risospendere le sfere in 3 ml 0,1% BSA / PBS e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce. Utilizzare entro 5 giorni. </li></ol></li><li> Etichettatura CD146 + L-MSC<ol><li> Raccogliere le cellule mesenchimali dopo il risciacquo con PBS usando una soluzione delicata non-tripsina. Nota: Volumi dipendono dalle dimensioni del pallone di coltura (0,2 ml / cm 2 media o PBS). <ol><li> Togliere terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con PBS sterile. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di soluzione delicata non tripsina (vedi Tabella 1). Incubare a 37 ° C in incubatore finché le cellule hanno rimosso, circa 10 min quando si utilizza la soluzione in Tabella 1. </li><li> Inattivare l&#39;enzima aggiungendo mezzo di coltura L-MSC, e centrifugare per 5 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS e contare le cellule con un emocitometro o contatore di cellule automatizzato. Nota: Il volume di 0,1% BSA / PBS dipende dalle dimensioni del pallone di coltura: puntare 5 o 10 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Ripetere il passaggio 2.2.2 e risospendere la quantità dedicato di cellule in 3 ml 0,1% BSA / PBS (blocchi delle Nazioni Unitesiti di legame specifici e mantiene vivo le cellule). Mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Preparare una 3 ml rotonde tubo inferiore con l&#39;anticorpo anti-CD146 primaria, e tenere in ghiaccio. Nota: La concentrazione di anticorpo primario che viene aggiunta alla quantità dedicato di cellule dipende l&#39;anticorpo utilizzato. Per un anticorpo anti-CD146 ratto suggerito vedi Tabella 1. </li><li> Aggiungere il volume totale di cellule dal punto 2.2.3 al tubo con l&#39;anticorpo primario. Chiudere e incubare 30 min su un mixer campione rotante a 15 rpm, 4 ° C. </li><li> celle di centrifugazione per 5 min a 500 xg, 4 ° C, Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. passo centrifuga di ripetizione. </li><li> Risospendere le cellule nella soluzione 3 ml contenente perle legate agli anticorpi secondari che è stato preparato in base alle istruzioni riportate nella sezione 2.1 e incubare 30 minuti su un mixer campione rotante a 15 rpm, 4 ° C. </li></ol></li><li> Selezione CD146 + L-MSC<ol><li> Collocare la provetta contenente il etichettato CD146 + L-MSC sul magnete. Le cellule positive saranno attratti parte posteriore del tubo. Senza spostare il tubo o toccare le perline, raccogliere il surnatante con le cellule negative lentamente con una pipetta Pasteur sterile (questi possono essere sia raccolti o scartati basato sul disegno sperimentale). </li><li> Rimuovere la provetta dal magnete e risospendere le cellule in 3 ml 10% BSA / PBS. Ripetere la procedura di selezione descritto al punto 2.3.1. altre quattro volte (passi Σ 5 di selezione). </li><li> Risospendere il CD146 + L-MSC in terreno di coltura pre-riscaldato L-MSC e ritornare al magnete. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere in terreno di coltura L-MSC e piatto in un pallone di coltura di dimensioni adeguate (0,2 ml / cm 2). Come regola empirica, cellule piastra dello stesso pallone di coltura dimensioni da cui le cellule sono state sollevate prima bead-selezione. Il numero di CD146 + L-MSC, e quindi la densità di placcatura, saràdipenderà dall&#39;età, specie e ceppo dell&#39;animale sorgente. Sempre puntare per una densità di placcatura di ~ 5.000 cellule / cm 2. Nota: Le perle non disturbare la crescita cellulare e gradualmente scomparire come le cellule proliferano. </li></ol></li></ol> 3. Cellule di congelamento <ol><li> Utilizzare i seguenti supporti di congelamento: soluzione pentastarch 60% (10% nel pentastarch 0,9% NaCl), il 20% FBS, il 12,5% CPDA-1, 2,5% di NaCl (0,9%), 5% dimetilsolfossido (DMSO) 22. Nota: Se non tutti gli ingredienti sono disponibili, una soluzione contenente 5% DMSO, 30% FBS e 65% αMEM è una buona alternativa. </li><li> Risospendere le cellule a 0.5 x 10 6 cellule / ml, aliquote in cryovials di 1 ml ciascuna e congelare O / N a -80 ° C usando un contenitore di congelamento. </li><li> Trasferire in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido il giorno successivo. </li></ol> 4. Cellule scongelamento <ol><li> Scongelare una fiala di cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in 10 mlterreno di coltura pre-riscaldato e centrifugare per 5 minuti a 500 xg, 21 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura 10 ml. Cellule seme in una coltura cellulare tappo ventilato trattati palloni a 5.000 cellule / cm 2 a 0,2 ml / media cm2 (ad esempio, 15 ml per un pallone da 75 centimetri 2). </li><li> Cellule di coltura in 5% O 2, 5% di CO 2 fino a 80-90% confluenti per la raccolta e / o di uso sperimentale. Over-confluenza sarà indurre la differenziazione. Quando semina a 5.000 cellule / cm 2, L-MSC raggiungerà 80-90% di confluenza entro 3-4 giorni di coltura. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;isolamento e la coltura di primaria L-MSC offre l&#39;opportunità di comprendere meglio la loro funzione e la loro interazione con le altre popolazioni cellulari a livello cellulare, e il loro ruolo nello sviluppo del polmone, della salute e della malattia. Ciò è particolarmente importante in quanto la mancanza di uno specifico singolo marcatore di queste cellule rende quasi impossibile studiare queste cellule in situ. Come per tutte le popolazioni cellulari primarie, si dovrebbe tenere a mente che queste...

Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l&#39;uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Durante lo sviluppo, anche nel polmone, mesenchima è una fonte importante di spunti di sviluppo, e MSC residenti sono un probabile candidato per essere al centro di questo. Inoltre, la prova sta emergendo che le MSC residenti siano disturbati in malattie degli adulti, tra cui il cancro 1,2 e fibrosi 3. L&#39;ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di queste cellule 4. Stem cell antigen-1 (Sca-1) è stato identificato nei topi come marker per una varietà di cellule staminali dei tessuti, e può essere utilizzato per l&#39;isolamento di L-MSC 5, ma ha purtroppoNon si conoscono ortologhi in altre specie 6. I ricercatori hanno riportato una varietà di metodi di isolamento per l&#39;isolamento di L-MSC sia da tessuto polmonare o fluido. Questi variano da cellule attivate a fluorescenza (FACS) metodi basati selezione per CD31 - / CD45 - / CD90 + cellule 7, CD31 - / CD45 - / epiteliale molecola di adesione delle cellule (EpCAM) - Sca-1 + cellule 8 /, multidrug resistance trasportatore ATP cassette legame G (ABCG2) cellule positive 9 o colorante Hoechst 33342 efflusso 10, per l&#39;aderenza plastica 11,12 e la migrazione fuori del tessuto tritato 13. I vantaggi del metodo qui presentato sono diverse volte. Usando una digestione enzimatica dolce e gradiente di densità 14, si ottengono tutte le celle della gamma di densità che includono MSC ma escludono cellule epiteliali o endoteliali. La successiva fase di adesione in plastica garantisce che solo il mesenchcellule ymal aderiscono e rimanere nella cultura, eliminando leucociti. Più importante, tuttavia, la fase di selezione CD146 + permette l&#39;eliminazione dei fibroblasti, come queste cellule non esprimono CD146. L&#39;espressione della molecola di adesione delle cellule CD146 è correlata positivamente con multipotenza, ed è quindi un buon indicatore per eliminare i fibroblasti da una popolazione di cellule mesenchimali 15-19. Questo è un vantaggio rispetto all&#39;utilizzo CD90 come marcatore di selezione, in quanto non solo è espresso in MSC ma anche in lipofibroblasts 5,20. In questo protocollo abbiamo scelto esplicitamente una selezione perlina magnetica, in quanto è più delicato sulle cellule, e l&#39;intero procedimento può essere realizzata in condizioni sterili. Un altro importante vantaggio di questo metodo di isolamento rispetto al metodo conseguenza, è che è relativamente veloce, 6-10 giorni al contrario di un mese o più per il metodo di conseguenza. Da tre a cinque giorni dopo l&#39;isolamento iniziale popolazione mesenchimale è pronto per CD146 + sele<html> ction; dopo altri tre a cinque giorni le cellule CD146 + sono pronti per essere utilizzati negli esperimenti o possono essere congelati per un uso successivo. Il tempo di diminuzione della cultura migliora la qualità delle cellule come MSC transdifferenziare verso fibroblasti in prolungata coltura ex vivo 19. Infine, a causa della natura del protocollo, è possibile applicare questo metodo ad altre specie semplicemente scegliendo anticorpi appropriati, o anche ad altri sistemi organici regolando la scelta di enzimi digestivi e tempo di incubazione. Un protocollo dettagliato di questo metodo di isolamento è dato seguito, e una visione schematica del isolamento e la successiva selezione della sottopopolazione CD146 + è fornito in Figura 1A e 1B rispettivamente. Inoltre, i dettagli sono inclusi per passaging, congelamento e scongelamento queste cellule. annuncio / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di isolamento di cellule polmonari mesenchimali (A) e la successiva CD146 + selezione cella (B) min = minuti.; EDTA = etilendiamminotetraacetico; 2 ° Ab = anticorpo secondario; alfa-CD146 Ab = primaria anticorpo anti-CD146; ve le cellule CD146 = cellule negative; + ve cellule positive cellule CD146 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Proteasi neutra</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Preparare il giorno dell'isolamento e conservare a 4 gradi C fino all'uso</td></tr><tr><td>di Collagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Preparare il giorno dell'isolamento e conservare a 4 ° deg; C fino all'uso</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Preparare il giorno dell'isolamento e conservare a 4 gradi C fino all'uso</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico (Eutanil)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublino,</td> <td>Irlanda-Utilizzare</td> <td>0,2 ml per cuccioli di ratto tra 20-30 g; gli animali più grandi potrebbero aver bisogno di più.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS + Sodio-piruvato + Glucosio</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Molto importante per l'uso di questo tipo di D-PBS, poiché il calcio e il magnesio presenti in questo D-PBS facilitano la digestione enzimatica</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Mezzi a gradiente di densità. Per ottenere una buona interfase, è fondamentale che la stratificazione della sospensione a singola cellula avvenga ad una >45°; angolo a velocità molto bassa, e che la successiva centrifugazione sia effettuata a 19 &deg;C.</td></tr><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotico-Antimicotico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicillina/Streptomicina/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Perle magnetiche</td></tr><tr><td>coniglio policlonale biotinilato anti-topo IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Anticorpo secondario biotinilato che corrisponde all'anticorpo CD146 anti-ratto descritto di seguito</td></tr><tr><td>DynaMag5-magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet che è raccomandato per l'uso con Dynabeads. NOTA: il magnete deve essere scelto in base al produttore s istruzioni delle perline magnetiche di scelta.</td></tr><tr><td>TrypLE express&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Alternativa delicata senza tripsina, utilizzare 1 ml di TrypLE express/25 cm2 superficie. Dopo il distacco, 10 ml di terreno di coltura L-MSC sono sufficienti per inattivare 3 ml di</td></tr><tr><td>anticorpo TrypLE anti-ratto CD146</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12,5 &mu; l per 0,5 x 106 cellule</td></tr><tr><td>Pentaspan (soluzione di pentaamido)</td><td>Bristol-Myers Squibb</td> <td>Canada-Può</td> <td>essere ottenuto attraverso i servizi locali di donazione del sangue o i dipartimenti di ematologia. In alternativa, si potrebbe utilizzare la soluzione di pentastarch PSI 20% (Preservation Solutions, PST001) diluita 1:1 con NaCl allo 0,9%.</td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento Mr. Frosty</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Migliora la vitalità durante il congelamento di L-MSC durante la notte a -80 &deg; E</td></tr></tbody></table>

isolamento di cd146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da rat polmoni

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l&#39;uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Inoltre, essi hanno probabilmente un ruolo nello sviluppo normale dell&#39;organo, e sono stati attribuiti ruoli nella malattia, in particolare quelli di natura fibrotica. L&#39;ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di queste cellule. La tecnica di isolamento qui descritta si applica molteplici caratteristiche di MSC residenti del polmone (L-MSC). Al sacrificio dei ratti, polmoni vengono rimossi e risciacquati più volte per rimuovere il sangue. Dopo la dissociazione meccanica bisturi, i polmoni sono digeriti per 2-3 ore utilizzando un mix di tipo collagenasi I, proteasi neutra e il tipo di DNasi I. Il richiederlod singola sospensione cellulare viene successivamente lavato e stratificato su gradiente di densità media (densità 1,073 g / ml). Dopo centrifugazione, le cellule dal interfase vengono lavati e piastrate in fiasche di coltura trattato. Le cellule sono coltivate per 4-7 giorni in fisiologico 5% O 2, 5% di CO 2 condizioni. Per esaurire fibroblasti (CD146 -) e di garantire una popolazione di soli L-MSC (CD146 +), selezione positiva per le cellule CD146 + avviene attraverso la selezione perla magnetica. In sintesi, questa procedura produce affidabile una popolazione di primaria L-MSC per ulteriori studi e la manipolazione in vitro. A causa della natura del protocollo, può facilmente essere tradotto ad altri modelli animali sperimentali.

Due delle caratteristiche fisiche più affidabili di MSC, densità e aderenza plastica, sono utilizzati nella prima parte di questo protocollo per ottenere la frazione di cellule mesenchimali del polmone che contiene L-MSC. Sebbene l&#39;interfase gradiente di densità comprenderà monociti e macrofagi, oltre alle cellule mesenchimali del polmone, l&#39;aderenza plastica seguita da 3-5 giorni di coltura garantisce che solo le cellule mesenchimali del polmone rimangono. In effetti questa popo...

Questo protocollo descrive una tecnica di isolamento per ottenere cellule mesenchimali stromali residenti polmonare primaria da ratti, attraverso l&#39;uso di digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità, aderenza plastica e CD146 + selezione perlina magnetica.

Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare in vitro le cellule stromali mesenchimali residenti positive per CD146, o MSC, isolate dal polmone del ratto, utilizzando una combinazione di digestione enzimatica, separazione su gradiente di densità, adesione alla plastica e selezione mediante microsferette. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie polmonari riguardo al modo in cui le MSC polmonari vengono coinvolte nelle patologie e al loro ruolo nella modulazione immunitaria e nella riparazione dei tessuti. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità, la riproducibilità e la facile applicabilità a diverse specie di animali sperimentali o a diversi tessuti.Le prime fasi della procedura saranno dimostrate da Arul Vadivel, un ricercatore associato del mio laboratorio. Per rimuovere il polmone dalla cavità toracica, afferrare la trachea con pinzette piccole e utilizzare forbici chirurgiche per separare la trachea dal lato rostrale. Successivamente, mentre si estrae delicatamente l'insieme polmonare dalla cavità toracica, recidere ogni tessuto connettivo presente sul lato dorsale lungo la gabbia toracica.Tagliare lungo il diaframma per staccare i polmoni dall'aorta e dall'esofago e utilizzare una garza per rimuovere delicatamente qualsiasi residuo di sangue dal tessuto polmonare. Con le forbici, rimuovere la trachea e i bronchi e posizionare con attenzione i lobi polmonari in un tubo da 50 millilitri contenente 35 millilitri di anticoagulante CPDA freddo e PBS per eliminare il sangue e i detriti. Dopo cinque minuti, trasferire i polmoni in un nuovo tubo da 50 millilitri contenente 35 millilitri di PBS sterile a temperatura ambiente.E capovolgere delicatamente per rimuovere il citrato. Dopo cinque minuti, lavare i polmoni in un nuovo tubo da 50 millilitri contenente 35 millilitri di PBS di Dulbecco sterile a temperatura ambiente, integrato con piruvato di sodio e glucosio, e capovolgere delicatamente. Successivamente, trasferire i polmoni in un altro tubo da 50 millilitri e utilizzare un bisturi per tritare finemente il tessuto contro la parete del tubo.È molto importante tagliare il tessuto in pezzi molto piccoli per garantire un rendimento cellulare massimo e lavorare rapidamente per assicurare una buona vitalità cellulare. Quando tutto il tessuto è stato tritato, aggiungere all'estrazione l'enzima appena preparato e chiudere ermeticamente il tubo.Quindi incubare i pezzi di tessuto a 38 gradi Celsius con agitazione delicata per il periodo di digestione appropriato. Al termine dell'incubazione, arrestare la digestione aggiungendo 200 microlitri di EDTA sterile filtrato. Aggiungere 20 millilitri di PBS integrato con FBS alla sospensione di tessuto e far passare l'intera sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri.Quindi risciacquare il tubo di digestione e il filtro cellulare con 10 millilitri di FBS/PBS ed aspirare il lavaggio insieme al campione filtrato. Dopo aver centrifugato le cellule due volte, risospendere il secondo pellet in quattro millilitri di FBS/PBS a temperatura ambiente. E stratificare lentamente le cellule sopra tre millilitri di mezzo a gradiente di densità con un angolo superiore a 45 gradi.Battendosi ad un angolo superiore a 45 gradi tra la sospensione cellulare e il mezzo del gradiente di densità, si evitano forze di taglio che potrebbero mescolare le cellule con il mezzo del gradiente, permettendo così la formazione degli strati; se avviene mescolamento, non si otterrà alcun gradiente di densità. Separare le cellule mediante centrifugazione e raccogliere l'interfase. Successivamente, lavare le MSC polmonari in 10 millilitri di PBS sterile e risospendere il pellet nel mezzo di coltura completo per MSC polmonari preriscaldato, per la semina.Per isolare la popolazione cellulare positiva per CD146, rivestire innanzitutto le microsfere magnetiche con 10 microgrammi di anticorpo secondario biotinilato ogni 100 microlitri di microsfere magnetiche, in un vial criogenico sterile da due millilitri a fondo rotondo in condizioni sterili. Incubare le microsfere e l'anticorpo su un agitatore rotante per 30 minuti a temperatura ambiente e 30 giri al minuto. Successivamente, risospendere le microsfere coniugate con l'anticorpo in 1,5 millilitri di PBS arricchito con BSA e trasferire le microsfere in un tubo da citometria a flusso da tre millilitri a fondo rotondo.Risciacquare la provetta criogenica con ulteriori 1,5 millilitri di BSA/PBS e aspirare il lavaggio insieme alle perle. Posizionare la provetta su un magnete appropriato per due minuti, fino a quando tutte le perle si saranno attaccate alla parete posteriore della provetta e la soluzione sarà diventata limpida. Quindi rimuovere il soprannatante e lavare le perle altre due volte con tre millilitri di BSA/PBS.Lavare le MSC tre volte con PBS senza aggiunte. Dopo l'ultimo lavaggio, trattare le cellule con una soluzione delicata senza tripsina per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quando tutte le cellule si sono staccate, aggiungere mezzo di coltura per MSC polmonari fresco e centrifugare le cellule.Risospendere il pellet in PBS con BSA e contare le cellule. Successivamente, trasferire le cellule in una provetta da tre millilitri contenente l'anticorpo primario CD146, chiudere la provetta e incubare le cellule su un agitatore rotante a 15 RPM e a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in tre millilitri di PBS con BSA, risospendendo il secondo pellet in tre millimetri di perle coniugate con l'anticorpo secondario.Dopo 30 minuti sul miscelatore rotante a quattro gradi Celsius, posizionare il tubo sul magnete e utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere lentamente e con attenzione le cellule negative. Successivamente, dopo aver rimosso il tubo dal magnete, risospendere le cellule in tre millilitri di PBS integrato con BSA e ripetere il processo di selezione altre quattro volte. Dopo l'ultima rimozione delle cellule negative, lavare le MSC polmonari CD146 positive nel mezzo di coltura preriscaldato.Infine, risospendere le cellule coniugate con le microsfere in un nuovo mezzo di coltura per cellule stromali mesenchimali polmonari e seminare 5.000 cellule per centimetro quadrato in un’idonea fiala da coltura. L’adesione alla plastica seguita da tre a cinque giorni di coltura arricchisce la popolazione intermedia separata tramite gradiente di densità per cellule stromali mesenchimali polmonari positive per CD90, CD73 e CD146.Inoltre, queste cellule sono in grado di una resa in unità formanti colonie di circa il 30%, molto più elevata rispetto a quella generalmente riportata per il midollo osseo o altri sottoinsiemi di MSC che si differenziano lungo le tre linee classiche dei MSC. La selezione positiva della sottopopolazione CD146 positiva produce presumibilmente una popolazione cellulare fortemente arricchita in MSC polmonari, come dimostrato da una percentuale più elevata di cellule esprimenti marcatori di superficie associati ai MSC. Queste cellule mostrano anche un potenziale formante colonie notevolmente più alto e una risposta differenziativa più marcata, in particolare nelle cellule della linea condrogenica, rispetto all'intera popolazione di cellule mesenchimali ottenuta prima della selezione per CD146.È importante notare che questi MSC polmonari formano pochissimi adipociti veri e propri, mostrando invece un numero molto maggiore di cellule a forma di fuso contenenti piccole vescicole lipidiche, che potrebbero riflettere la linea dei lipofibroblasti, cruciale sia per lo sviluppo del polmone sia per il supporto alle cellule di tipo alveolare II. Una volta padroneggiata, questa tecnica può consentire di ottenere MSC polmonari positivi per CD146 entro sei-dieci giorni, anche se il rendimento dipenderà dall'età e dalla specie dell'animale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale lavorare rapidamente per preservare la vitalità delle cellule.Seguendo questa procedura, altri metodi, come la reazione linfocitaria mista o i saggi di guarigione delle ferite, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardo l'efficacia delle MSC nel bloccare la proliferazione dei linfociti T e nel sostenere la guarigione delle ferite. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le MSC polmonari positive per CD146 mediante digestione enzimatica, separazione su gradiente di densità, adesione alla plastica e selezione con microsferette.

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