Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato Plasmodium sporozoiti

L'obiettivo generale di questa serie di procedure è quello di immunizzare i topi con parassiti del plasmodio attenuati dalle radiazioni. Per facilitare l'analisi del reclutamento delle cellule mieloidi nella pelle del topo e nel drenaggio dei linfonodi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malaria, come ad esempio quali sono gli attori cellulari coinvolti nell'immunorisposta innata ai parassiti vivi attenuati.

Tra 18-25 giorni dopo il pasto di sangue dell'infezione, raccogliere e anestetizzare a freddo le zanzare infette in un tubo da 15 millilitri su ghiaccio. Quindi, capovolgere con cura il tubo in una capsula di Petri su ghiaccio ed esporre gli insetti a una dose di 12 kilorad di irradiazione gamma o X. Raccogli le ghiandole salivari irradiate dalle zanzare in 15 microlitri di DPBS su ghiaccio.

E poi, schiaccia delicatamente le ghiandole per rilasciare gli sporozoiti. L'iniezione di una sospensione antiparassitaria altamente concentrata in un piccolo volume è fondamentale, quindi è importante raccogliere un numero sufficiente di ghiandole salivari da zanzare ben infette, come evidenziato dalla robusta espressione di fluorescenza verde. Risospendere la sospensione del parassita prima della filtrazione attraverso un filtro da 35 micrometri adattato a una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Utilizzando una camera di conteggio al microscopio, contare il numero totale di sporozoiti isolati e regolare la sospensione del parassita a una concentrazione di 8,3 volte dieci al quarto sporozoite per microlitro in DPBS freddo su ghiaccio. Prima di iniettare gli sporozoiti, confermare il corretto livello di sedazione dell'animale da esperimento pizzicando le dita dei piedi e applicare un unguento per gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale. Quindi, lavorando rapidamente, utilizzare del nastro adesivo trasparente per fissare delicatamente il lato ventrale del padiglione auricolare sotto uno stereomicroscopio e caricare una siringa da dieci microlitri, dotata di ago calibro 35, con 0,6 microlitri di parassiti risospesi.

Quindi, inserire con cautela l'ago, con il lato smussato rivolto verso l'alto, sotto l'epidermide sul lato dorsale dell'orecchio e iniettare 0,15 microlitri di sporozoiti nel sito. Si osserverà una papula caratteristica nel sito di iniezione. Dopo aver iniettato il derma altre tre volte, come appena dimostrato, rimuovere con cura il nastro e monitorare il mouse fino a quando non si è completamente ripreso.

Al momento desiderato dopo l'inoculazione dello sporozoite, sacrificare il topo e iniziare immediatamente la procedura. Assicurati che il topo mostri segni di morte clinica. Disinfettare l'orecchio e la corrispondente regione del collo con etanolo al 70%.

Successivamente, utilizzando forbici e pinze sterili, praticare un'incisione nell'area jugulo-carotidia. Quindi allungare l'incisione con due pinze per esporre il linfonodo drenante dall'aspetto grigio. Pizzicare e rimuovere con cautela il tessuto connettivo direttamente sopra il linfonodo ed estrarlo con un secondo paio di pinze, posizionato sotto di esso.

Trasferire il linfonodo in un colino da 70 micron in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti, contenente 4,5 millilitri di terreno standard, integrato con collagenasi e DNasi. Successivamente, prelevare l'intero orecchio inoculato e utilizzare due pinze per pizzicare e separare l'orecchio negli aspetti dorsale e ventrale. Quindi posizionare ciascun lato dell'orecchio in un pozzetto di una seconda piastra a sei pozzetti, contenente 4,5 millilitri per pozzetto di terreno integrato con enzimi digestivi, facendo attenzione che ogni tessuto sia completamente immerso nel terreno.

Per isolare le cellule immunitarie dai linfonodi, incubare la piastra di tessuto linfoide a 37 gradi Celsius e il cinque percento di CO2 sotto leggera agitazione. Dopo 15 minuti, aggiungere dieci millimolari di EDTA a ciascun pozzetto e posizionare la piastra sul ghiaccio. Successivamente, per ogni linfonodo, utilizzare l'estremità di un nuovo stantuffo della siringa da cinque millimetri e premere il linfonodo contro il colino usando movimenti circolari per dissociare il tessuto.

Quando rimane solo tessuto connettivo bianco, sciacquare il colino due volte con 500 microlitri di DPBS contenente FBS e EDTA e trasferire il lavaggio in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi, lavare il pozzetto altre due volte con 500 microlitri di DPBS integrato e trasferire il lavaggio nel tubo posto sul ghiaccio. Per isolare le cellule immunitarie dall'orecchio, incubare i lembi auricolari a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2 con una leggera agitazione.

Dopo 20 minuti, tagliare i tessuti in pezzi più piccoli per facilitarne la digestione e rimettere i campioni nell'incubatore. Dopo 40 minuti, fermare la digestione con EDTA da dieci millimolari e posizionare la piastra sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta da un millilitro con punta tagliata, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto in nuovi pozzetti contenenti filtri da 70 micron.

E usa uno stantuffo della siringa da cinque millilitri per dissociare i frammenti di tessuto dell'orecchio con movimenti circolari come appena dimostrato. Quando rimangono solo il tessuto connettivo bianco e i capelli, lavare i filtri e i pozzetti con DPBS più FBS ed EDTA come appena dimostrato, raccogliendo i lavaggi in un tubo da 50 millilitri su ghiaccio. Infine, lavare il pozzetto due volte con DPBS integrato e trasferire il lavaggio nel tubo posto sul ghiaccio.

In questo video, si può vedere la migrazione degli sporozoiti attenuati dalle radiazioni nella pelle del topo 15 minuti dopo l'iniezione intradermica dei parassiti. 24 ore dopo l'iniezione intradermica di sporozoiti, le cellule totali vengono isolate dalla pelle e dal linfonodo drenante. Come osservato in questa figura, la frequenza delle cellule mieloidi nella pelle e nel linfonodo drenante è notevolmente aumentata rispetto ai topi naïve.

Una volta padroneggiati, i primi passi del protocollo per l'irradiazione delle zanzare all'iniezione di sporozoite possono essere completati in quattro ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che lo sporozoite isolato dalle ghiandole salivari delle zanzare perde rapidamente la sua infettività. Quindi devono essere iniettati il più rapidamente possibile.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule mieloidi dalla pelle del topo e dal linfonodo drenante per esplorare l'immunorisposta all'iniezione intradermica di parassiti vivi attenuati del plasmodio.