Name: Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri un metodo semplificato per coltivare neuroni ippocampali primari a densità ultra-bassa senza strato gliale. Questa tecnica facilita l'immunocitochimica e lo studio dei meccanismi neuronali autonomi.

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Questo studio è stato supportato da una sovvenzione NIH/NIMH a S.Q. (R00MH087628).

Tutte le procedure sperimentali di topi sono stati approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Arizona, e conformi alle linee guida NIH. 1. Tissue sorgente per ippocampale Neuron Cultura <ol><li> Per generare cuccioli di topo prenatali per la cultura neuroni dell&#39;ippocampo, usare i topi tempo in stato di gravidanza (C57Bl6 / J) che vengono allevati in casa 17. La giornata con rilevazione spina vaginale è designato come E0.5. Il tempo del raccolto previsto per la cultura è E16.5-E17.5. Nota: Questo protocollo descrive le culture di due piastre da 24 pozzetti di due neuroni ad alta densità co-coltura di neuroni con bassa densità (48 lamelle in totale). Per altri piatti, materiali e reagenti può essere scalata di conseguenza. </li></ol> 2. piastre da 24 pozzetti di preparazione per alta densità Neuron Culture Nota: eseguire le seguenti operazioni (2-3) il giorno prima del raccolto previsto di embrioni. <ol><li> Portare due 24 benepiastre nella cappa di coltura cellulare, aprire la confezione singola. </li><li> Collegare un ago 18 G siringa per una siringa monouso 1 ml di plastica. </li><li> Tenere la siringa, e puntare la punta dell&#39;ago a ~ 1 mm a sinistra al centro del fondo del pozzo. Applicare moderata forza (~ 250 g) per incidere il fondo del pozzo (~ lunga 1 mm). Una scanalatura sarà formata e materie plastiche spostato formerà un supporto elevata sopra la superficie ben fondo piatto. Etch un&#39;altra scanalatura parallela ~ 1 mm di lunghezza a ~ 1 mm a destra del centro del fondo in un modo simile. </li><li> Ripetere questo passaggio per tutti i pozzi delle due piastre da 24 pozzetti. Le due piastre da 24 pozzetti utilizzati per la cultura alta densità sono ora pronti per il rivestimento con poli-D-lisina (vedi punto 3.8 qui di seguito). </li></ol> 3. Coprioggetto Preparazione per la bassa densità Neuron Culture <ol><li> Usare 12 mm di diametro # 1 di vetro rotondo. </li><li> Mettere 50 vetrini all&#39;interno di un diametro di 100 mm di plastica sterile capsula di Petri, e immergere coprioggettoin soluzione di etanolo 20 ml 70%. Posizionare questa capsula di Petri su una piattaforma rotante con moderata (70 rpm) velocità di rotazione per un&#39;ora. Rimuovere etanolo al 70% e quindi sostituire con un nuovo lotto di 70% di etanolo. Ruotare e lavare per un&#39;altra ora. </li><li> Scartare soluzione di pulizia etanolo al 70%. Aggiungere acqua sterile (filtrata attraverso unità di filtro da 0,2 micron). Lavare i coprioggetti rigorosamente facendo ruotare la piastra di Petri a mano. Risciacquare tre volte, ogni volta sostituendo con acqua fresca sterile. </li><li> Porre la capsula di Petri con vetrini all&#39;interno di una cappa di coltura cellulare sterile con flusso laminare. Aspirare l&#39;acqua di risciacquo attraverso la linea del vuoto, e aggiungere 10 ml di acqua sterile filtrata per immergere i vetrini. I vetrini devono essere sterili e la superficie dovrebbe essere abbastanza pulita per il rivestimento poli-D-lisina. </li><li> Aprire due piastre da 24 pozzetti dal loro imballaggio specifico, e metterli nella cappa. </li><li> Attiva la linea del vuoto nella cappa. Collegare un puntale 200 pl alla linea del vuoto, e utilizzare un SICsor per tagliare la punta per creare una maggiore apertura. </li><li> Utilizzare un fine-tip # 5 pinzetta per prendere vetrini dalla capsula di Petri, uno alla volta, e utilizzare la linea del vuoto per asciugare completamente il vetrino. Poi posto un coprioggetto in ciascuno dei pozzetti della piastra da 24 pozzetti. I 50 coprioggetti puliti dovrebbe essere sufficiente per riempire ciascun pozzetto delle due piastre da 24 pozzetti. </li><li> Diluire la soluzione madre poli-D-lisina (1 mg / ml) in soluzione di lavoro (0,1 mg / ml) con tampone borato (pH 8,5). Per i quattro piastre da 24 pozzetti (tra cui due piastre ad alta densità con fondo inciso), preparare 30 ml di soluzione di lavoro totale. </li><li> Aggiungere 300 microlitri soluzione lavoro 0,1 mg / ml di poli-D-lisina ad ogni pozzetto con vetrino. Assicurarsi che i coprioggetti sono completamente immersi in soluzione. In caso contrario, utilizzare la punta # 5 pinzetta a premere verso il basso vetrini contro il fondo del pozzo, e usare la punta per guidare soluzione poli-D-lisina per coprire tutta la superficie delle lamelle. Ispezionare visivamente tutti i coprioggetti per fare sure senza aria era intrappolata tra la piastra e lamelle. </li><li> Aggiungere 300 microlitri 0,1 mg / soluzione lavoro poli-D-lisina ml in ciascun pozzetto della piastra di coltura ad alta densità con fondo inciso. Ruotare a mano per diffondere la soluzione per coprire l&#39;intero fondo del pozzo. </li><li> Restituire tutti i quattro piatti con poli-D-lisina per l&#39;incubatore di cultura, e incubare O / N. </li></ol> 4. il lavaggio di piatti e di pre-condizionamento per la cultura Nota: Le seguenti operazioni (4-9) vengono eseguite il giorno della raccolta del tessuto. <ol><li> Dopo l&#39;incubazione / rivestimento di vetrini e piastre da 24 pozzetti O / N, portare tutti i quattro piastre (due con vetrini donatori, due piastre ad alta densità accettore con fondo in plastica inciso) nel cofano cultura. Utilizzare la linea del vuoto per rimuovere la soluzione di poli-D-lisina. </li><li> Subito dopo la rimozione della soluzione di poli-D-lisina, aggiungere ~ 1 ml di acqua sterile a ciascun pozzetto usando una pipetta di plastica trasferimento. Dopo che tutti i pozzetti vengono riempiticon acqua, lasciare riposare per 10 minuti. Rimuovere l&#39;acqua sotto vuoto, quindi aggiungere 300 microlitri medio lavaggio in ogni pozzetto per coprire il fondo del pozzo (con o senza vetrino). Non lasciate che il rivestimento poli-D-lisina asciugare. </li><li> Rientro tutte e quattro le piastre per l&#39;incubatore delle cellule. Le piastre sono pronte per l&#39;uso una volta che i neuroni dell&#39;ippocampo dispersi sono preparati. </li></ol> 5. Preparazione di Complete terreno di coltura, e tripsina soluzione per digestione enzimatica <ol><li> Preparare 60 ml di mezzo di coltura completo mescolando gli ingredienti (vedi Materiali). Utilizzare una siringa da 50 ml collegata con un filtro dimensioni della siringa 0,2 micron-pori, filtrare il mezzo di coltura completo in due provette da 50 ml coniche. Ogni tubo contiene 30 ml di terreno di coltura completo. </li><li> In un tubo da 50 ml a parte, aggiungere ~ 30 ml di lavaggio medio (vedi Materiali) e riscaldarlo fino a 37 ° C. Questo verrà utilizzato per lavare il tessuto dopo digestione enzimatica. </li><li> Preparare il mezzo di digestione enzimatica. In un 15 ml tubo conico, aggiungere 4,5 ml di mezzo di lavaggio e la soluzione di tripsina 0,5 ml 2,5%, e 50 ml 100X DNasi I. </li><li> Posizionare il mezzo di coltura completo, media Lavare e enzima media digestione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li></ol> 6. Preparazione di strumenti chirurgici <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in un sacchetto di sterilizzazione: due piccole forbici, un paio di pinze e due # 5 pinzette. </li></ol> 7. La rimozione dei cervelli da E16.5-E17.5 embrioni di topo, e la dissezione di Hippocampi <ol><li> Preparare due 10 cm petri piatti pieni di soluzione ghiacciata di Hank sterile salina bilanciata (HBSS). </li><li> Euthanize diga mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di fenobarbital sodio (100 mg / kg in un volume di ~ 0,5 ml). Dopo l&#39;iniezione, una volta che la diga perde risposta a pizzico punta, sacrificare con dislocazione cervicale. </li><li> Spruzzare zona addominale della diga con il 70% di etanolo, e fare una incisione lungo 2 cm lungo la linea mediana dell&#39;addome per esporrel&#39;utero. </li><li> Rimuovere gli embrioni e posizionare quelli individuali in 10 cm di diametro petri piatto con dissezione a freddo tampone HBSS. </li><li> Tenere l&#39;embrione per il collo con una pinza, e utilizzare una piccola forbice per fare la prima a destra taglio sulla linea mediana al di sotto del livello del cervelletto e la sezione attraverso il tessuto cerebrale. Non decapitare il dell&#39;embrione. <ol><li> Inserire la punta lato destro della piccola forbice da regione caudale che è tagliato aperto, tutto il percorso attraverso la parte rostrale del cervello embrionale (non farlo linea mediana croce), e fare un taglio sul lato sinistro a livello della base cranica. </li><li> Inserire di nuovo la punta forbice lato sinistro per fare un taglio sul lato destro. Lascia una stretta fascia di ossa del cranio non tagliato e tessuto cutaneo alla fine rostrale, in modo che l&#39;intero cervello può essere capovolto da parte per una facile estrazione. </li><li> Utilizzare la punta di forbice per scavare il cervello embrionale nella soluzione HBSS. Controllare il cervello sotto un microscopio da dissezione. Il cervello deve essere intatto, senza lordo cut-oregioni ff. </li><li> Ripetere questi passaggi per raccogliere tutti i cervelli embrione. </li></ol></li><li> Raccogliere tutti i cervelli intatti in un nuovo piatto di Petri contenente 20 ml di tampone HBSS freddo. Porre la capsula di Petri al microscopio dissezione. </li><li> Visualizza il cervello dal lato ventrale. Tenendo premuto il cervello con una pinza alla fine caudale, inserire un brusco # 5 pinzetta diagonale per fare un taglio tra il punto rostrale centrale e la regione caudale-temporale. Ripetere questa operazione per l&#39;altro emisfero. Dopo il taglio, separati due emisferi con ippocampo intatta dal resto dei tessuti del tronco cerebrale. <ol><li> Ripetere questo per ciascuno dei cervelli. </li></ol></li><li> Piscina tutto gli emisferi sezionati, e rimuovere le meningi con due paia di pinzette # 5. </li><li> Identificare l&#39;ippocampo sviluppare una struttura curva piegata all&#39;interno del lobo temporale. Alternate le due coppie di pinze per separare l&#39;ippocampo dalla adiacente tessuti corticali. Raccogliere e piscina tutto dell&#39;ippocampotessuto pi (vedi Figura 1). </li></ol> 8. digestione enzimatica, separato in singoli neuroni <ol><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, trasferire tutto il ippocampi sezionato nella soluzione digestione enzimatica contenente 5 ml di mezzo Lavare con 0,25% tripsina + 1X DNasi I in un tubo da 15 ml. </li><li> Mettere la provetta in un bagno di acqua e incubare a 37 ° C per 25 min, con intermittente invertente dolce del tubo una volta ogni 5 min. </li><li> Dopo 25 minuti, rimuovere con attenzione la soluzione enzimatica utilizzando una mano tesa pipetta di plastica per aspirazione. Aggiungere mezzo caldo Lavare a 10 ml e lavare delicatamente il tessuto lentamente invertendo il tubo di 5 volte. Rimuovere il supporto di lavaggio, e aggiungere di nuovo 10 ml di mezzo di lavaggio per un lavaggio supplementare. </li><li> Rimuovere il supporto di lavaggio, e aggiungere 3 ml di mezzo fresco caldo Lavare nuovamente. Agitare il tubo a mano rigorosamente per 15 volte per rimuovere i neuroni digeriti dal tessuto. Il mezzo dovrebbe diventare torbida volta che le cellule di unri separato dal tessuto nel mezzo di lavaggio. Raccogliere la sospensione cellulare in un nuovo tubo 15 ml conica, lasciando il tessuto rimanente nel tubo. </li><li> Aggiungere un altro mezzo 2 ml di lavaggio al tessuto, e separare delicatamente il tessuto rimanente triturando con una pipetta di plastica per ~ 15 volte. Lasciate riposare per 5 minuti. PISCINA La sospensione cellulare nel nuovo tubo da 15 ml conica che contiene raccolte le cellule &#39;Shake-off&#39;. </li><li> Contare la densità di neuroni con un emocitometro. Tipicamente, 3.000-5.000 cellule per microlitro possono essere ottenuti a seconda del numero di embrioni sezionati. Un numero medio di 2,5 x 10 7 neuroni sono stimati se ipotizzando sei embrioni vengono sezionati. </li><li> Calcolare il volume necessario di questa sospensione cellulare per produrre una densità di 250.000 neuroni / ml quando aggiunti al mezzo di coltura completo 30 ml. Aggiungere questo volume ad uno dei due tubi conici contenenti 30 ml di mezzo di coltura completo per fornire il mezzo neurone placcatura di alta densità. </li> &lt;li&gt; Trasferimento 1,2 ml di questa soluzione neurone ad alta densità per altri 30 ml di mezzo di coltura completo per ottenere una concentrazione di ~ 10.000 neuroni / ml. Utilizzare questa diluizione per seminare i coprioggetti a bassa densità. </li></ol> 9. placcatura di neuroni e lungo termine Co-cultura <ol><li> Portare le due piastre da 24 pozzetti con fondo inciso per neuroni alta densità nella cappa di coltura cellulare. Rimuovere il supporto di 300 microlitri precondizione per il vuoto. Piastra 0,6 ml sospensioni di cellule ad alta densità a 250.000 neuroni / ml. </li><li> Portare le altre due piastre da 24 pozzetti con vetrini nella cappa della cultura, e rimuovere il supporto di 300 microlitri precondizione per il vuoto. Piastra 0,6 ml sospensioni cellulari a bassa densità a 10.000 neuroni / ml sui vetrini all&#39;interno delle due piastre da 24 pozzetti. </li><li> Rientro tutte e quattro le piastre da 24 pozzetti per l&#39;incubatore. Lasciate riposare per 2 ore. </li><li> Capovolgere i coprioggetti a bassa densità con aderendo neuroni alla cultura alta densità. Assicurarsi che i neuroni sono una di fronte all&#39;altra (ad esempio, nOt separati dal vetrino di vetro). Per poi tornare le due piastre con co-coltura per l&#39;incubatore. </li></ol> 10. Co-cultura Sustaining <ol><li> Feed co-colture aggiungendo 300 pl medio Flux fresco (vedi Materiali) al giorno in vitro (DIV) 5. Non vi è alcuna necessità di rimuovere il 50% delle medie originale di coltura completo, come riportato da molti altri studi. Il mezzo di alimentazione contiene inoltre 15 pM citosina arabinoside (Ara-C, per ottenere una concentrazione finale di 5 mM) per minimizzare la possibilità di contaminazione glia e la proliferazione. </li><li> A seguito di questa alimentazione iniziale, aggiungere 300 ml di media carica fresca senza Ara-C per il bene ogni settimana. Se la coltura è mantenuta per più di un mese, sostituire la metà del mezzo con il mezzo Flux fresco ogni settimana oltre un punto volta al mese (con la prima metà di sostituzione medio a DIV33). Morfologicamente, sia ad alta densità e bassa densità di neuroni aspetto sano fino a tre mesi (il più lungo tempo osservato dalla experimenters). </li></ol> 11. Illustrazione di un Sperimentale Manipolazione a bassa densità Neuron Trasfezione Nota: Quando transfezione in neuroni bassa densità è desiderato, un semplice protocollo di fosfato di calcio può essere adottato. Abbiamo scoperto che le culture a bassa densità hanno una migliore efficienza di trasfezione con protocollo fosfato di calcio prima DIV12, ma possono essere transfettate con molto più bassa efficienza a DIV21 o più, durante i quali spine dendritiche sono prominenti. La fattibilità di trasfezione della coltura neurone bassa densità è illustrato dalla trasfezione neuroni con un plasmide pEGFP-C3 (vedi sotto). <ol><li> A DIV21, togliere 600 ml mezzo condizionato da ciascun pozzetto della co-coltura, e trasferirlo ad un nuovo 24-pozzetti. Quindi aggiungere 600 ml mezzo fresco di avanzamento per la co-coltura per riportarlo al volume originale. <ol><li> Trasferire i vetrini nel nuovo 24-pozzetti con 600 microlitri mezzo condizionato. Assicurarsi che laneuroni a bassa densità sono rivolti verso l&#39;alto. Posizionare le piastre ad alta densità ei nuovi piatti con lamelle posteriori nell&#39;incubatrice. </li></ol></li><li> Preparare due provette da 1,5 ml sterili. In un tubo, aggiungere 600 ml 2X tamponata con HEPES soluzione salina (HBS). Calcolare il volume di 12 mcg pEGFP-C3 DNA basato sulla concentrazione plasmide. In l&#39;altro tubo, aggiungere 74 ml CaCl 2 (2 m stock) e il volume di acqua che dopo l&#39;aggiunta plasmide farà 600 microlitri. Mescolare bene pipettando e quindi aggiungere DNA plasmidico. Lentamente mescolare bene. Lasciate che entrambi i tubi riposare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mentre mano che tiene il tubo 2X HBS e moderatamente agitando la soluzione su un mixer, aggiungere tutti i 600 microlitri della soluzione goccia DNA-CaCl 2 goccia a 600 microlitri tubo 2X HBS. È fondamentale che il precipitato formatosi è in forma di granuli &#39;sabbia fine. Mescolando troppo forte e troppo in fretta non è auspicabile, dal momento che sarà più probabile produrre grandi &#39;precipitati flake&#39;-come la neve, which ha notevolmente più bassa efficienza di trasfezione in base alle nostre osservazioni. </li><li> Sia il precipitato continuano a formarsi al buio a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 100 microlitri precipitato a ciascun pozzetto contenente neurone bassa densità sulle coprioggetto, goccia a goccia ed uniformemente. Riportare la piastra per incubatore e incubare per 2 ore. Supponendo che la maggior parte del CaCl 2 è in forma libera, questo si traduce in una concentrazione di ~ 17,6 mM Ca 2+, che può essere tossico per i neuroni seguenti incubazione prolungata. </li><li> Preparare una provetta da 50 ml con il mezzo ~ 50 ml di lavaggio, scaldare a 37 ° C. </li><li> Alla fine di 2 h, portare il neurone bassa densità con fosfato di DNA-calcio precipitati nella cappa. Pick up ogni singolo vetrino con un forte # 5 pinzetta, e immergerlo tre volte nel medio Wash 50 ml di lavarlo brevemente. Poi restituirlo ai neuroni ad alta densità nelle sue tavole originali co-coltura, con i neuroni a bassa densità rivolto verso il basso. </li><li> Continuare fino a quando la culturai neuroni cultura bassa densità su vetrini sono raccolte per gli studi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la cultura a lungo termine di ultra-bassa densità di neuroni dell&#39;ippocampo glutamatergici in condizioni di libero siero. A ~ 2000 neuroni / cm 2, la densità è almeno due volte inferiore rispetto maggior parte dei preparati &#39;basse densita&#39; di cultura, con o senza il supporto glia riportato dalla letteratura esistente 2,3,11,13,14. Oltre ad essere ultra-bassa densità, questo protocollo è nuovo e significativo altri due modi. In primo luogo, no...

Crescita neuroni ippocampali in condizioni in vitro consente osservazione e manipolazione sperimentale di questi neuroni che altrimenti non sarebbero possibili in vivo. Questo approccio sperimentale è ampiamente usato per rivelare i meccanismi neuronali della crescita, della polarità, le specifiche dei neuriti, il traffico e localizzazione subcellulare delle proteine, formazione di sinapsi e la maturazione funzionale 1. Questi in vitro in coltura neuroni dell&#39;ippocampo, quando raccolto dalle fasi tardo embrionali, sono relativamente puro (&gt; 90%), le cellule glutamatergiche della morfologia piramidale 2. Poiché i neuroni sono stati coltivati ​​in una superficie 2-D in condizioni in vitro, questo metodo permette una facile osservazione, come ad esempio l&#39;imaging dal vivo o immunocitochimica (ICC) colorazione attraverso un unico piano focale 3; o manipolazioni, come ad esempio il trattamento farmacologico e trasfezioni 3-6. Quando coltivate ad alta densità, i neuroni tendono ad avere alti tassi di sopravvivenza a causa di una maggiore cooperazionencentrations di fattori di crescita secreti in aggiunta al supporto alimentare da parte dei media di crescita, e anche a causa di neuriti meccanismi di contatto-dipendente 7. Tuttavia, a bassa densità neuroni dell&#39;ippocampo sono desiderabili per gli studi morfologici, in cui un singolo neurone può essere ripreso nella sua interezza o tinto per l&#39;analisi ICC. I neuroni a bassa densità sono difficili da mantenere in cultura a causa della mancanza di sostegno paracrino e quindi spesso richiedono il supporto trofico da un gliale (tipicamente corticale astrociti) feeder layer, che deve essere preparato prima la cultura neurone 2. Quando co-coltura con uno strato alimentatore cellule gliali, neuroni bassa densità sono coltivate su vetrini e quindi capovolto sopra dello strato glia in modo che i neuroni e glia bassa densità di fronte all&#39;altra. Un piccolo spazio chiuso tra glia e neuroni viene creato inserendo punti paraffina sugli angoli dei vetrini, creando così un &#39;sandwich&#39; di layout 2,8,9. I neuroni a bassa densità cresceranno well&#39;ambito lo spazio confinato tra glia e il vetrino, che crea un microambiente permissivo con fattori concentrati secreti dai neuroni e glia. Questo approccio produce a bassa densità, i neuroni completamente sviluppati che sono distanziati ragionevolmente a parte, quindi, facilitando l&#39;etichettatura ICC o studi di imaging dal vivo. Un inconveniente apparente di neuroni-glia co-coltura, oltre ad essere in termini di tempo e laborioso, è che impedisce lo studio di specifici neuroni, o cellule autonome, meccanismi. Anche se questo sistema è molto meno complessa di in vivo tessuto neurale, impatto glia sullo sviluppo neuronale attraverso secrete, fattori non ancora completamente definiti possono confondere gli esperimenti 10. Pertanto, in esperimenti che richiedono l&#39;indagine dei meccanismi specifici di neuroni, condizioni di coltura definite che rimuovono siero e strato di supporto gliali sono necessari. Un precedente studio è riuscito a coltura basse concentrazioni di neuroni (~ 9.000 cellule / cm 2) utilizzando un esimoree matrice idrogel dimensionale 11. Dal momento che una popolazione neuronale relativamente pura può essere coltivato ad alta densità in condizioni di libero siero senza supporto gliali, ipotizziamo che ultra-bassa densità di neuroni dell&#39;ippocampo può essere coltivata nel siero libera definito terreno di coltura da loro co-coltura con i neuroni ad alta densità, in un modo che è analogo al neurone-glia co-coltura convenzionale adottato. In effetti, ad alta densità di ippocampo culture di neuroni in una configurazione a &#39;sandwich&#39; sono stati recentemente utilizzati per sostenere un piccolo numero di neuroni endocrini magnocellulari specializzati 12. Pertanto, la co-coltura con neuroni alta densità possono consentire neuroni bassa densità di ricevere trofico supporto fattori che è sufficiente a consentire la sopravvivenza a lungo termine. Questo protocollo di neuroni ultra-bassa densità di coltura è stata quindi formulata e convalidato. Il protocollo può essere implementato all&#39;interno di un singolo esperimento, preparando ad alta densità (~ 250.000 cellule / ml) DISciato neuroni dell&#39;ippocampo, e poi facendo una diluizione per produrre una densità di ~ 10.000 neuroni / mL (~ 3.000 neuroni / vetrino, o ~ 2.000 neuroni / cm 2), che è molto più basso rispetto alla maggior parte riferito culture a bassa densità 2,3,9 , 11,13. Questa condizione cultura è genericamente indicato come la cultura &#39;ultra-bassa densita&#39; e utilizzato con &#39;bassa densità&#39; inter-changeably. I neuroni ad alta densità sono placcati in poli-D-lisina rivestite piastre da 24 pozzetti; mentre i neuroni a bassa densità vengono seminate su vetrini da 12 mm rivestite poli-D-lisina che vengono inseriti all&#39;interno di un altro 24-pozzetti. I vetrini con aderendo neuroni a bassa densità sono capovolte sulla parte superiore dei neuroni ad alta densità di 2 ore più tardi, dopo i neuroni sono discesi e attaccati alle lamelle. Inoltre, invece di utilizzare punti paraffina per elevare i coprioggetti sopra lo strato neurone alta densità, un ago di siringa 18 G è stato usato per incidere il fondo delle piastre da 24 pozzetti con due strisce parallele. La risultante displACED, adiacenti plastiche forniscono un supporto elevato per i coprioggetti di vetro. Questo spazio è costantemente misurato a 150-200 micron, che permette lo scambio di ossigeno e terreno di coltura sufficiente mentre fornisce un microambiente con fattori trofici concentrati. In questa condizione, i neuroni a bassa densità crescere molto, e possono sopravvivere oltre tre mesi in coltura. Quando questi neuroni sono trasfettate con GFP plasmide dopo tre settimane di cultura, i dendriti sono abbondantemente costellate di spine dendritiche. Come prova di principio, i dati vengono presentati per dimostrare che questo sistema di co-coltura supporta culture ultra-bassa densità di neuroni dell&#39;ippocampo seminate su poli-D-lisina &#39;micro-isole&#39;, in cui i neuroni si formano le connessioni autaptic che possono facilitare indagini di cellula , meccanismi indipendenti dalla rete -autonomous.

<table><tbody><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>integratore di B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>aliquota, conservare nel formato da 0,6 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>diluito 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>antibiotico-antimicotico (AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td><td>diluito 100X&nbsp;</td></tr><tr>Terreno <td></td><td></td><td>di coltura completo</td><td>Terreno neurobasale con 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td><td>di lavaggio uguale al 'Terreno neurobasale'Terreno</td></tr> <tr><td>di alimentazione</td><td></td><td></td><td>Neurobasale con 1X integratore di B27</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>preparare 100X stock a 0,6 mg/ml</td></tr><tr><td>di poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>M.W. 70000-150000</td></tr><tr><td>tampone borato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768 (acido borico); 71997 (borace)</td> <td>1,24 g di acido borico e 1,9 g di borace in 400 ml di H2O, pH fino a 8,5 utilizzare</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti rotondi in vetro HCl da 12 mm</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>No. 1 vetro, acquistare da Carolina Biological Supply</td></tr><tr><td>proFection kit di trasfezione</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>vedere il protocollo per i dettagli</td></tr><tr><td>2X HEPES tamponed saline (HBS)</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>vedere il protocollo per i dettagli</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>0,2um dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Kit di preparazione del plasmide endolibero</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>per la preparazione del plasmide di grado di trasfezione DNA</td></tr><tr><td>anti-MAP2 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td>anticorpo di topo, clone AP20</td></tr><tr><td>anti-p-Tau anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB10417</td><td>anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>anticorpo anti-NR1</td><td>Millipore</td><td>MAB1586</td><td>anticorpo di topo, clone R1JHL</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GluR1 Anticorpo</td><td>policlonale di coniglio</td><td>Millipore</td><td>AB1504</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>formato da 500 ml</td></tr></tbody></table>

un metodo semplificato per ultra-low density, long-term primaria ippocampale neuron cultura

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

La coltura neuroni dell&#39;ippocampo primari in vitro facilita interrogatori meccanicistica di molti aspetti dello sviluppo neuronale. Dissociati neuroni dell&#39;ippocampo embrionali possono spesso crescere con successo su vetrini ad alta densità in condizioni di libero-siero, ma le culture a bassa densità in genere richiedono una fornitura di fattori trofici da loro co-coltura con uno strato alimentatore glia, preparazione che può richiedere molto tempo e laborioso. Inoltre, la presenza di cellule gliali può confondere l&#39;interpretazione dei risultati e degli studi ostino sui meccanismi specifici neuroni. Qui, un metodo semplificato è presentato per ultra-bassa densità (~ 2.000 neuroni / cm 2), a lungo termine (&gt; 3 mesi) cultura neurone dell&#39;ippocampo primaria che è in condizioni di libero siero e senza supporto di cellule gliali. neuroni a bassa densità sono coltivate su vetrini rivestiti di poli-D-lisina, e capovolte sui neuroni ad alta densità coltivate in una piastra da 24 pozzetti. Invece di utilizzare punti paraffina per creare uno spazio between i due strati neuronali, gli sperimentatori possono semplicemente incidere il fondo in plastica del pozzo, in cui i neuroni alta densità risiedono, per creare un microspazio favorevole alla crescita neurone bassa densità. Il co-coltura può essere facilmente mantenuta per&gt; 3 mesi senza significativa perdita di neuroni bassa densità, facilitando così lo studio morfologico e fisiologico di questi neuroni. Per illustrare questa condizione culturale di successo, i dati vengono forniti per mostrare la formazione di sinapsi profusa nelle celle a bassa densità dopo la cultura prolungato. Questo sistema di co-coltura facilita anche la sopravvivenza dei neuroni individuali sparse coltivate in isole di substrati poli-D-lisina e quindi la formazione di connessioni autaptic.

Il protocollo qui descritto consente successo densità ultra-bassa, coltura a lungo termine di neuroni glutamatergici puri senza la necessità di cellule gliali che servono come strato alimentatore. Il protocollo è diagramed in Figura 1, che prevede la preparazione di alta densità (su poli-D-lisina rivestite 24 pozzetti) e neuroni bassa densità (su poli-D-lisina vetrini rivestiti) separatamente, e successiva co-coltura che possono essere mantenuta fino a tre mesi. <p c...

Le colture a bassa densità di neuroni primari dell'ippocampo di solito richiedono uno strato di alimentazione della glia per fornire fattori neurotrofici e sostenere la longevità. Descriviamo qui un metodo semplificato per coltivare neuroni a bassissima densità su vetrini coprioggetti in presenza di uno strato di alimentazione neuronale ad alta densità, che facilita lo studio di specifici meccanismi neuronali-autonomi.

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire colture sane a lungo termine di neuroni ippocampali primari di topo a densità estremamente bassa, al fine di facilitare l'etichettatura mediante immunocitochimica e lo studio dei meccanismi autonomi delle cellule neuronali. Questo studio può contribuire a comprendere alcune domande fondamentali nel campo della ricerca neuroscientifica, come ad esempio gli studi sulla specificità delle proteine nella neuromorfologia della funzione dello sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai neuroni di crescere a densità estremamente bassa su un coverslip senza il supporto di uno strato di cellule gliali di supporto.La procedura sarà dimostrata da Mariel Piechowicz, una studentessa del mio laboratorio. Preparare due piastre a 24 pozzetti ad alta densità e due a bassa densità. Utilizzando un ago da 28 gauge, inciderete il fondo delle piastre a 24 pozzetti, in modo che le plastiche spostate fungano da supporto per i coverslip su cui crescono i neuroni a bassa densità.Trasferire i vetrini sterili nelle due piastre da 24 pozzetti destinate alle colture a bassa densità. Rivestire tutte e quattro le piastre con 300 microlitri di poli-D-lisina 0,1 milligrammo per millilitro diluita in tampone borato e riposizionarle nell'incubatore per un rivestimento notturno. Prima del prelievo del tessuto, preparare due piastre di Petri da 10 centimetri riempite con HBSS sterile freddo di ghiaccio.Sotto il microscopio, trattenere l'embrione per il collo con la pinzetta e praticare il primo taglio esattamente sulla linea mediana, al di sotto del livello del cervelletto. Successivamente, effettuare un taglio sul lato sinistro della base del cranio. Poi, eseguire un altro taglio sul lato destro della base del cranio.Lasciare una piccola parte dell'osso cranico e del tessuto cutaneo all'estremità rostrale non tagliata, in modo che l'intero cervello possa essere facilmente spostato di lato per l'estrazione. Ora trasferire il cervello nella soluzione HBSS. Esaminare il cervello per accertarsi che sia integro e privo di aree visibilmente recise.Quindi, ripetere le procedure per raccogliere i restanti cervelli degli embrioni in una nuova piastra di Petri contenente 20 millilitri di tampone HBSS freddo. Posizionare ogni cervello con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Tenendo fermo il cervello con una pinzetta all'estremit&agrave; caudale, effettuare un taglio diagonale tra il punto rostrale medio e la regione temporale caudale utilizzando una pinzetta affilata.Ripetere questa operazione per l'altro emisfero. Successivamente, separare i due emisferi con l'ippocampo intatto dal resto dei tessuti del tronco encefalico. Ripetere le procedure per tutti i cervelli e raccogliere insieme tutti gli emisferi dissecati.Quindi, rimuovere le meningi utilizzando due paia di pinzette. Identificare l'ippocampo in via di sviluppo come una struttura curva ripiegata all'interno del lobo temporale e separarla dai tessuti corticali adiacenti. Raccogliere e raggruppare tutti i tessuti degli ippocampi.In questo procedimento, trasferire tutti gli ippocampi dissecati nella soluzione di digestione enzimatica in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, posizionare il tubo in un bagno termico e incubare a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Dopo 25 minuti, rimuovere con attenzione la soluzione enzimatica.Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo di lavaggio tiepido per portare il volume totale a 10 millilitri. Lavare delicatamente il tessuto capovolgendo lentamente il tubo cinque volte. Rimuovere il mezzo di lavaggio e aggiungere nuovamente 10 millilitri di mezzo di lavaggio, per un ulteriore lavaggio.In seguito, rimuovere il mezzo di lavaggio e aggiungere nuovamente tre millilitri di mezzo di lavaggio fresco e caldo. Agitare vigorosamente il tubo a mano per 15 volte per staccare i neuroni digeriti dal tessuto. Il mezzo dovrà diventare torbido una volta che le cellule si saranno separate dal tessuto e saranno passate nel mezzo di lavaggio.Quindi, raccogliere la sospensione cellulare in un nuovo tubo conico da 15 millilitri, lasciando il tessuto rimanente nel tubo. Successivamente, aggiungere altri due millilitri di mezzo di lavaggio al tessuto e separare delicatamente il tessuto rimanente mediante pipettaggio con una pipetta di plastica per 15 volte. Lasciare riposare la sospensione cellulare per cinque minuti prima di raccoglierla in un nuovo tubo conico da 15 millilitri contenente le cellule ottenute dal lavaggio.Quindi, contare la densità dei neuroni utilizzando un emocitometro. Calcolare il volume della sospensione cellulare necessario per ottenere una densità di 250.000 neuroni per millilitro e aggiungerlo a uno dei due tubi conici contenenti 30 millilitri di mezzo di coltura completo, al fine di ottenere un mezzo per la semina di neuroni ad alta densità. Trasferire 1,2 millilitri di questa soluzione di neuroni ad alta densità in altri 30 millilitri di mezzo di coltura completo, per ottenere una concentrazione di 10.000 neuroni per millilitro, e utilizzare questa soluzione per seminare i coverslip a bassa densità.In questo procedimento, posizionare le piastre a 24 pozzetti con fondo inciso per neuroni ad alta densità nell'incubatore per colture. Rimuovere 300 microlitri di mezzo precondizionato mediante aspirazione, quindi seminare 0,6 millilitri di sospensione cellulare ad alta densità a 250.000 neuroni per millilitro. Posizionare le altre due piastre a 24 pozzetti con coprivetri nell'incubatore per colture.Rimuovere 300 microlitri del mezzo precondizionato mediante aspirazione, prima di piastrare 0,6 millilitri di sospensione cellulare a bassa densità a 10.000 neuroni per millilitro sui coverslip. Successivamente, riposizionare tutte e quattro le piastre a 24 pozzetti nell'incubatrice e incubare per due ore. Dopo questo periodo, capovolgere i coverslip a bassa densità con i neuroni aderenti sulla coltura ad alta densità e assicurarsi che i neuroni siano rivolti l'uno verso l'altro.Successivamente, reinserire le due piastre con la co-coltura nell'incubatore. Alimentare le co-colture aggiungendo 300 microlitri di mezzo di coltura fresco al DIV cinque. Dopo questo primo cambio di mezzo, aggiungere ogni settimana 300 microlitri di mezzo di coltura fresco senza arabinoside citosina a ogni pozzetto.Se la coltura deve essere mantenuta per più di un mese, sostituire metà del mezzo con mezzo fresco ogni settimana a partire dal punto temporale di un mese. Morfologicamente, sia i neuroni ad alta densità che quelli a bassa densità dovrebbero apparire sani fino a tre mesi. Qui, l'etichettatura mediante immunocitochimica viene utilizzata per rivelare le sinapsi glutammatergiche funzionali in cui la subunità del recettore NMDA NR1 e la subunità del recettore ApoE GluR1 sono marcate con doppia colorazione.E le sinapsi funzionali possono essere facilmente identificate e quantificate utilizzando ImageJ. I neuroni a bassa densità vengono inoltre marcati con un anticorpo contro il marcatore proteico dendritico MAP2 in combinazione con il marcatore proteico assonale p-Tau. Questa doppia marcatura permette una chiara distinzione tra dendriti e assoni. Le colture a bassa densità possono anche essere trasfettate con successo mediante plasmidi di DNA utilizzando metodi al fosfato di calcio, anche se il tasso di trasfezione è tipicamente molto basso negli stadi successivi.Questa figura illustra che la trasfezione con EGFP può rivelare la morfologia neuronale e rendere visibili le fini strutture delle spine dendritiche. Infine, a titolo dimostrativo, è possibile coltivare neuroni a densità ultra-bassa in condizioni che favoriscono la formazione di autapsi. Questi neuroni autapsici a densità ultra-bassa, coltivati su microisole rivestite con poli-D-lisina, possono essere mantenuti oltre due mesi mediante questo protocollo di co-coltura grazie ai neuroni di supporto a densità elevata.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore nel giorno della coltura cellulare, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale rivestire le lamelle di vetro e i fondi delle piastre a 24 pozzetti con poli-D-lisina. Una semplice mordenzatura dei fondi delle piastre è sufficiente per fornire un supporto meccanico e nutrizionale ai neuroni ippocampali a bassa densità affinché crescano sulle lamelle.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare neuroni ippocampali primari di embrione di topo a densità estremamente bassa, in assenza di uno strato di cellule gliali di supporto. Sperabilmente potrai utilizzare questo metodo per i tuoi scopi sperimentali.

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