Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione

Ipofunzione delle ghiandole salivari, un importante effetto avverso della radioterapia della testa e del collo diminuisce la qualità della vita di un paziente. La dimostrazione dell'efficacia di nuove terapie in modelli animali è un prerequisito prima della transizione clinica. Questo protocollo descrive la somministrazione retroduttale e l'irradiazione locale delle ghiandole sottomandibolari di ratto.

L'obiettivo generale di questa procedura è somministrare retroduttivamente terapie alle ghiandole sottomandibolari per valutarne l'efficacia nel combattere la disfunzione salivare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei disturbi delle ghiandole salivari, come ad esempio quali terapie possono proteggere o ripristinare la funzione delle ghiandole salivari contro le radiazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le ghiandole salivari possono essere trattate localmente, riducendo così il rischio di effetti collaterali del tessuto non bersaglio.

Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le aperture del dotto non sono visibili e la cannula deve essere manipolata alla cieca nel condotto. Prima di iniziare la procedura, tagliare una lunghezza di dieci centimetri di tubo in polietilene PE 10 con un bisturi, quindi afferrare entrambe le estremità del tubo tra l'indice e il pollice di ciascuna mano e riscaldare la sezione centrale del tubo sopra una fiamma delicata tirando con cura entrambi i lati per allungare il tubo ammorbidito al doppio della sua lunghezza. Quindi, usa uno scalpal per tagliare il tubo al centro con un angolo di 45 gradi per ottenere due cannule ciascuna con un'estremità affusolata.

Allungare l'estremità non affusolata di una delle cannule sull'ago da 29 gauge della siringa da insulina da 0,5 cc. Quindi rimuovere la cannula e aspirare 220 microlitri di soluzione salina nella siringa. Picchiettare lo stelo della siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria e riattaccare la cannula sopra l'ago.

Premere lo stantuffo per espellere l'aria dalla cannula e garantire un flusso libero della soluzione attraverso il tubo e regolare il volume di soluzione fisiologica nella siringa a 200 microlitri. Ora conferma il livello appropriato di sedazione del ratto con un pizzico delle dita dei piedi e un riflesso palpabile e applica il lubrificante per gli occhi sulle cornee esposte. Posizionare l'amimal su una piattaforma di contenimento appositamente progettata e impegnare i denti incisivi superiori sulla barra trasversale.

Avvolgi un elastico attorno agli incisivi inferiori per abbassare la mascella. Ancorandolo alla piattaforma. Quindi passare una sutura sterile attraverso la lingua e sollevarla per sollevare il pavimento della bocca.

Quindi utilizzare un emostatico per bloccare le suture e far passare l'emostatico sopra la barra trasversale. Quindi, usa un divaricatore per guance costruito su misura per espandere le guance e un microscopio dissezionatore per localizzare i papilli sublinguali sul pavimento della bocca. Usando una pinza delicata, afferrare l'estremità affusolata del tubo preformato in PE 10 e manipolare delicatamente la punta della cannula nell'orifizio duttale sulla papilla sublinguale.

Quindi infilare la cannula da tre a cinque millimetri nel condotto, assicurandosi che la cannula passi attraverso il condotto senza ostruzioni. Prima di instillare la soluzione salina, iniettare atrofina sottocutaneamente nella collottola dell'animale. Dieci minuti dopo l'iniezione, fissare la cannula all'orifizio del dotto con una goccia di cianoacrilato.

Dopo che la colla si è asciugata, premere lentamente lo stantuffo della siringa a 50 microlitri al minuto fino a quando non sono stati instillati 200 microlitri di soluzione salina nella ghiandola. Se si riscontra una pressione posteriore durante l'instillazione, interrompere e quindi estrarre il tubo, quindi ricanulare con una nuova cannula. Quindi bloccare il tubo con un emostatico e rimuovere con cautela la siringa.

Lasciare il tubo nel condotto per 30-60 minuti fino a quando l'animale non riprende conoscenza. Quindi rimuovere la sutura che tiene la lingua e trasferire l'animale in una gabbia separata sotto una lampada riscaldante fino a quando non si è completamente ripreso. Applicare localmente l'irradiazione frazionata alla ghiandola sottomandibolare.

Colonnare una fessura di tre centimetri di campo di radiazione che abbraccia l'area dal bordo inferiore della manbola alla sommità dello sterno del ratto anestetizzato in posizione supina. Dopo aver posizionato un bolo equivalente di tessuto di un centimetro sulla regione. Regolare la distanza tra la sorgente di radiazione e la parte superiore del bolo a 100 centesimi utilizzando un fascio di fotoni da sei megavolt sull'acceleratore lineare.

Irradiare l'animale con 2,5 grigi per la durata appropriata dell'esposizione. Al termine del periodo di esposizione alle radiazioni, riscaldare l'animale durante il suo recupero, come appena dimostrato. Durante gli esperimenti iniziali, il corretto posizionamento della cannula è stato confermato infondendo la ghiandola con ematossilina o soluzione di tryplan blue e valutando la colorazione della ghiandola negli animali sottoposti a eutanasia.

Le ghiandole sottomandibolari sono state studiate perché possono essere irradiate selettivamente con radiazioni colonnate al collo evitando gravi effetti orali fuori bersaglio che possono influire sulla salute degli animali e sull'esito sperimentale. L'analisi degli effetti di questo schema di radiazione frazionata sul flusso salivare a otto settimane dopo la radiazione dimostra che l'esposizione giornaliera a incrementi di 2,5 grigi riduce precipitosamente il flusso salivare. Entro la riduzione di 10 volte della produzione di saliva negli animali irradiati rispetto agli animali non irradiati.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di garantire il passaggio illimitato della cannula nel dotto escrezionale della ghiandola salivare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei disturbi delle ghiandole salivari per esplorare trattamenti per le radiazioni e le afflizioni autoimmuni delle ghiandole salivari.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'installazione retroduttale nella ghiandola sottomandibolare del ratto e di irradiare localmente le ghiandole per valutare l'efficacia terapeutica del miglioramento della tossicità delle radiazioni. Non dimenticare che lavorare con terapie geniche e proteiche può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come evitare punture d'ago e ridurre al minimo l'esposizione della pelle agli agenti biologici dovrebbero essere sempre assunte durante l'esecuzione di questa procedura.