Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire colture sane a lungo termine di neuroni primari dell'ippocampo di topo a bassissima densità, al fine di facilitare la marcatura immunocitochimica e lo studio dei meccanismi autonomi delle cellule neuronali. Questo studio può aiutare a comprendere alcune questioni chiave nel campo della ricerca neuroscientifica come gli studi sulla specificità delle proteine nella neuromorfologia della funzione dello sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai neuroni di crescere a densità ultra-bassa su un vetrino coprioggetti senza il supporto di uno strato di alimentazione gliale.

A dimostrare la procedura sarà Mariel Piechowicz, una studentessa del mio laboratorio. Preparare due piastre a 24 pozzetti ad alta densità e due a bassa densità. Utilizzando un ago calibro 28, incidere il fondo di piastre a 24 pozzetti, in modo che la plastica spostata funga da supporto per i vetrini coprioggetti con neuroni a bassa densità che crescono su di essi.

Trasferire i vetrini di vetro sterili nelle due piastre da 24 pozzetti destinate alle colture a bassa densità. Rivestire tutte e quattro le piastre con 300 microlitri di poli-D-lisina da 0,1 milligrammi per millilitro diluita in tampone borato e rimetterle nell'incubatore per il rivestimento di incubazione notturna. Prima della raccolta dei tessuti, preparare due piastre di Petri da 10 centimetri riempite con HBSS sterile ghiacciato.

Al microscopio, tieni l'embrione per il collo con la pinza e fai il primo taglio proprio sulla linea mediana, sotto il livello del cervelletto. Successivamente, fai un taglio sul lato sinistro della base del cranio. Quindi, fai un altro taglio sul lato destro della base del cranio.

Lasciare una piccola parte del cranio, dell'osso e del tessuto cutaneo all'estremità rostrale non tagliata in modo che l'intero cervello possa essere girato da parte per l'estrazione facilmente. Ora trasferisci il cervello nella soluzione HBSS. Ispeziona il cervello per assicurarti che sia intatto senza regioni tagliate grossolane.

Quindi, ripetere le procedure per raccogliere il resto del cervello dell'embrione in una nuova capsula di Petri contenente 20 millilitri di tampone HBSS freddo. Posiziona ogni cervello con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Tenendo premuto il cervello con una pinza all'estremità caudale, praticare un taglio diagonale tra il punto rostrale medio e la regione temporale caudale con una pinzetta affilata.

Ripeti l'operazione per l'altro emisfero. Successivamente, separare i due emisferi con l'ippocampo intatto dal resto dei tessuti staminali del cervello. Ripetere le procedure per tutti i cervelli e raggruppare tutti gli emisferi sezionati.

Quindi, rimuovere le meningi usando due paia di pinzette. Identificare l'ippocampo in via di sviluppo come una struttura curva che è ripiegata all'interno del lobo temporale e separarla dai tessuti corticali adiacenti. Raccogli e raccogli tutti i tessuti dell'ippocampo.

In questa procedura, trasferire tutti gli ippocampi sezionati nella soluzione di digestione enzimatica in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, posizionare la provetta all'interno di un bagnomaria e incubare a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Dopo 25 minuti, rimuovere con cautela la soluzione enzimatica.

Quindi, aggiungi cinque millilitri di terreno di lavaggio caldo per portare il volume totale a 10 millilitri. Lavare delicatamente il fazzoletto capovolgendo lentamente il tubo cinque volte. Rimuovere il mezzo di lavaggio e aggiungere nuovamente 10 millilitri di mezzo di lavaggio, per un ulteriore lavaggio.

Successivamente, rimuovere il mezzo di lavaggio e aggiungere nuovamente tre millilitri di mezzo di lavaggio caldo fresco. Agitare rigorosamente il tubo a mano 15 volte per rimuovere i neuroni digeriti dal tessuto. Il terreno dovrebbe diventare torbido una volta che le cellule sono state separate dal tessuto nel mezzo di lavaggio.

Quindi, raccogliere la sospensione cellulare in una nuova provetta conica da 15 millilitri, lasciando il tessuto rimanente nella provetta. Successivamente, aggiungere altri due millilitri di terreno di lavaggio al fazzoletto e separare delicatamente il tessuto rimanente triturando con una pipetta di plastica 15 volte. Lasciare riposare la sospensione cellulare per cinque minuti prima di raccoglierla in un nuovo tubo conico da 15 millilitri che contiene le cellule di scuotimento raccolte.

Quindi, conta la densità dei neuroni con un emocitometro. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per produrre una densità di 250.000 neuroni per millilitro e aggiungerlo a una delle due provette coniche contenenti 30 millilitri di terreno di coltura completo, per ottenere un terreno di placcatura neuronale ad alta densità. Trasferire 1,2 millilitri di questa soluzione di neurone ad alta densità ad altri 30 millilitri di terreno di coltura completo, per ottenere una concentrazione di 10.000 neuroni per millilitro, e utilizzare questa soluzione per seminare i vetrini coprioggetti a bassa densità.

In questa procedura, posizionare piastre a 24 pozzetti con fondo inciso per neuroni ad alta densità nella cappa di coltura. Rimuovere 300 microlitri del terreno precondizionato sotto vuoto, quindi lastra 0,6 millilitri di sospensione cellulare ad alta densità a 250.000 neuroni per millilitro. Posizionare le altre due piastre da 24 pozzetti con i vetrini di copertura nel cappuccio di coltura.

Rimuovere 300 microlitri del terreno precondizionato sotto vuoto, prima di placcare 0,6 millilitri di sospensione cellulare a bassa densità a 10.000 neuroni per millilitro sui vetrini. Successivamente, rimettere tutte e quattro le piastre da 24 pozzetti nell'incubatore e incubare per due ore. Dopodiché, capovolgi i vetrini di copertura a bassa densità con i neuroni aderenti alla coltura ad alta densità e assicurati che i neuroni siano uno di fronte all'altro.

Successivamente, rimettere le due piastre con la co-coltura nell'incubatrice. Nutrire le co-colture aggiungendo 300 microlitri di terreno di coltura fresco alla DIV cinque. Dopo questa poppata iniziale, aggiungere 300 microlitri di terreno di alimentazione fresco senza citosina arabinoside a ciascun pozzetto ogni settimana.

Se la coltura viene conservata per più di un mese, sostituire metà del terreno con un terreno di alimentazione fresco ogni settimana oltre un mese. Morfologicamente, sia i neuroni ad alta densità che quelli a bassa densità dovrebbero apparire sani fino a tre mesi. Qui, la marcatura immunocitochemitrica viene utilizzata per rivelare le sinapsi glutammatergiche funzionali in cui la subunità del recettore NMDA NR1 e la subunità del recettore ApoE GluR1 sono marcate con doppia colorazione.

I neuroni a bassa densità sono anche marcati con anticorpi contro il marcatore proteico dendritico MAP2 in combinazione con il marcatore proteico assonale p-Tau. Questa doppia marcatura consente una chiara distinzione tra dendriti e assoni. Le colture a bassa densità possono anche essere trasfettate con successo con plasmidi di DNA utilizzando metodi di fosfato di calcio, sebbene il tasso di trasfezione sia in genere molto basso nelle fasi successive.

Questa figura illustra che la trasfezione di EGFP può rivelare la morfologia neuronale e rendere visibili le strutture sottili della spina dendritica. Infine, come prova di concetto, i neuroni a bassissima densità possono essere coltivati in condizioni che promuovono la formazione dell'autapsi. Questi neuroni autaptici a bassissima densità, cresciuti su microisole rivestite di poli-D-lisina, possono essere sostenuti dai neuroni alimentatori ad alta densità fino a oltre due mesi con questo protocollo di co-coltura.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore il giorno della coltura cellulare se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale rivestire i vetrini di copertura e il fondo delle piastre a 24 pozzetti con poli-D-lisina. Una semplice incisione del fondo della placca è sufficiente a fornire supporto meccanico e nutrizionale ai neuroni ippocampali a bassa densità per crescere sui vetrini.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come far crescere neuroni dell'ippocampo embrionale primario di topo a bassissima densità, in assenza di uno strato di alimentazione gliale. Si spera che tu possa utilizzare questo metodo per il tuo scopo sperimentale.