Estrazione metriche per sistemi di radici tridimensionali: volume e superficie di analisi da In-terreno a raggi X Tomografia Computerizzata dati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di estrarre informazioni quantitative sulle radici delle piante dai dati della tomografia computerizzata a raggi X nel suolo. Questo metodo di indagine sulla struttura radicale delle piante vive può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia, come ad esempio il modo in cui le piante rispondono alle mutevoli condizioni ambientali come la siccità, le attività microbiche e così via. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è invasiva, quindi ci permette di studiare le piante nel loro ambiente nativo, il suolo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è preziosa, poiché la procedura prevede numerosi passaggi, tra cui l'imaging tomografico, la ricostruzione dei dati e l'analisi, che possono essere oscurati senza un aiuto visivo. Per iniziare, posizionare una pianta in vaso sul manipolatore di campioni dello scanner per tomografia a raggi X alla distanza desiderata per l'ingrandimento del bersaglio. Per una pianta in un supporto di due pollici di diametro, impostare un campione a una distanza di origine di circa tre pollici.

Nel software di controllo dello strumento, impostare le impostazioni di potenza dei raggi X su 85 kilovolt e 190 microampere. Quindi, impostare il tempo di esposizione su un secondo per un migliore rapporto segnale/rumore. Imposta il numero di proiezioni su 3, 142 e il numero di fotogrammi per proiezione su quattro per ottenere buone statistiche sui dati.

Utilizzando i parametri di scansione appena impostati, selezionare la scheda Correzione ombreggiatura. Quindi fare clic su Nuovo"e denominare il file di correzione dell'ombreggiatura. Quindi fare clic su Presenta"per confermare le nuove condizioni.

Quindi, fai clic su Crea"e fai clic su OK" per utilizzare due immagini di riferimento. Quindi fare clic su Genera. Quindi, quando viene visualizzata la finestra popup di avviso, rimuovere fisicamente il campione dal percorso del raggio prima di fare clic su OK. La correzione dell'ombreggiatura verrà ora eseguita.

Ora, fai clic sulla scheda Acquisizione. Assegna un nome al file di dati, quindi seleziona Nessuno"per Filtro a raggi X. Assicurarsi che la casella di controllo Riduci al minimo gli artefatti dell'anello" sia selezionata in modo che il campione venga ruotato in passi angolari durante l'acquisizione delle immagini di proiezione.

Infine, avvia la scansione facendo clic sul pulsante Acquisisci". Dopo aver acquisito i dati grezzi, caricarli nel programma di ricostruzione. Confronta la prima e l'ultima immagine cliccando su Blink" per assicurarti che il campione non si sia mosso o che le impostazioni di scansione non siano cambiate durante l'acquisizione dei dati.

Calcola il centro di rotazione, o COR, selezionando la scheda Centro di rotazione"e utilizzando le opzioni Automatico"Individuazione COR con precisione di alta qualità" e Selezione a doppia fetta per il calcolo COR. Quindi, fare clic su Inizio"per eseguire il calcolo. Dopo aver trovato il COR, fare clic sulla scheda Volume per selezionare il campione da ricostruire.

Utilizzare le miniature per modificare le finestre di selezione del volume. Quindi fare clic su Start"per eseguire la ricostruzione per creare il file del volume contenente dati 3D. Per preparare uno stack di immagini elaborabile RooTrak, caricare il file del volume in ImageJ facendo clic su File, Importa, Raw, quindi selezionando il file del volume.

Per ottimizzare il contrasto dell'immagine tra la radice e il terreno, fare clic sulla scheda Immagine, quindi scegliere Regola luminosità/contrasto" e selezionare Auto. Quando l'area di interesse è visibile in chiaro, le impostazioni sono considerate ottimizzate. Salva le immagini come una pila di immagini in formato JPEG, BMP o PNG facendo clic su Salva con nome"e scegliendo Sequenza immagini.

Per elaborare in RooTrak per segmentare la radice, selezionare la scheda Strumenti" e scegliere Tracker. Quindi fare doppio clic sull'area di immissione bianca della finestra di dialogo per caricare una pila di immagini. Dopo aver caricato le immagini, scegli la scheda "Tracker" e imposta i punti di partenza all'interno della radice facendo clic su diversi punti all'interno di ciascuna delle sezioni principali pertinenti visibili nella sezione di visualizzazione superiore dei dati del volume.

Imposta la levigatezza del parametro del tracker su 0,3 e la somiglianza su 0,8. Fare clic sul campo sotto Directory di output"per scegliere una cartella di file. Quindi, fai clic su Seleziona cartella"e fare clic su Avvia.

Verrà quindi eseguita la funzione di tracciamento. Questo seguirà la radice dalla fetta superiore dell'immagine fino alla fetta inferiore. Dopo aver aperto e visualizzato i dati del volume, selezionare il numero di sezioni in base al volume di dati utilizzabile.

Nell'esempio mostrato di seguito, l'inseguimento è stato interrotto a 200 sezioni, equivalenti a una profondità di 6,2 millimetri, dove i confini delle radici sono diventati mal definiti. Per eseguire l'analisi del volume e della superficie in ImageJ, convertire la pila di immagini da RooTrak in un formato di immagine binario selezionando Processo, Binario, quindi Rendi binario. Utilizza il plug-in open source ImageJ, BoneJ, per creare la mesh triangolare selezionando Plugin, BoneJ, quindi Isosurface.

Nella finestra delle opzioni che si apre, imposta Ricampionamento"e Soglia" rispettivamente su sei e 120. Quindi, seleziona Mostra superficie"e premi il pulsante OK". Nel visualizzatore 3D che si apre, fai clic sulla scheda File".

Quindi fare clic su Esporta superfici"e salva come binario STL. Infine, apri IMESHJ. Carica il file STL facendo clic su Seleziona file STL" e inserisci la dimensione del voxel in micron.

Fare clic su Inserisci dimensione voxel" e inserire 31 micron, quindi fare clic su OK" due volte. Fare clic su Calcola superficie"per acquisire l'area totale della superficie della radice del campione in millimetri quadrati. Quindi, fare clic su Calcola volume"per ottenere il volume totale della radice del campione in millimetri cubi.

L'esemplare, costituito da due steli del seme di goccia della prateria erbacea nativa, Sporobolus heterolepis, e dal terreno originale che lo circonda, è mostrato qui. La dimensione dei voxel dei dati ricostruiti generati era di circa 31 micron cubi. Dopo aver creato una pila di immagini e aver aumentato il contrasto tra le radici e il suolo, i dati ricostruiti hanno mostrato che la radice e alcuni dei componenti del suolo hanno fattori di attenuazione dei raggi X molto simili, con conseguente contrasto in scala di grigi minimo o nullo nelle immagini.

Questa figura mostra un punto di semina rappresentativo che è stato selezionato all'interno di una sezione radice pertinente visibile nella fetta superiore dei dati del volume. Utilizzando i parametri RooTrak descritti in questo video, RooTrak ha segmentato con successo le circa 200 sezioni selezionate di dati di volume, equivalenti a una profondità di 6,2 millimetri. In questa animazione viene dimostrata anche la segmentazione della radice.

Qui, ImageJ è stato utilizzato per generare un'isosuperficie mesh triangolare del volume 3D dai dati prodotti da RooTrak. Le impostazioni predefinite utilizzate hanno prodotto un'isosuperficie dettagliata in modo relativamente rapido. Infine, utilizzando IMESHJ, l'area della superficie è stata calcolata come 351,87 millimetri quadrati e il volume calcolato è stato di 47,27 millimetri cubi.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa tecnica, è importante ricordare di seguire tutte le procedure di sicurezza. È anche importante ricordare che la segmentazione delle radici è possibile solo se c'è un contrasto sufficiente ai raggi X tra la radice e il terreno.

Seguendo questa procedura, altri esemplari con strutture ramificate come foglie d'albero, polmoni animali e umani, eccetera, possono essere visualizzati e analizzati per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui crescono i tessuti viventi o il modo in cui tollerano determinate condizioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle scienze vegetali per esplorare aspetti come la resistenza alla siccità in piante modello come il Brachypodium. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare un esemplare di pianta usando la tomografia, come visualizzare la sua struttura radicale ed estrarre informazioni quantitative sulla radice dai dati della tomografia computerizzata a raggi X nel terreno.

Non dimenticare che lavorare con la strumentazione a raggi X può essere pericoloso e che è necessario seguire le procedure di sicurezza pertinenti durante il tentativo di questa tecnica.