Name: analizzare In Vivo Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Scopri come analizzare la migrazione cellulare in vivo utilizzando trapianti cellulari e imaging time-lapse in embrioni di Danio rerio. Questo metodo combina tecniche di trapianto e imaging live per studiare il ruolo di geni candidati.

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Ringraziamo F. Bouallague e la struttura per animali IBENS per l'eccellente cura del pesce zebra. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, dalle sovvenzioni N° SFI20111203770 e N° PJA 20131200143.

Nota: La Figura 1 presenta la sagoma del protocollo. 1. Preparazione degli aghi per l&#39;iniezione e Trapianti Nota: aghi può essere preparato in qualsiasi momento e memorizzati. Tenerli in una capsula di Petri, su una banda di plastilina. Sigillare il piatto con parafilm per proteggere dalla polvere. <ol><li> Per aghi da iniezione, tirare un capillare di vetro (diametro esterno 1,0 millimetri, diametro interno 0,58 millimetri, senza filamento (vedi elenco dei materiali)) con un estrattore micropipetta (vedi elenco dei materiali). Preferisco aghi corti e sottili (parte conica di circa 5 mm) in quanto sono più efficienti per piercing corion. Nota: Gli aghi di iniezione sono monouso. </li><li> Ago per trapianto di cellule <ol><li> Tirare un capillare di vetro (diametro esterno 1,0 millimetri, diametro interno 0,78 millimetri, senza filamento (vedi elenco dei materiali)) con un estrattore micropipetta. </li><li> Ucantare una microforge (vedi elenco dei materiali), tagliare la punta dell&#39;ago nel punto in cui il diametro interno è di 35 micron (leggermente superiore al diametro delle cellule da trapiantare). </li><li> Smusso il taglio estremità del capillare con un Micromacinatore (vedi elenco dei materiali) con un angolo di 45 °. </li><li> Opzionalmente, tirare una sbavatura alla fine dell&#39;ago utilizzando un microforge. Per questo, toccare il filamento caldo con la punta del bisello e rapidamente allontanarlo, creando una sbavatura che può aiutare penetrare l&#39;embrione. </li><li> Montare l&#39;ago su un supporto ago collegato ad una siringa. Usando la siringa, lavare l&#39;interno dell&#39;ago tre volte con acido fluoridrico 2% per eliminare i residui di vetro, e poi sciacquare tre volte con acetone. Attenzione: L&#39;acido fluoridrico è tossico, manipolare sotto il cofano, con i guanti. Nota: Gli aghi di trapianto di cellule può essere utilizzato più volte. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delPiatti per iniezione e trapianto di cellule <ol><li> Calore 50 ml di embrioni medie 11 contenenti 0,5 g di agarosio in un forno per 1 min a piena potenza per ottenere 1% agarosio in mezzo embrione. Raffreddare il gel di agarosio a circa 60 ° C e versare i 50 ml in un piatto 90 millimetri Petri. Posizionare sulla superficie del gel uno stampo appositamente progettato (vedi elenco di materiale), sia con le linee per il piatto iniezione o con pozzetti per il piatto trapianto di cellule. <ol><li> Osservare il galleggiante muffa sul agarosio, se l&#39;agarosio non è troppo caldo. Dopo il gel di agarosio è impostato, rimuovere lo stampo con una pinza (Figura 2A - B). Nota: piatti possono essere conservati a 4 ° C, fino a poche settimane. Tenerli in una scatola chiusa bagnato, per evitare l&#39;essiccamento. </li></ol></li><li> Posizionare il piatto in un 28 ° C incubatore 30 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. Raccolta di embrioni e di iniezione <ol><li> Iniezione Soluzione Preparazione Nota: actina dominio di legamedi proteine ​​140 (ABP-140) come Lifeact vincolato al mCherry vincolante actina lievito (denominato ABP140-mCherry) è usato per visualizzare actina polimerizzata all&#39;interno della cellula, per analizzare l&#39;attività protrusiva. Aggiungere un altro composto per testare la funzione di un gene candidato (ad esempio mRNA di dominante costrutto negativo o costitutivamente attivo, o oligonucleotidi Morpholino). Per valutare le funzioni di sin1 come descritto nelle risultati (figura 3), abbiamo utilizzato oligonucleotidi Morpholino. Come controllo, abbiamo usato un morfolino identico al morfolino sin1 ma per 5 nucleotidi distribuite lungo la sequenza in modo che questo morfolino controllo non corrisponde al RNA bersaglio. <ol><li> Sin1 Scongelare e Morpholinos controllo 5 disadattamento (2 stock soluzioni mm), e ABP140-mCherry mRNA sul ghiaccio. Aggiungere 375 ng di mRNA (75 ng / mL finale) e 0,75 ml di uno sin1 o 5 disadattamento morfolino controllo (0,3 mm finale) in Danieau tampone (58 mM NaCl, 0.7 mmKCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6), per raggiungere un volume totale di 5 ml. </li></ol></li><li> embrione Collection Nota: per questo sperimentale istituito due embrioni donatori e di accoglienza sono transgenici, che esprime la GFP sotto il controllo del goosecoid (GSC) promotore al fine di visualizzare la piastra di precordale prospettico 11. <ol><li> Raccogliere Tg (GSC: GFP) le uova. Mettere circa 80 uova in un piatto 90 millimetri Petri riempite con terreno di embrione e incubare a 28 ° C. </li></ol></li><li> Iniettare embrioni donatori <ol><li> Sotto uno stereomicroscopio, premere delicatamente embrioni raccolti con una pinza nelle linee di un piatto pieno di iniezione di media embrione. Utilizzando pinze, orientare gli embrioni con le celle verso la parte superiore. Posizionare il piatto di iniezione in incubatore a 28 ° C fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase 4 celle (1 ora dopo la fecondazione). </li><li> Caricare un ago per iniezione con 2 ml disoluzione iniettabile. Inserire l&#39;ago in un supporto ago (vedere l&#39;elenco dei materiali) che viene inserito in un micro-manipolatore (vedi elenco dei materiali) e collegato con politetrafluoroetilene (PTFE) tubazione (vedere l&#39;elenco dei materiali) ad un transjector dell&#39;aria (vedi elenco dei materiali ). </li><li> Aprire il capillare toccando delicatamente la punta con una pinza sottile. Se necessario, tagliare il capillare aperto da pizzicare sua estremità. </li><li> Inserire una delle quattro cellule con l&#39;ago e iniettare la soluzione all&#39;interno della cellula in modo da riempire il 70% del volume cellulare (2 nl). Iniettare 30 embrioni. Nota: raggiungere l&#39;ago nella cella può essere difficile, in quanto la membrana plasmatica è morbido. Mirare alla giunzione tra la cella e il tuorlo facilita la penetrazione dell&#39;ago. </li><li> Mettere gli embrioni in C incubatore 28 ° fino a quando non hanno raggiunto la fase sfera (4 ore dopo la fecondazione). </li></ol></li></ol> 4. Preparazione degli embrioni per la cella Transplantatione <ol><li> Preparare 20 ml di terreno embrione con 200 ml di penicillina / streptomicina (vedi elenco dei materiali) (Pen / Strep EM). </li><li> Dechorionation degli embrioni allo stadio sfera (4 ore dopo la fecondazione) Nota: embrioni dechorionated sono molto fragili e esploderanno in caso di contatto con l&#39;aria o plastica. Hanno bisogno quindi ad essere messi in piatti agarosio rivestite, e trasferiti con pipette Pasteur di vetro fuoco lucido. <ol><li> Usando una pipetta Pasteur di plastica, trasferire gli embrioni di accoglienza raccolti al punto 3.2 e gli embrioni donatori iniettati al punto 3.3 in due 35 millimetri piastre Petri rivestiti con 1% di agarosio nel medio embrione e riempite con la penna / Strep EM. Mantenere gli embrioni di accoglienza ed embrioni di donatori in due piatti separati. </li><li> estrarre manualmente gli embrioni dai loro chorions con le pinzette sottili (vedi elenco dei materiali). </li><li> Mettere gli embrioni in C incubatore 28 ° fino a quando non hanno raggiunto la fase scudo (6 ore dopo la fecondazione). </li></ol></li></ol>5. trapianto di cellule <ol><li> Disporre il embrioni per il trapianto di cellule. <ol><li> Sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza, selezionare gli embrioni donatori esprimono ABP140-mCherry (rosso) all&#39;interno dello scudo (verde). </li><li> Usando una pipetta Pasteur incendio lucidato, di trasferire gli embrioni nei pozzetti del piatto trapianto di cellule riempito con la penna / Strep EM. Mettere gli embrioni ospitanti in una fila e gli embrioni donatori nella fila vicina. </li><li> Utilizzando un ciglio, orientare con attenzione gli embrioni con lo scudo. Nota: la posizione dello schermo può essere valutata mediante espressione GFP o anatomicamente. </li></ol></li><li> Trapianti System Set-up. Nota: Il sistema di trapianto è composto da un porta-aghi (vedi elenco dei materiali) collegato con tubi in PTFE (vedi elenco dei materiali) e un connettore tubo (vedi elenco dei materiali) ad una siringa Hamilton dotato di un micro-drive (vedi elenco di materiali). Il porta-aghiè montato su un micromanipolatore 3 vie (vedi elenco dei materiali). <ol><li> Usando un supporto ago collegato ad una siringa, lavare l&#39;ago per il trapianto di cellule con il 70% di etanolo. Secco risucchiando aria nel ago. Non asciugare soffiando, in quanto ciò potrebbe causare la polvere conficcato nella parte rastremata dell&#39;ago. </li><li> Inserire l&#39;ago nel supporto ago collegato alla siringa Hamilton, con lo smusso verso l&#39;alto. </li></ol></li><li> Shield-to-shield trapianto di cellule <ol><li> Inserire lo scudo di un embrione donatore con l&#39;ago trapianto e elaborare circa 10-20 cellule marcate con ABP140-mCherry. evitare accuratamente disegno tuorlo. </li><li> Trapianto di cellule nel scudo dell&#39;embrione host. Ripetere l&#39;operazione fino a quando tutti gli embrioni di accoglienza sono state trapiantate. </li><li> Rimuovere eventuali embrioni danneggiati con un incendio lucidato pipetta Pasteur. Mettere gli embrioni trapiantati in incubatore a 28 ° C e lasciarli recuperare per circa 30 min. </li><li> Utilizzando un agotitolare attaccato ad una siringa, lavare l&#39;ago trapianto di cellule con acqua e metterlo di nuovo in una capsula di Petri su una banda di plastilina. Sigillare il piatto con parafilm. </li></ol></li></ol> 6. (Facoltativo) trapianto di cellule singolo Nota: In dell&#39;embrione, le cellule aderiscono l&#39;uno all&#39;altro, in modo che sia difficile disegnare una sola cella l&#39;ago trapianto. Abbiamo sviluppato un protocollo modificato di trapiantare facilmente singole cellule progenitrici piatto precordale. L&#39;idea è quella di dissociarsi cellule prima del trapianto. Perché isolate cellule progenitrici piastra precordale tendono a perdere la loro identità, abbiamo geneticamente imponiamo loro una prospettiva precordale timbro identità, attivando la via di segnalazione nodale, in assenza del fattore di trascrizione Sox32. Abbiamo verificato che queste cellule indotte comportano come endogeni precordale cellule progenitrici piatto 8. Di seguito sono riportati i passaggi specifici per eseguire trapianti di cellule singole. cellulare dissociazionezione si ottiene mettendo embrioni in Ringer senza calcio 11, sezionare un espianto e meccanicamente mescolando. <ol><li> Al passo 2.1, preparare il piatto trapianto con 1% agarosio in Ringer senza calcio, invece di embrioni Media. </li><li> Al passo 3.1, oltre a ABP140-mCherry RNA e morfolino sin1, aggiungere 3 ng di RNA che codifica per la forma attiva del recettore nodale Taram-A (0,6 ng / ml finale) e 1,25 ml di morfolino contro sox32 (soluzione a 2 mM, quindi 0,5 mM finale). </li><li> Dopo il punto 4, il trasferimento di tre embrioni di donatori selezionati nel piatto per il trapianto di cellule riempite con la penna / Strep Ringer priva di calcio utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur. Con una pinzetta sottile, sezionare un espianto contenente le cellule iniettate (ABP140-mCherry cellule marcate). Rapidamente scartare il resto degli embrioni. </li><li> Con un ciglio, mescolare delicatamente l&#39;espianto fino cellule si dissociano. </li><li> Elaborare una singola cella isolata nel ago trapiantie trapiantare in scudo di un embrione ospite. </li><li> Usando una pipetta Pasteur incendio lucidato, di trasferire gli embrioni in un piatto agarosio rivestite pieno di Pen / Strep EM. Mettere gli embrioni in incubatore a 28 ° C per 30 min. </li></ol> 7. Embrione di montaggio <ol><li> Imaging Camera <ol><li> Metodo 1: utilizzare una camera di imaging composto da una slitta di plastica (75 * 25 * 0.5 mm) penetrante con 4 fori (diametro 5,5 mm), con 3 mm bordi alti su un lato (Figura 2C - D). Incollare un vetrino di vetro sul lato posteriore, con la colla cianoacrilato (super colla). Nota: Al termine dell&#39;esperimento, mettere la camera in acqua per una notte per rimuovere il vetrino e sbarazzarsi di residui di colla con carta vetrata. </li><li> Metodo 2: utilizzare 35 mm Mattek vetro piatti inferiori (vedi elenco dei materiali) con un foro di 10 mm. </li></ol></li><li> embrione di montaggio <ol><li> Riempire una fiala di vetro con 1 ml di caldo 0,2% agarosio a medio embrione.Tenerlo a 42 ° C in un calore-blocco. </li><li> Sotto lo stereomicroscopio a fluorescenza, selezionare un embrione in cui le cellule trapiantate rossi sono parte della piastra precordale prospettico etichettati in verde (cioè le cellule trapiantate rossi sono all&#39;interno della piastra precordale prospettiva verde, e hanno iniziato la migrazione verso il polo animale). </li><li> Trasferire un embrione selezionato nella soluzione di agarosio con un incendio lucidato pipetta Pasteur. Eliminare l&#39;eccesso di medio dell&#39;embrione dalla pipetta. Disegnare l&#39;embrione nella pipetta con agarosio, e trasferire l&#39;embrione in camera di imaging, depositando una goccia di agarosio. Prima di agarosio è impostato, orientare l&#39;embrione con un ciglio. Posizionare la piastra precordale prospettica verso l&#39;alto per l&#39;imaging con un microscopio verticale, o sul fondo di vetro per l&#39;imaging con un microscopio invertito. Attendere l&#39;agarosio è impostato (circa 1 min, a seconda della temperatura ambiente) prima di montare un embrione nel pozzo successivo della camera. Nota: un cha immaginimber contenente 4 pozzi consente il montaggio fino a 4 embrioni. </li><li> Quando l&#39;agarosio è impostato, riempire la camera con la penna / Strep EM per evitare l&#39;essiccamento. </li></ol></li></ol> 8. immagini dal vivo <ol><li> Utilizzare un obiettivo a lungo raggio 40X acqua-immersion. Utilizzare appositi set di filtri di immagine GFP e mCherry (per GFP: eccitazione BP 470/40, divisore di fascio FT 510, e l&#39;emissione BP 540/50; per mCherry: eccitazione BP 578/21, divisore di fascio FT 596, e LP emissione di 641 / 75). Regolare la durata dell&#39;esposizione al fine di ottimizzare la dinamica di immagini. </li><li> Per immagine tutte le cellule nella piastra, acquisire z-stack, partendo pochi micron sopra la piastra precordale prospettica (in ectoderma) e termina pochi micron sotto la piastra precordale prospettica (nel tuorlo). Utilizzare un z-passo di 2 micron. Per ottimizzare la velocità di acquisizione, cambiare i colori tra Z-stack piuttosto che tra i fotogrammi. Nota: Ciò può portare a delle differenze fra le immagini verde e rosso, ma non è un problema poiché non precisa coÈ necessario -localization tra i segnali verde e rosso. Per ridurre ulteriormente i tempi di imaging e l&#39;esposizione alla luce, verde può essere acquisita solo una volta ogni 5 punti di tempo, il che è sufficiente per identificare le cellule progenitrici piatto precordale. </li><li> Utilizzando tali impostazioni, immagine fino a 4 embrioni nell&#39;intervallo due minuti di tempo che è necessario analizzare la frequenza protrusione e orientamento. Per l&#39;analisi del ciclo di vita protrusione, ridurre l&#39;intervallo di tempo di 30 sec per ottenere la risoluzione temporale superiore. Immagine dal 60% al 80% epiboly epiboly. </li></ol> 9. Dynamics cella di analisi <ol><li> Caricare le immagini 4D in ImageJ Nota: A seconda del software utilizzato per l&#39;acquisizione, le immagini vengono memorizzate in diversi formati (un file per immagine, un file per z-stack, un file per l&#39;intero esperimento). Alcuni plugin di ImageJ sono disponibili online per aprire pile 4D. I nostri dati vengono memorizzati come un file per z-stack. Poiché il set di dati può essere grande, può essere conveniente aprire solo una parte di essa (alcuni time punti, o una sottoparte di z-stack, o 8 bit convertiti immagini ...). Usiamo un plugin ImageJ su misura per farlo, che saremo lieti di distribuire su richiesta. </li><li> Analisi della Orientamento e frequenza di sporgenze cellulari <ol><li> Usare le immagini GFP per determinare la direzione principale della migrazione potenziale piatto precordale. Prendere come riferimento per misure di angolo di protrusioni cellulari. Ruotare la pila, in modo che tale direzione di riferimento è parallela ad un lato dell&#39;immagine. </li><li> Seguire una cella. Seleziona strumento angolazione. Per ogni fotogramma e ciascuna protrusione, utilizzare lo strumento angolazione per misurare l&#39;angolo tra la sporgenza e la direzione di riferimento (Figura 3A). Utilizzare il comando Analizza / Misura per memorizzare il valore (o premere M sulla tastiera). Salvare i risultati come file txt. Ripetere con la cella successiva. </li><li> Importare i dati in distribuzione R e l&#39;angolo di trama come istogrammi. Utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov (ks.test in R) per confrontare diverse condizioni. Nota: lo strumento angolazione fornisce valori compresi tra 0 ° e 180 °, consentendo l&#39;uso di test statistici classici e test non circolari. </li><li> Con questo insieme di dati, il calcolo della frequenza di emissione come il numero di sporgenze per cella per minuto. Utilizzare Student t-test (t.test in R) per confrontare diverse condizioni. </li></ol></li><li> Analisi della cella sporgenze a vita <ol><li> Per ogni cellula e ogni sporgenza, misura la durata protrusione (numero di fotogrammi in cui la sporgenza è presente x intervallo di tempo tra i fotogrammi). </li><li> Importare i dati in R. Usa Student t-test (t.test in R) per confrontare diverse condizioni. Nota: Altre caratteristiche di migrazione può essere interessante analizzare al fine di caratterizzare la migrazione delle cellule. Questi includono tracce di cellule, per la velocità, la direzione e le misure di persistenza, o morfologia cellulare. Alcune applicazioni software commerciali sono a disposizione per misurare queste caratteristiche, ma un gran numero di software appli open-sourcecationi e plugin di ImageJ sono inoltre disponibili, come per esempio ADAPT per analizzare morfodinamica 12, Diper a guardare traiettorie delle cellule e la persistenza direzionale 13, CellTrack per tracciare i bordi delle celle durante la migrazione 14. </li></ol></li></ol>

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<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta un modo semplice per studiare il ruolo di un gene candidato nella migrazione delle cellule in vivo, unendo la creazione di embrioni chimerici con il trapianto di cellule con l&#39;imaging dal vivo. Creazione di embrioni a mosaico Studiando le dinamiche di una cellula richiede la visualizzazione del suo contorno di analizzare estensioni citoplasmatiche. Ciò può essere ottenuto marcando le cellule isolate in un altrimenti non mar...

Negli organismi multicellulari, migrazione cellulare è essenziale sia per lo sviluppo dell&#39;embrione in cui assicura l&#39;organizzazione delle cellule in tessuti e organi, e per la vita adulta, dove partecipa alla omeostasi tissutale (cicatrizzazione) e l&#39;immunità. Oltre a queste funzioni fisiologiche, la migrazione delle cellule è anche coinvolto in diverse situazioni patologiche, tra cui, in particolare, le metastasi del cancro. La migrazione cellulare è stato analizzato in vitro per decenni, fornendo una comprensione generale dei meccanismi molecolari che assicurano movimenti delle cellule sulle superfici piane. In vivo Tuttavia, le cellule sono di fronte a un ambiente più complesso. È chiaramente apparso negli ultimi anni che la migrazione all&#39;interno di un organismo può essere influenzata da stimoli esterni come la matrice extracellulare, cellule o chemochine secrete guida migrazione vicina, e che i meccanismi di guida migrazione cellulare può variare da quanto descritto &lt;em&gt; in vitro 1,2. I meccanismi che garantiscano nella migrazione cellulare vivo hanno ricevuto meno attenzione finora, principalmente a causa della maggiore difficoltà tecnica, rispetto a studi in vitro. Analisi in vivo della migrazione cellulare in particolare richiede l&#39;accesso ottico diretto alle cellule migrano, tecniche per marcare le cellule uniche a per vedere la dinamica e la morfologia, così come guadagno o perdita di funzione approcci per testare il ruolo dei geni candidati. Finora, solo pochi sistemi modello che ospitano queste caratteristiche sono stati utilizzati per sezionare nella migrazione delle cellule in vivo 3. Recentemente abbiamo usato la migrazione del piatto precordale prospettico nei primi embrioni di zebrafish come un nuovo sistema pratico modello per valutare la funzione dei geni candidati nel controllo nella migrazione delle cellule in vivo 4,5. Piastra precordale prospettico (noto anche come anteriore mesendoderm) è un gruppo di cellule che formano al momento della comparsa di Gastrulation sul lato dorsale dell&#39;embrione. Durante la gastrulazione questo gruppo migra collettivamente verso il polo animale dell&#39;embrione 6-8, per formare la lastra precordale, un ispessimento mesendodermal, anteriore alla notocorda, e alla base della piastra neurale. La parte anteriore della piastra precordale darà luogo alla ghiandola cova, mentre la sua parte posteriore probabilmente contribuisce a testa mesoderma 9. Grazie allo sviluppo esterna e chiarezza ottica dell&#39;embrione pesci, migrazione cellulare può essere direttamente e facilmente osservata in questa struttura. Il trapianto cellulare è una tecnica molto potente che consente la creazione rapida e semplice di embrioni mosaico 10. Esprimendo marcatori del citoscheletro fluorescenti in cellule trapiantate risultati nell&#39;etichettatura delle cellule isolate, la morfologia e la dinamica delle quali possono essere facilmente osservati. Combinando questo per perdita o guadagno di funzione avvicina permette l&#39;analisi delle funzioni cellulari autonomi di una lattinagene didati. Il protocollo presentato descrive come abbiamo valutato la funzione della componente TORC2 sin1 nel controllo della dinamica di migrazione cellulare e di actina in vivo 5. Ma, come detto nei risultati e ulteriormente discussa, potrebbe essere utilizzata per analizzare il potenziale implicazione di un gene candidato nel controllare la migrazione delle cellule in vivo.

<table><tbody><tr><td>Capillari in vetro (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,58&nbsp; mm)</td><td>Apparato Harvard</td><td>300085</td><td>spessore standard</td></tr><tr><td>Capillari in vetro (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,78 mm)</td><td>Apparato Harvard</td><td>300085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td> a parete sottile <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&nbsp; 000&nbsp; unità penicillina e 10&nbsp; mg di streptomicina per ml</td></tr><tr><td>pinzette fini</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>piatti con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Trasiettore d'aria</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forgia</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore (per iniezione)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore (per trapianto di cellule)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipolatore</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Siringa</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 720</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per trapianto</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Porta</td> <td>agoNarishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Connettore per tubi</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in PTFE</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analizzare<em&gt; in vivo</em&gt; migrazione cellulare utilizzando trapianti cellulari e time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

La migrazione cellulare è la chiave per molte condizioni fisiologiche e patologiche, comprese le metastasi del cancro. Le basi cellulari e molecolari della migrazione cellulare sono state analizzate a fondo in vitro. Tuttavia, la migrazione cellulare in vivo differisce in qualche modo dalla migrazione in vitro e si è dimostrata più difficile da analizzare, essendo meno accessibile all'osservazione diretta e alla manipolazione. Questo protocollo utilizza la migrazione della futura placca precordale nell'embrione precoce di zebrafish come sistema modello per studiare la funzione dei geni candidati nella migrazione cellulare. I progenitori delle placche precordali formano un gruppo di cellule che, durante la gastrulazione, subiscono una migrazione diretta dall'organizzatore embrionale al polo animale dell'embrione. Il protocollo proposto utilizza il trapianto di cellule per creare embrioni a mosaico. Ciò offre i vantaggi combinati della marcatura delle cellule isolate, che è la chiave per un buon imaging, e della limitazione degli effetti di guadagno/perdita di funzione alle cellule osservate, garantendo così effetti autonomi delle cellule. Descriviamo qui come abbiamo valutato la funzione del componente TORC2 Sin1 nella migrazione cellulare, ma il protocollo può essere utilizzato per analizzare la funzione di qualsiasi gene candidato nel controllo della migrazione cellulare in vivo.

La tecnica presentata è stata utilizzata per analizzare il ruolo di sin1, uno dei componenti principali del Tor complesso 2 (TORC2), nel controllo nella migrazione delle cellule in vivo. L&#39;uso di trapianto di cellule permette l&#39;etichettatura di cellule isolate e l&#39;analisi degli effetti delle cellule-autonomo. Film S1 mostra la migrazione delle cellule progenitrici piastra precordale trapiantati. etichettatura actina con ABP140 permette la facile vis...

Combinando approcci di trapianto cellulare, marcatura citoscheletrica e perdita/guadagno di funzione, questo protocollo descrive come la piastra precordale prospettica del pesce zebra in migrazione possa essere utilizzata per analizzare la funzione di un gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è analizzare la funzione di un gene candidato nel controllo della migrazione cellulare in vivo, utilizzando il trapianto cellulare abbinato all'imaging in tempo reale nell'embrione di pesce zebra. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della migrazione cellulare, come determinare il ruolo e l'importanza di nuovi geni candidati nella migrazione cellulare in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di ottenere embrioni mosaicici, permettendo un buon imaging e l'adenomiosi cellulare.Per preparare gli aghi per il trapianto cellulare, utilizzare un estrattore per micropipette per tirare una capillare di vetro. Successivamente, con un microforgiatore, tagliare la punta dell'ago nel punto in cui il diametro interno è di 35 micrometri. Utilizzando una microaffilatrice, smussare l'estremità tagliata della capillare con un angolo di 45 gradi.Per eliminare i residui di vetro, inserire l'ago in un supporto per aghi montato su una siringa, quindi utilizzare l'acido fluoridrico al 2% per risciacquare l'interno dell'ago tre volte, aspirando e spingendo la soluzione. Proseguire risciacquando l'ago con acetone per tre volte. Per preparare le piastre per l'iniezione o il trapianto cellulare, preparare l'agarosio all'1% riscaldando 50 millilitri di mezzo per embrioni contenente 0,5 grammi di agarosio in un forno a microonde per un minuto alla massima potenza.Raffreddare il gel di agarosio a circa 60 gradi Celsius e versare l'intero volume in una piastra di Petri da 90 millimetri. Inserire un modello per creare delle linee per l'iniezione o dei pozzetti per il trapianto cellulare. Quando il gel di agarosio si è solidificato, utilizzare una pinzetta per rimuovere il modello.Per iniettare gli embrioni donatori, sotto un microscopio stereoscopico utilizzare pinzette per comprimere delicatamente gli embrioni transgenici raccolti lungo le linee di una piastra per iniezioni riempita con mezzo per embrioni. Orientare gli embrioni con le cellule rivolte verso l'alto utilizzando le pinzette, quindi incubare la piastra a 28 gradi Celsius finché gli embrioni non avranno raggiunto lo stadio a quattro cellule. Successivamente, caricare un ago per iniezioni con due microlitri di una soluzione per iniezione preparata in precedenza, contenente il dominio legante l'actina della proteina legante l'actina di lievito 140 legata a mcherry.Quindi inserire l'ago in un porta-ago collegato a un micromanipolatore e connesso a un iniettore ad aria. Aprire l'ago utilizzando pinzette fini per toccare delicatamente la punta dell'ago o schiacciandone l'estremità. Inserire quindi l'ago in una delle quattro cellule e iniettare la soluzione fino a riempire il 70% del volume cellulare.Iniettare 30 embrioni in modo analogo. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sferula, utilizzare una pipetta Pasteur in plastica per trasferire gli embrioni ospiti transgenici goosecoid GFP e gli embrioni donatori precedentemente iniettati in piatti di Petri separati da 35 millimetri, rivestiti con agarosio da un millimetro in mezzo per embrioni e riempiti con mezzo per embrioni contenente Pen/Strep. Utilizzando pinzette fini, estrarre manualmente gli embrioni dai loro corioni.Quindi posizionare gli embrioni nell'incubatrice a 28 gradi Celsius. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio shield al microscopio fluorescente, selezionare gli embrioni donatori che esprimono ABP140 mcherry all'interno dello shield verde. Utilizzando una pipetta Pasteur lucidata a fuoco, trasferire gli embrioni ospiti in una fila di pozzetti nella piastra per trapianto cellulare riempita con EM contenente Pen/Strep. Quindi posizionare gli embrioni donatori nella fila adiacente.Successivamente, con una ciglio orientare con attenzione gli embrioni con lo scudo rivolto verso l'alto. Quindi, utilizzando un portaaighi collegato a una siringa, risciacquare la punta dell'ago aspirando ed espellendo alcol al 70%. Asciugare l'ago aspirando aria al suo interno.Quando l'ago è asciutto, inserirlo nel portaghiaccio collegato alla siringa Hamilton con il bisellino rivolto verso l'alto. Per eseguire il trapianto da scudo a scudo, introdurre l'ago di trapianto nello scudo di un embrione donatore e aspirare circa da 10 a 20 cellule marcate con ABP140 mcherry. Evitare con attenzione di aspirare il tuorlo.Trapiantare le cellule nello scudo dell'embrione ospite e ripetere il trasferimento cellulare fino a quando tutti gli embrioni ospiti sono stati trapiantati. Al termine del trapianto, utilizzare una pipetta Pasteur lucidata a fuoco per rimuovere eventuali embrioni danneggiati. Incubare gli embrioni trapiantati a 28 gradi Celsius per circa 30 minuti per permettere loro di riprendersi.Per trapiantare singole cellule progenitrici della placca prechordale dopo aver dechorionato gli embrioni, come dimostrato in precedenza, utilizzare una pipetta Pasteur lucidata a fuoco per trasferire tre embrioni donatori in una piastra per trapianto cellulare riempita con ringer privo di calcio contenente Pen/Strep. Per ciascun embrione, utilizzando pinzette fini, dissezionare un espianto contenente le cellule marcate con ABP140 mCherry ed eliminare rapidamente il resto dell'embrione. Utilizzando una ciglio, mescolare delicatamente gli espianti finché le cellule non si dissociano.Quindi aspirare una singola cellula isolata nell'ago di trapianto e trapiantarla nello scudo di un embrione ospite, come dimostrato in precedenza nel video. Per un controllo ottimale dell'aspirazione e del trapianto, mantenere la separazione aria/acqua a circa 20 centimetri dall'estremità dell'ago. Per montare gli embrioni, riempire una provetta con fondo in vetro con un millimetro di agarosio caldo al 0,2% in EM. Posizionare la provetta a 42 gradi Celsius in un blocco riscaldante.Trasferire un embrione selezionato nella soluzione di agarosio e scartare il mezzo embrionale in eccesso dalla pipetta. Quindi aspirare l'embrione nella pipetta insieme all'agarosio e trasferirlo in una camera di imaging precedentemente preparata, insieme a una goccia di agarosio. Prima che l'agarosio si solidifichi, utilizzare un ciglio per orientare l'embrione posizionando la placca precondrale dal lato superiore per l'analisi con un microscopio verticale, oppure sul fondo in vetro per l'analisi con un microscopio invertito.Il tempo disponibile per orientare l'embrione prima che il gel di agarosio si solidifichi &egrave; di circa 40 secondi, a seconda della temperatura ambiente. Orientare rapidamente l'embrione manipolando il blastoderma piuttosto che il tuorlo, che &egrave; molto fragile. Dopo aver montato tutti gli embrioni e una volta che l'agarosio si &egrave; solidificato, utilizzare l'EM con Pen/Strep per riempire la camera ed evitare che gli embrioni si secchino.Eseguire l'analisi in tempo reale delle cellule vive e gli esperimenti sulle dinamiche cellulari seguendo il protocollo descritto. La tecnica mostrata in questo video è stata utilizzata per analizzare il ruolo di Sin1, uno dei componenti fondamentali del complesso TOR due, nel controllo della migrazione cellulare in vivo. Questo filmato mostra la migrazione di cellule progenitrici del placode prenotocordale trapiantate.La marcatura dell'actina permette di visualizzare le protrusioni citoplasmatiche ricche di actina. Attraverso l'analisi della frequenza e dell'orientamento, si è osservato che le cellule di tipo selvaggio producono frequentemente ampie protrusioni citoplasmatiche orientate in direzione del polo animale e della migrazione. Come mostrato in questa figura, la perdita di funzione di Sin1 provoca una drastica riduzione del numero di protrusioni e una randomizzazione delle protrusioni residue, dimostrando l'importanza di Sin1 nel controllo della formazione di protrusioni ricche di actina.È interessante notare che il fenotipo di Sin1 può essere recuperato dall'espressione di una forma costitutivamente attiva di Rac1, suggerendo fortemente che il complesso TOR C2 controlla la dinamica dell'actina e la formazione delle protrusioni cellulari attraverso Rac1. Questa tecnica è stata inoltre utilizzata per analizzare il ruolo di arpin, un inibitore del complesso ARP2/3, nella migrazione cellulare. Come mostrato qui, la perdita di funzione di arpin porta a un aumento della frequenza delle protrusioni, dovuto o a una formazione più frequente delle protrusioni stesse o a un incremento della loro stabilità.La misurazione della durata delle protrusioni in assenza di arpin ha rivelato che la persistenza temporale delle protrusioni raddoppia, indicando un aumento della stabilità. Una volta acquisita padronanza, il trapianto di circa 30 embrioni può essere eseguito in 45 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare attentamente lo sviluppo degli embrioni poiché tutti i passaggi sono strettamente dipendenti dai tempi.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia confocale in tempo reale per ottenere immagini migliori e rispondere a domande riguardanti l'organizzazione subcellulare di elementi citosolici, marcatori di polarità, proteine aggiuntive o qualsiasi altro costituente cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare trapianti di precursori della placca prechordale per analizzare il ruolo di qualsiasi gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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Fonte: Williams, A. L., et al. Imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione delle cellule neurali in cresta in migrazione negli embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un protocollo di imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di zebrafish in tempo reale con alta risoluzione.

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