analizzare In Vivo Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la funzione di un gene candidato nel controllo della migrazione cellulare in vivo utilizzando il trapianto di cellule combinato con l'imaging dal vivo nell'embrione di Zebrafish. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo della migrazione cellulare, come determinare il ruolo e l'importanza di nuovi geni candidati nella migrazione cellulare in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea embrioni a mosaico che consentono un buon imaging e adenomiosi cellulare.

Per preparare gli aghi per il trapianto di cellule, utilizzare un micro estrattore per pipette per estrarre un capilare di vetro. Quindi, con una microforgia, tagliare la punta dell'ago nel punto in cui il diametro interno è di 35 micrometri. Utilizzando un microgrinder, smussare l'estremità tagliata del capillare con un angolo di 45 gradi.

Per eliminare i residui di vetro, inserire l'ago in un portaaghi montato su una siringa, quindi utilizzare acido fluoridrico al 2% per sciacquare l'interno dell'ago tre volte aspirando la soluzione dentro e fuori. Successivamente risciacquare l'ago con acetone tre volte. Per preparare piatti per iniezione o trapianto di cellule, preparare l'agarosio all'1% riscaldando 50 millilitri di terreno embrionale contenente 0,5 grammi di agarosio in un forno a microonde per un minuto alla massima potenza.

Raffreddare il gel di agarosio a circa 60 gradi Celsius e versare l'intero volume in una capsula di Petri da 90 millimetri. Inserire uno stampo per creare linee per l'iniezione o per creare pozzetti per il trapianto di cellule. Quando il gel di agarosio è solidificato, utilizzare una pinza per rimuovere lo stampo.

Per iniettare gli embrioni di donatori, sotto uno stereomicroscopio utilizzare una pinza per spremere delicatamente gli embrioni transgenici raccolti nelle linee di una capsula per iniezione piena di terreno embrionale. Con una pinza, orientare gli embrioni con le cellule verso l'alto, quindi incubare la piastra a 28 gradi Celsius fino a quando gli embrioni non hanno raggiunto lo stadio di quattro cellule. Quindi, caricare un ago per iniezione con due microlitri di una soluzione per iniezione precedentemente preparata contenente il dominio legante l'actina della proteina legante l'actina del lievito 140 legata al ciliegio.

Quindi inserire l'ago in un portaaghi collegato a un micromanipolatore e collegato a un trasiettore d'aria. Aprire l'ago utilizzando una pinza sottile per toccare delicatamente la punta dell'ago o pizzicando l'estremità. Quindi inserire l'ago in una delle quattro celle e iniettare la soluzione per riempire il 70% del volume cellulare.

Iniettare 30 embrioni in modo simile. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio sferico, utilizzare una pipetta di plastica per pascolo per trasferire gli embrioni GFP di occa transgenica ospite e gli embrioni di donatori precedentemente iniettati in piastre di Petri separate da 35 millimetri rivestite con un millimetro di agarosio in terreno embrionale e riempite con terreno embrionale Pen/Strep. Utilizzando una pinzetta sottile, estrai manualmente gli embrioni dai loro corioni.

Quindi posizionare gli embrioni nell'incubatrice a 28 gradi Celsius. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di scudo al microscopio fluorescente, selezionare gli embrioni della donatrice che esprimono ABP140 mcherry all'interno dello scudo verde. Utilizzando una pipetta da pascolo lucidata a fuoco, trasferire gli embrioni ospiti in una fila di pozzetti nella capsula di trapianto di cellule riempita con Pen/Strep EM. Quindi posizionare gli embrioni del donatore nella fila adiacente.

Successivamente, con una ciglia, orientare attentamente gli embrioni con lo scudo rivolto verso l'alto. Quindi, utilizzando un portaaghi attaccato a una siringa, sciacquare la punta dell'ago aspirando ed espellendo il 70% di etanolo. Asciugare l'ago aspirando aria al suo interno.

Quando l'ago è asciutto, inserirlo nel portaago collegato alla siringa Hamilton con lo smusso rivolto verso l'alto. Per eseguire il trapianto scudo a scudo, entrare nello scudo di un embrione donatore con l'ago da trapianto e prelevare da 10 a 20 cellule marcate con ABP140 mcherry. Evita accuratamente di estrarre il tuorlo.

Trapiantare le cellule nello scudo dell'embrione ospite e ripetere il trasferimento delle cellule fino a quando tutti gli embrioni ospiti sono stati trapiantati. Al termine del trapianto, utilizzare una pipetta da pascolo lucidata a fuoco per rimuovere eventuali embrioni danneggiati. Incubare gli embrioni trapiantati a 28 gradi Celsius per circa 30 minuti per consentire loro di riprendersi.

Per trapiantare singole cellule pregenitrici della piastra precordale dopo aver dechorionato gli embrioni, come dimostrato in precedenza, utilizzare una pipetta da pascolo lucidata a fuoco per trasferire tre embrioni di donatori in una capsula per trapianto di cellule riempita con anelli Pen/Strep privi di calcio. Con una pinzetta sottile per ogni embrione, sezionare un espianto contenente le cellule marcate con ABP140 mcherry iniettato e scartare rapidamente il resto degli embrioni. Usando una ciglia, mescola delicatamente gli espianti fino a quando le cellule non si dissociano.

Quindi prelevare una singola cellula isolata nell'ago da trapianto e trapiantarla nello scudo di un embrione ospite, come dimostrato in precedenza nel video. Per un controllo ottimale dell'aspirazione e del trapianto, mantenere la separazione aria/acqua a circa 20 centimetri dall'estremità dell'ago. Per montare gli embrioni, riempire una fiala con fondo di vetro con un millimetro di agarosio caldo allo 0,2% in EM. Posizionare la fiala a 42 gradi Celsius in un blocco termico.

Trasferire un embrione selezionato nella soluzione di agarosio ed eliminare il terreno embrionale in eccesso dalla pipetta. Quindi aspirare l'embrione nella pipetta con l'agarosio e trasferirlo in una camera di imaging precedentemente preparata insieme a una goccia di agarosio. Prima di posizionare l'agarosio, utilizzare una ciglia per orientare l'embrione posizionando la piastra precordale prospettica verso l'alto per l'imaging con un microscopio verticale o sul fondo di vetro per l'imaging con un microscopio invertito.

Ci saranno circa 40 secondi per orientare l'embrione prima che il gel di agarosio si solidifichi a seconda della temperatura ambiente. Orientare rapidamente l'embrione manipolando il blastoderma piuttosto che il tuorlo che è molto fragile. Dopo che tutti gli embrioni sono stati montati e l'agarosio è stato impostato, utilizzare Pen/Strep EM per riempire la camera per evitare che gli embrioni si secchino.

Eseguire esperimenti di imaging di cellule vive e di dinamica cellulare secondo il protocollo di testo. La tecnica dimostrata in questo video è stata utilizzata per analizzare il ruolo di Sin1, uno dei componenti principali del complesso TOR 2, nel controllo della migrazione cellulare in vivo. Questo filmato mostra la migrazione delle cellule pregenitrici della placca precordale trapiantate.

La marcatura dell'actina consente di visualizzare le protrusioni citoplasmatiche ricche di actina. Attraverso l'analisi della frequenza e dell'orientamento è stato osservato che le cellule wild type producono frequentemente grandi sporgenze citoplasmatiche, orientate in direzione del polo animale, e di migrazione. Come si vede in questa figura, la perdita di funzione di Sin1 porta ad una drastica riduzione del numero di protrusioni e alla randomizzazione delle protrusioni rimanenti, dimostrando l'importanza di Sin1 nel controllo della formazione di protrusioni ricche di actina.

È interessante notare che il fenotipo Sin1 può essere salvato dall'espressione di una forma costitutivamente attiva di Rac1, suggerendo fortemente che TOR C2 controlla la dinamica dell'actina e la formazione della protrusione cellulare attraverso Rac1. Questa tecnica è stata utilizzata anche per analizzare il ruolo dell'arpina, un inibitore del complesso ARP2/3 nella migrazione cellulare. Come mostrato qui, la perdita di funzione dell'arpino porta ad un aumento della frequenza di protrusione, a causa di una formazione di protrusione più frequente o di un aumento della stabilità della protrusione.

La misurazione della durata della protrusione in assenza di arpin ha rivelato che la persistenza temporale delle sporgenze raddoppiava, indicando un aumento della stabilità. Una volta padroneggiato, il trapianto di circa 30 embrioni può essere effettuato in 45 minuti. Durante il tentativo di questa procedura è importante tenere d'occhio lo sviluppo degli embrioni poiché tutti i passaggi sono cronometrati in modo critico.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia confocale dal vivo per fornire un imaging migliore e affrontare le domande relative all'organizzazione sottocellulare degli elementi citoscotici, dei marcatori di polarità, delle proteine di addizione o di qualsiasi altro costituente cellulare. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i trapianti di pregenitori della placca precordale per analizzare il ruolo di qualsiasi gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.