Name: Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Scopri come progettare e impacchettare virus CRISPR ad alto titolo per modifiche genetiche mirate nel cervello di topo adulto mediante iniezione stereotassica. Questo metodo consente studi avanzati sui disturbi neurologici.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono alcuni passaggi critici che sono importanti per il confezionamento virale di successo. salute delle cellule è critico prima e durante la trasfezione, le cellule non sane ridurrà notevolmente la quantità di virus prodotto. Se la trasfezione e confezionamento hanno successo, allora il 100% delle cellule dovrebbe esprimere il fluoroforo e le celle deve formare un sincizio funzionale. Nel passaggio 3.2.4, toccando il tubo è necessaria per alto titolo trasfezione efficiente, e il pH della soluzione salina tamponata con HEPES-deve essere esatta. Il maxi-prep che producono i plasmidi necessari per il confezionamento virale devono essere estremamente puro. A questo punto, è utile etanolo precipitare il DNA eluizione finale e risospendere in tampone Tris-EDTA. È inoltre molto importante per ridurre la quantità di siero a 2% o meno nei media che la caffeina è aggiunta a il giorno 6 (passo 3.4) prima della raccolta virale. Se il siero non viene ridotta, quindi il virus purificato finale contiene una quantità indesiderabile di prot sieroEin. L&#39;uso di polietilene glicole 6000 quando precipitare le particelle virali esclude la necessità di ultracentrifugazione. E &#39;anche importante notare che i CRISPR contenente virus Cas9 tipicamente hanno un titolo circa 10 volte inferiore a virus contenenti esclusivamente un fluoroforo. Per la radiochirurgia stereotassica, l&#39;uso di anestesia inalatoria permette un controllo rapido e preciso o coscienza dell&#39;animale rispetto agli anestetici iniettabili e permette anestesia su una gamma di età maggiore. E &#39;molto importante mantenere gli strumenti chirurgici pulito e sterile, e il targeting riproducibile richiede un posizionamento preciso della testa. Assicurarsi che non vi è alcuna beccheggio o di rollio della testa nello strumento stereotassico e che il cranio si sente saldamente in posizione. Può essere utile per consentire il cranio asciugare per trovare i punti di sutura per determinare le coordinate stereotassica. Inoltre, il tasso e il volume per ogni stereotassica coordinate dovrebbero essere empiricamente determinato. Questa tecnica è limitante in quanto la diffusione di un lenti- o di retrovirus è limitato, soprattutto se confrontato con i virus adeno-associati (AAV) .Pertanto, questi virus sono utili quando infettare una regione del cervello discreta, ma non per l&#39;infezione complessivo associato con AAV utilizzato per l&#39;analisi del comportamento in animali. L&#39;uso di caffeina in questo protocollo aumenta notevolmente il titolo di questi virus, ma non sono ancora alto come i titoli ottenuti in imballaggi AAV. Inoltre, l&#39;integrazione stabile è solo un vantaggio di espressione fluoroforo, come forma CRISPR / Cas9 stabili modifiche genomiche anche quando transientemente trasfettate ed è possibile che in corso espressione del Cas9 e sgRNA possono eventualmente produrre effetti fuori bersaglio. L&#39;espressione transiente del sistema / Cas9 CRISPR con AAV è sufficiente a produrre cambiamenti genomici che si propagano per tutta divisioni cellulari, tuttavia, espressione fluoroforo non venga mantenuta. Creazione di lenbrano e retrovirus che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 impartirà la possibilità di indirizzare qualsiasi nuova gene in un&#39;ampia varietà di organismi. L&#39;efficienza di editing gene sembra essere dipendente dalla sequenza del RNA guida mira la scissione Cas9. È stato determinato empiricamente che tra il 10% e il 80% dei cloni contengono indels dopo sequenziamento infettato cellule Neuro2A. E &#39;attualmente noto se le frequenze INDEL calcolati in cellule Neuro2A sono riflettenti di quelle in neuroni. Guida al software di progettazione RNA come Benchling ora includono un punteggio &quot;on-target&quot;, che può essere in grado di predire l&#39;efficacia di una data sequenza bersaglio. Fino a che punto tali punteggi &quot;a bersaglio&quot; sono bisogni affidabili da determinare empiricamente nei neuroni e altri tipi di cellule, come il sistema di CRISPR-Cas9 diventa più ampiamente attuate. produzione animale transgenico lentivirus-based è stato variamente successo con i rapporti che i transgeni lentivirus-consegnato diventano SIricevitore in presenza 11. CRISPR editing gene mediata del DNA può essere passato attraverso la linea germinale per generare modelli animali interi. Così, stabile l&#39;editing genomico può essere realizzabile, nonostante il silenziamento di fluorofori virali-consegnato e transgeni Cas9. Questo può fornire una piattaforma efficiente per alterazioni genomiche mirati. La consegna virale del sistema / Cas9 CRISPR, pur non richiedendo organismi transgenici, è complementare a quelle tecniche. Ad esempio, l&#39;iniezione di tali particelle virali in un animale transgenico composto che esprime inducibile Cre e Cre opto dipendente o chimico-genetico transgeni dovrebbe facilitare studi complessi sul rapporto tra manipolazioni genetiche e attività neuronale. Un secondo esempio è quello di fornire queste particelle virali Cas9 / sgRNA in un knockout condizionale, nel tentativo di screening per le interazioni gene-gene. Infine, un altro itinerario interessante di questa ricerca è lo screening di fenotipi e composti terapeutici nelle cellule del paziente derivata, che puòessere utilizzato per convalidare e scoprire le reti genetiche che sono interrotti in varie malattie.

Per studiare la base della normale fisiologia e patologia malattia, vi è la necessità di manipolare con precisione l&#39;espressione genica in organismi modello. Per organismi modello mammiferi, questo è in gran parte incentrata sulla creazione e lo sviluppo di topi transgenici in cui un elemento genetico di interesse è affiancato da siti riconosciuti da un ricombinasi. Ciò può risultare in una determinata manipolazione sito di questi geni affiancate. Anche se questa è stata una strategia di successo, è tempo e risorse; per esempio, la creazione di un animale transgenico tripla che esprimesse un gene floxed, Cre ricombinasi, e un gene reporter Cre richiede più accoppiamenti e convalida. Al contrario, l&#39;iniezione stereotassica di replicazione particelle virali difettose codificano una proteina fluorescente e la ricombinasi in un gene animale floxed non necessita genotipizzazione complesse o strategie di selezione 1. Inoltre, se una proteina fluorescente e Cre esprimere virus è co-iniettata con una seconda Enco virusding una proteina fluorescente diversa, allora questo fornisce un controllo all&#39;interno dei tessuti per la manipolazione genetica mirata. Mentre questa strategia richiede ancora l&#39;uso di animali knock-in, strategie di RNA virale basato mediate aggirare la necessità di animali transgenici. Ad esempio, l&#39;iniezione stereotassica di virus replica-carenza che codificano una proteina fluorescente e un RNA breve hairpin (shRNA) può utilizzare macchinari endogena RNAi della cellula comportare una riduzione potenti della trascrizione di un gene di interesse. Tuttavia, le strategie shRNA producono sottile gene knock-down, spesso con conseguente modesti fenotipi cellulari 2. Mentre un knock-down può essere più fisiologicamente rilevanti per la disfunzione del gene eterozigote, la sua diminuzione robustezza rispetto ad un knock-out non è l&#39;ideale per la scoperta di nuovi geni fenotipica. Una terza tecnica che si è recentemente emerso, il CRISPR (cluster regolarmente intervallate Ripetere palindromo Short) / Cas9 (CRISPR-associataproteine ​​9) del sistema, si basa sulla espressione sia un piccolo RNA esogeno e un enzima taglio DNA. Il sistema / Cas9 CRISPR è stato adattato dal sistema immunitario procariote che si è evoluto un metodo per identificare estera, invadendo il DNA di virus e il targeting per la degradazione mediante l&#39;enzima Cas9 3,4. Questa potente tecnica di montaggio del genoma può essere utilizzato per la creazione di eliminazioni mirate, inserimenti, e mutazioni; e il seguente protocollo illustrerà come fare delezioni in un gene di interesse per knockout sua espressione in vivo. L&#39;enzima Cas9 deve essere espresso con un RNA guida omologa alla regione di interesse e contigua con un RNA ponteggio. Knockout di un gene utilizzando questa tecnica richiede mira Cas9 ad una regione specifica del genoma utilizzando RNA guida sintetici (sgRNA), e inducendo rotture a doppio filamento (DSB) in un sito di interesse. Questi DSB sono poi riparati dal macchinario cellulare di riparazione endogena via non omologa end-joining (NHEJ), che leannuncio a indels che possono produrre missenso o nonsense mutazioni e può quindi costituire una perdita di espressione della proteina funzionale 5. Poiché questo sistema produce alterazioni genomiche, richiede solo l&#39;espressione transiente del Cas9 e sgRNA. Tuttavia, è desiderabile che un indicatore fluorescente stabile per identificare le cellule e la loro progenie manipolati in questo modo. Lenti- e retrovirus hanno il vantaggio di stabile integrazione del DNA di interesse nelle cellule ospiti che mantengono l&#39;espressione a lungo termine e si tramandano alle cellule figlie durante la mitosi. Questo protocollo descrive la progettazione e realizzazione di due tipi di replica difettoso, retrovirus alto titolo: il virus dell&#39;immunodeficienza umana derivati ​​particelle lentivirali (lentivirus) e quelli basati su murino virus Maloney leucemia (retrovirus). Mentre entrambi di questi virus sono in grado di supportare esprimere stabile di grandi transgeni, le particelle retrovirali possono integrare solo nel genoma dudivisione cellulare anello con la degradazione della membrana nucleare, e quindi può essere utilizzata come strumento per etichettare e cellule data di nascita 6. Mentre lentivirus hanno la reputazione di essere relativamente basso titolo 7, questa metodologia, compreso l&#39;uso di caffeina durante la raccolta 8 virale, produce abitualmente titoli di 10 9 e 10 10 particelle / ml. Un altro vantaggio di lenti- e retrovirus è la tolleranza per grandi inserti. Il seguente insieme di protocolli delinea la procedura per la progettazione di un lenti o di retrovirus che codifica per un reporter fluorescente, sgRNAs, e Cas9 di utilizzare il sistema / Cas9 CRISPR di modificare il DNA, così come esprimere una proteina fluorescente. Mouse neurochirurgia stereotassica è un metodo valido per l&#39;iniezione di virus in vivo per studiare la morfologia, la funzione e la connettività dei neuroni infetti. L&#39;infezione virale nei neuroni può essere usato per manipolare i livelli di espressione per un periodo prolungato di time, ad esempio durante lo sviluppo, e l&#39;espressione possono essere controllati con precisione mediante l&#39;uso di vari sistemi inducibili farmacologici e espressione specifica guidato Cre. Questo protocollo particolare spiega come iniettare un virus che esprime un sgRNA e Cas9 per knockout un gene di interesse nel cervello di un topo adulto. Topi recuperare molto rapidamente da questa procedura e espressione del transgene virale può essere visto entro 48 ore dopo l&#39;iniezione. Tuttavia, l&#39;espressione fluoroforo sembra aumentare nel corso di settimane conseguenti livelli massimi vicino da 3 settimane dopo l&#39;infezione. I topi che subiscono l&#39;iniezione stereotassica virale possono essere utilizzati per il comportamento, elettrofisiologia, o studi morfologici. Nel complesso, lo scopo di queste procedure è quello di dimostrare come knockout un gene nel cervello di topo adulto con radiochirurgia stereotassica e un virus che esprime un sgRNA specifico e Cas9.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Elenco dei reagenti per colture cellulari</strong</td></tr><tr><td>>293FT linea cellulare</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td> per <td></td></tr><tr><td>la linea cellulare Lentivirus 293GP</td><td>Clontech</td><td>631458</td> per <td></td></tr><tr><td>la modifica del DMEM (IMDM) da parte di Retrovirus Iscove&</td><td>nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>IMDM completo con 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln e 1% P/S</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina, 100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penniccia/streptomicina, 100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene 10&nbsp; piastra cm</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Elenco dei reagenti di trasfezione</td></tr><tr><td>5&nbsp; ml tubi in polistirene</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>Produrre una soluzione 2,5 M in ddH2O</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES Soluzione salina tamponata (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8,2 g NaCl, 5,95&nbsp; g HEPES, 0,106 g Na2HPO4, pH 7,01 (esatto!)</td></tr><tr><td>Caffeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; Unità filtrante per siringa M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0,45 &micro; Unità filtrante per siringa M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Siringa 60 cc L/L</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>polietilenglicole &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 0,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo donatore</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP, coniglio, 488 coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti per chirurgia stereotassica</td></tr><tr><td>Vet-Siringa veterinaria uso TB Siringa solo 1 cc Luer slip TB 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS Lame per</td> bisturi in acciaio inossidabile isoflurano<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>unguento lacrimale artificiale</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>soluzione fisiologica&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>applicatori con punta in cotone</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>Unguento antibiotico triplo&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; Aghi Soft Pack 25 g x 5/8"</td><td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture di seta</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

progettazione, packaging, e consegna di alto titolo crispr retro e lentivirus via stereotassica iniezione

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replicazione I lentivirus o i retrovirus difettosi sono in grado di integrare stabilmente i transgeni nel genoma di una cellula ospite infetta. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per codificare proteine fluorescenti, controllori opto- o chemio-genetici dell'attività cellulare o espressione eterologa di geni umani in organismi modello. Questi virus sono stati anche utilizzati con successo per fornire ricombinasi a siti bersaglio rilevanti in animali transgenici, o anche per fornire piccole forcine o micro RNA al fine di manipolare l'espressione genica. Sebbene queste tecniche siano state fruttuose, si basano su animali transgenici (ricombinasi) o spesso mancano di elevata efficacia e specificità (shRNA/miRNA). Al contrario, il sistema CRISPR/Cas utilizza una nucleasi Cas esogena che si rivolge a siti specifici nel genoma di un organismo tramite un RNA guida esogeno al fine di indurre rotture a doppio filamento nel DNA. Queste rotture vengono poi riparate dall'unione delle estremità non omologa (NHEJ), producendo mutazioni di inserzione e delezione (indel) che possono provocare mutazioni missenso o nonsenso deleterie. Questo manoscritto fornisce metodi dettagliati per la progettazione, la produzione, l'iniezione e la convalida di singole particelle di virus lenti/retro in grado di trasdurre stabilmente i neuroni per esprimere un reporter fluorescente, Cas9 e sgRNA per eliminare i geni in un organismo modello.

A seguito del &quot;Protocollo per la progettazione di una guida Strand (sgRNA) per CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, oligo di targeting una particolare sequenza vengono inseriti nel PXL clonazione vettore valle del promotore hU6 ea valle di un ponteggio guida RNA utilizzando i siti di clonazione BBSI (Figura 1, punto 1). Questo sgRNA viene poi asportato da PXL e inserito nella spina dorsale pRubi utilizzando i siti BstBI e Paci (Figura 1, punto 2). Infine, un&#39;altra sgRNA clonato in PXL può essere posizionato a valle della prima guida in pRubi-Guide1 (Figura 1, fase 3), il targeting un&#39;altra zona del gene e aumentando le possibilità di un knockout via NHEJ. Verifica dei costrutti corretti dovrebbe essere determinata mediante analisi di sequenza. Una volta che questo costrutto è fatto, può essere confezionato in un virus a seguito del &quot;Protocollo per il Retro / lentivirali Produzione- CaPO4 Method&quot;. confezionamento di successo è confermata da infezione da virus in cellule HEK293 per poi titolare la vIRU. Se non vi è alcuna espressione fluoroforo allora è probabile un errore durante il confezionamento del virus. La figura 2 è un risultato rappresentativo di 2 retrovirus, una GFP esprimere e l&#39;altra esprimere mCherry, co-iniettato nel giro dentato topo neonatale (7 giorni di età) e ripreso 21 giorni dopo l&#39;iniezione. Etichettatura di neuroni con mCherry o GFP permette la valutazione morfologica delle varie manipolazioni genetiche in uno stesso tessuto, in cui un virus può esprimere un CRISPR / Cas9 mediata KO e l&#39;altro un virus di controllo, che esprime esclusivamente un fluoroforo. iniezione stereotassica consente precisa selettività anatomica come dimostra l&#39;infezione discreta delle coordinate destinate, giro dentato. Quando si analizzano le sezioni di cervello per l&#39;infezione, è importante mantenere i tessuti circostanti fino a quando non è stato accertato che la regione anatomica corretta è stato infettato. Se non vi è alcun segno di infezione, allora è possibile che l&#39;iniezione avvenuta in una regione di una vicinad può essere identificato nelle sezioni circostanti. Può anche essere utile per individuare il percorso dell&#39;ago per trovare la regione di iniezione esatto. VSVG virus pseudotyped raramente sparsi dei margini del giro dentato quando iniettato in vivo, e tendono a diffondersi lungo le cellule asse infettare rostrali / caudale lungo tutto il giro dentato, come analizzato da ricostruzione 3D (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Figura 1:. Clonazione strategia per il plasmide pRubi-Guide1-Guide2-retrovirale CRISPR Questa strategia è identica per i plasmidi lentivirali FU-based. oligo sgRNA sono ricotto e inseriti in PXL utilizzando i siti di clonazione BSBI. Dopo il sequenziamento per garantire che il sgRNA è inserita con successo in PXL, digerire il plasmide con BstBI e Paci. L&#39;inserto che viene abbandonato (scatola nera) viene poi clonato nel virale posteriore buno (il nero linee tratteggiate) pRubi-Guide1 CRISPR. Una seconda sgRNA può essere inserito anche in PXL e digerito utilizzando l&#39;enzima PACI. Questo viene poi clonato nel vettore CRISPR pRubi-Guide1 (rosse linee tratteggiate) utilizzando il sito PACI. Il plasmide risultante contiene quindi entrambi i filamenti di guida, nonché gli elementi virali necessari, promotori, e fluorofori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Figura 2:. Iniezione retrovirale del giro dentato del mouse retrovirus che esprimono mCherry (rosso) o GFP (verde) sono stati iniettati nel giro dentato di un mouse p7. 21 giorni dopo, i topi sono stati perfusi e il cervello sezionati e colorati per la GFP e mCherry. (A) Un immagine fluorescente a grande campo 5X mostra la prECISIONE dell&#39;iniezione giro dentato e la specificità di etichettatura dentate neuroni granulari giro. La morfologia dell&#39;ippocampo può essere visto attraverso la (blu) colorazione Dapi. barra della scala misura 200 micron. (B) L&#39;immagine fluorescente 10 volte più grande campo dimostra che questi lentivirus alto titolo infettare un gran numero di cellule la cui morfologia è possibile accedere tramite espressione fluoroforo. barra della scala misura 100 micron. (C) I virus che esprimono GFP o mCherry sono stati co-iniettate in giro dentato. Utilizzando un sistema di retrovirus, si può usare un virus per effettuare una manipolazione genetica segnata da GFP e un&#39;altra manipolazione segnata da mCherry e quindi valutare le variazioni singole o additivi a causa di ogni virus. barra della scala misura 10 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Figura 3:. Diffusione anatomica di iniezione lentivirali coiniezione Stereotassica<html> di un virus GFP-shPten e un virus di controllo mCherry nel cervello di un adulto Pten loxP / + topo ha provocato una diffusione virale lungo tutta la rostrale / asse caudale del giro dentato dell&#39;ippocampo. Questo è mostrato in una ricostruzione 3D della portata di iniezione in cui chiusi contorni della diffusione virale sono stati rintracciati oltre 21 sezioni seriali (Z = 50 um / sezione) utilizzando software di ricostruzione. I tracciati di contorno sono poi stati allineati per generare le immagini 3D per il volume quantificazione. Diffusione virale totale viene visualizzato in verde (volume = 54.730.800 micron 3) e la diffusione dentato-localizzato è mostrato in viola (volume = 27.275.200 micron 3). Il virus si diffonde lungo il percorso dell&#39;ago e il corpo calloso all&#39;intersezione della traccia dell&#39;ago oltre al riempimento all&#39;asse rostrale / caudale del giro dentato. barra della scala misura 200 micron. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Supplemental Video 1. Progettazione di sgRNAs per clonare in backbone retrovirali e lentivirali. In questo esempio di progettazione guida sintetica RNA (sgRNA), la sequenza genomica di CHD8 mouse viene scaricato da NCBI. Il codone di inizio e la struttura esone vengono poi visualizzati in Vector NTI. Questo ci permette di copiare la regione genomica intorno al primo esone codifica ed entriamo in questa sequenza Benchling. Benchling ci permette di visualizzare tutti i potenziali sgRNAs nella regione. Inoltre, dopo che indica la regione genomica che abbiamo in ingresso, Benchling ci mostrerà i punteggi on-target e off-bersaglio per ogni RNA guida. L&#39;utente può quindi selezionare l&#39;RNA guida con i punteggi più alti in bilancio e fuori bersaglio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).</a>

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l&#39;editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire ai ricercatori di progettare e confezionare virus che esprimono una proteina fluorescente, CAS9 e sgRNA, per poi iniettarli stereotassicamente nel cervello del topo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande specifiche nel campo delle neuroscienze, come il ruolo dei geni coinvolti nei disturbi neurologici e neurosviluppali. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di manipolare geni specifici senza dover ricorrere al processo lungo e dispendioso in termini di risorse necessarie per generare animali geneticamente modificati.Prima di preparare le cellule, utilizzare un sito web per generare un filamento guida di 20 nucleotidi o un'RNA guida singola (sgRNA) che verrà utilizzato per progettare oligonucleotidi a singolo filamento. Dopo aver ordinato gli oligonucleotidi e averli utilizzati per creare un plasmide finale come descritto nel protocollo testuale, procedere prelevando con una pipetta tutte le cellule scongelate da una provetta criogenica e trasferendole in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere 2 millilitri di IMDM completo equilibrato con CO2 preriscaldato. Centrifugare quindi le cellule per cinque minuti a 500 ×g. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di IMDM completo. Seminare le cellule in una piastra per colture cellulari da 10 cm e incubarle tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica. 24 ore dopo il seminamento, cambiare il mezzo aspirando il mezzo esistente e aggiungendo 10 millilitri di IMDM preriscaldato. Suddividere le cellule una volta che hanno raggiunto la confluenza. Per suddividere le cellule, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 5 millilitri di PBS. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina 0,25% alla piastra e incubare a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano dalla piastra.Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di IMDM per neutralizzare la reazione della tripsina e trasferire le cellule, mediante pipetta, in una provetta da 1,5 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule a 500 ×g per cinque minuti. Ri-sospendere le cellule in un millilitro di IMDM e diluire 10 microlitri di cellule in 90 microlitri di PBS.Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico e ripiastrellare le cellule con IMDM completo. Al quinto giorno, cambiare il mezzo due ore prima della trasfezione e assicurarsi che ci siano esattamente 10 millilitri di mezzo nella piastra da 10 centimetri. Successivamente, preparare i reagenti per la trasfezione per due piastre utilizzando due provette rotonde in polistirene da 5 millilitri. Etichettare la prima provetta come DNA e la seconda come HBS 2X. Quindi, regolare la concentrazione del DNA a un microgrammo per microlitro in Tris EDTA a pH 7,4. Per preparare i reagenti di trasfezione per lentivirus e retrovirus, aggiungere lentamente i componenti richiesti al tubo etichettato DNA, agitando continuamente il tubo per favorire il mescolamento. Successivamente, aggiungere un millilitro di HBS 2X al tubo etichettato 2X HBS. Poi, aggiungere lentamente un millilitro del contenuto del tubo DNA al tubo 2X HBS, una goccia alla volta. Agitare continuamente il tubo 2X HBS e osservare il precipitato di fosfato di calcio formato dopo ogni goccia, per assicurare la corretta formazione dei complessi di trasfezione. Incubare quindi il tubo al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, aggiungere un millilitro del reagente di trasfezione, sotto forma di gocce lente, in ogni piastra cellulare da 10 centimetri e incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius.Sostituire il mezzo al sesto giorno.Al settimo giorno, trasferire il mezzo contenente le particelle virali con una pipetta sierologica da 10 millilitri in un tubo conico da 50 millilitri prima di conservarlo a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere otto millilitri di mezzo con FBS 0,5% a ciascuna piastra cellulare. All'ottavo giorno, raccogliere il mezzo cellulare contenente le particelle virali e combinarlo con il raccolto del giorno precedente nel tubo conico da 50 millilitri.In questo passaggio, centrifugare il sopranatante virale a 2000 ×g per 10 minuti. Successivamente, purificare il mezzo virale filtrandolo attraverso un filtro a siringa con bassa adesione alle proteine da 0,45 micrometri. Poi, aggiungere la soluzione di polietilene glicole 6000 5X al mezzo. Invertire il tubo più volte per mescolare. Quindi, incubare la miscela virale a quattro gradi Celsius per almeno 12 ore.Al nono giorno, centrifugare la miscela virale a 2500 ×g per 45 minuti. Trascorsi 45 minuti, eliminare il soprannatante e centrifugare nuovamente per due minuti. Successivamente, rimuovere di nuovo il soprannatante. Successivamente, risospendere il pellet aggiungendo 320 microlitri di PBS sterile e incubare sullo shaker a temperatura ambiente per 30 minuti. Il giorno successivo, aliquotare il virus e congelare le aliquote a -80 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, rasare il cranio di un topo anestetizzato al fine di preparare il sito di iniezione. Indirizzare il 4% di isoflurano nel cono nasale. Successivamente, posizionare il topo nello strumento stereotassico. Inserire la barra per il morso nella sua bocca fino a quando i denti non cadono nella fessura, prima di fissare le barre auricolari. Assicurarsi che il corpo dell'animale sia appoggiato sul tappetino riscaldante e che il naso sia posizionato all'interno del cono nasale.Successivamente, confermare l'anestesia applicando una leggera pressione sul piede. Poi applicare lacrime artificiali per lubrificare gli occhi. Infine, detergere la testa rasata con iodopovidone e lidocaina.Ora praticare una piccola incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Asciugare il cranio con un batuffolo e applicare perossido di idrogeno per facilitare la visualizzazione del bregma. Utilizzando un microscopio stereoscopico, individuare il bregma sul cranio e posizionare la punta del trapano al di sopra di esso.Impostare le coordinate stereotassiche digitali dei piani X, Y e Z a zero. Per assicurarsi che la testa sia livellata lungo l'asse Y rostro-caudale, posizionare la punta del trapano su lambda e livellare la testa in modo che la coordinata Z sia approssimativamente pari a zero in corrispondenza di bregma e di lambda. Per verificare che la testa sia livellata lungo l'asse X, posizionare la punta del trapano nel punto medio tra bregma e lambda e misurare le coordinate Z a un millimetro dal punto medio su entrambi i lati, assicurandosi che siano uguali.Ridurre successivamente l'isoflurano al 2% prima di posizionare il trapano sulle coordinate desiderate e praticare con attenzione un foro attraverso il cranio. Dopo aver eseguito tutti i fori, fissare la siringa contenente il virus allo strumento stereotassico. Centrare la siringa sul foro e impostare la coordinata Z a zero a livello del cranio. Abbassare lentamente la siringa alla profondità Z massima e iniziare l'iniezione a una velocità di 0,25 microlitri al minuto utilizzando un iniettore stereotassico. Al termine dell'iniezione alla massima profondità Z, attendere un minuto prima di sollevare la siringa alla coordinata successiva e riprendere l'iniezione. Continuare con questo schema fino a quando tutte le coordinate Z di iniezione sono state trattate.Dopo l'ultima iniezione, attendere due minuti prima di rimuovere la siringa. Successivamente, rimuovere il topo dallo strumento stereotassico e suturare il cuoio capelluto. Applicare lidocaina e crema antibatterica sulla sede chirurgica e somministrare farmaci analgesici prima di trasferire l'animale in una camera di recupero riscaldata.Questa immagine fluorescente ad ampio campo a 10X dimostra che i retrovirus ad alto titolo infettano un elevato numero di cellule, la cui morfologia può essere valutata mediante l'espressione del fluorocromo. In questo esempio, virus esprimenti GFP o mCherry sono stati coiniettati nel giro dentato. Utilizzando un sistema di retrovirus, è possibile impiegare un virus per effettuare una manipolazione genetica marcata con GFP e un'altra manipolazione marcata con m-Cherry, per poi valutare le alterazioni singole o additive indotte da ciascun virus.Questa è una ricostruzione tridimensionale dell'estensione dell'iniezione in cui contorni chiusi della diffusione virale sono stati tracciati su 21 sezioni seriali. I tracciamenti dei contorni sono stati quindi allineati per generare immagini tridimensionali finalizzate alla quantificazione del volume. La diffusione virale totale è mostrata in verde, mentre la diffusione localizzata nel giro dentato è mostrata in viola. Questa immagine mostra il virus che si diffonde lungo il percorso dell'ago e nel corpo calloso, oltre a occupare l'asse rostrale-caudale del giro dentato. Dopo l'iniezione virale in vivo, utilizziamo altri metodi come l'istologia, l'elettrofisiologia o la microscopia in vivo per studiare le conseguenze della manipolazione genetica sullo sviluppo neuronale.

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Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Vettori di espressione lentivirali sono i veicoli più efficaci per esprimere stabilmente diverse molecole effettrici o costrutti reporter nel dividere e non la divisione delle cellule di mammiferi e di interi organismi. Qui forniamo un protocollo su come confezionare costrutti di espressione lentivector particelle pseudoviral e di trasdurre cellule bersaglio utilizzando le particelle pseudoviral.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e somministrazione di retrovirus e lentivirus CRISPR ad alto titolo mediante iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016).Questo video illustra il processo passo dopo passo per la concentrazione e la purificazione di particelle lentivirali da una sospensione mista contenente detriti cellulari dell'ospite. La procedura utilizza centrifugazione, filtrazione e precipitazione con PEG-sale per isolare le particelle virali rimuovendo...

Concentrazione e purificazione delle particelle virali

Fonte: Chen, S., et al., Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica nelle cellule striatali del cervello di topo neonatale. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un vettore virale che codifica per la Cre ricombinasi e la proteina a fluorescenza verde o GFP nello striato di un cucciolo di topo geneticamente modificato per ottenere la manipolazione genica asportando una cassetta STOP fiancheggiata da loxP, attivando la proteina a fluorescenza rossa o RFP...

Microiniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione genica in uno striato di cucciolo di topo

Fonte: Pereira, M. et. al., Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti in interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un virus adeno-associato nella corteccia cerebrale di un topo transgenico per fornire la riprogrammazione neuronale Cre-dipendente e i geni reporter fluorescenti nelle cellule gliali.

Iniezione stereotassica di vettori virali per la riprogrammazione delle cellule gliali in un modello murino

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i...

Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare...

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

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Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l'espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).

L&#39;applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

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