Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo Xenopus Kidney
May 3rd, 2016
Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare mappe del destino e traccianti di lignaggio per indirizzare le iniezioni nei singoli blastomeri che danno origine al rene degli embrioni di Xenopus laevis.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare le microiniezioni al rene xenopus in via di sviluppo. Questo metodo può aiutare ad affrontare domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio come si forma il rene e quali geni sono importanti per questo processo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che massimizza la consegna di reagenti microiniettati a un tessuto mirato.
La visualizzazione di questo metodo è importante perché l'identificazione del blastomero corretto per la microiniezione mirata è fondamentale. Per iniziare questa procedura, entrambi i testicoli sono stati isolati da una singola rana maschio e posti in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita con 10 millilitri di soluzione per la conservazione dei testicoli. Quindi conservare i testicoli a quattro gradi Celsius.
Successivamente, le uova sono state raccolte da una rana femmina in una capsula di Petri da 100 millimetri. Versare l'acqua in eccesso dalla capsula di Petri. Dopodiché, tagliare un quarto di testicolo nella soluzione di archiviazione dei testicoli.
Trasferire il pezzo di testicolo nella capsula di Petri contenente le uova. Successivamente, tagliare la parte del testicolo in piccoli pezzi. Aggiungi MMR e gentamicina alla capsula di Petri per coprire le uova.
Mescolateli facendo roteare il piatto e poi aspettate circa 30 minuti affinché la concimazione avvenga a temperatura ambiente. Dopo la fecondazione, il lato pigmentato degli embrioni dovrebbe essere rivolto verso l'alto. Rimuovere l'MMR dalla capsula di Petri utilizzando una pipetta di trasferimento e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di de-gelatina per coprire gli embrioni.
Successivamente, fai roteare il piatto nei minuti successivi per sciogliere il rivestimento gelatinoso sugli embrioni. Una volta che gli embrioni si toccano strettamente al centro del piatto, il rivestimento gelatinoso è stato rimosso. Rimuovere la soluzione di de-jelly con una pipetta di trasferimento.
Successivamente, lavare gli embrioni degelatinati da 3 a 5 volte in MMR più gentamicina versando accuratamente l'MMR e riempiendo il piatto con nuovo MMR. Non rimuovere tutto l'MMR dal piatto, che potrebbe danneggiare gli embrioni. Successivamente, rimuovi eventuali uova non fecondate o pezzi di testicoli dalla capsula di Petri.
Per scaglionare il loro sviluppo, metti metà degli embrioni di una singola fecondazione in una capsula di Petri mantenuta a 14 gradi Celsius e l'altra metà degli embrioni in una capsula di Petri mantenuta a 18 gradi Celsius. Gli embrioni si svilupperanno più lentamente a 14 gradi Celsius che a 18 gradi Celsius. Consente più serie di iniezioni da un'unica frizione fecondata.
Preparare la soluzione iniettabile contenente il punto zero di un nanogrammo per nanolitro di mRNA della proteina fluorescente rossa legata alla membrana. Mentre gli embrioni si stanno sviluppando fino allo stadio di 4 o 8 cellule. Tenere la soluzione iniettabile con ghiaccio fino al momento dell'uso.
Quindi, caricare un tubo capillare di vetro di ricambio da sette pollici in un estrattore per aghi con la parte superiore del tubo di ricambio allineata con la parte superiore della custodia dell'estrattore per ago. Impostare il valore del calore numero due su 800 e il valore di trazione su 650 e premere il pulsante di trazione per tirare l'ago. Dopodiché, taglia la punta dell'ago estratto con un paio di pinze Dumont.
Infilare la pinza della micropipetta sul retro dell'ago. Quindi, infilare l'O-ring a foro grande sul retro dell'ago dietro la pinza. Ora, riempi l'ago con olio minerale usando un ago iperdermico calibro 27, facendo attenzione a non far entrare bolle d'aria nell'ago.
Infilare l'ago sullo stantuffo del microiniettore, inserendo l'ago nel foro grande del distanziatore di plastica bianca installato sullo stantuffo. Fissare l'ago stringendo la pinza. Quindi, tenere premuto il pulsante "Vuoto" sulla scatola di controllo del microiniettore fino a quando non vengono emessi due segnali acustici.
Successivamente, pipettare tre microlitri di soluzione iniettabile su un pezzo di parafilm. Quindi, inserire la punta dell'ago nel cordone di soluzione iniettabile sul parafilm. Tenere premuto il pulsante Fill" sulla scatola di controllo del microiniettore per aspirare la soluzione di iniezione nell'ago.
Prima della microiniezione, è importante comprendere le prime divisioni cellulari dell'embrione di xenopus. L'embrione unicellulare ha un polo animale pigmentato scuro e un polo vegetale bianco e yoky. Nell'embrione a due cellule la prima scissione si verifica tipicamente tra i lati sinistro e destro dell'embrione.
Queste cellule contribuiscono in egual misura al lignaggio pronefrico. La seconda scissione divide le metà dorsale e ventrale dell'embrione portando a un embrione a 4 cellule. Le cellule dorsali sono più piccole e hanno meno pigmento rispetto alle cellule ventrali.
Se si inietta in un embrione a 4 cellule, iniettare il blastomero ventrale sinistro per colpire il rene sinistro. La terza scissione divide in due i lati animale e vegetale. Il risultato è un embrione di 8 cellule.
A questo punto ci sono quattro blastomeri animali e quattro blastomeri vegetali. Per colpire il rene sinistro di un embrione di 8 cellule, iniettare nel blastomero vegetale ventrale sinistro. Successivamente, riempire una capsula di Petri da 60 millimetri rivestita con una rete di poliestere da 500 micron con il cinque percento di fycol in MMR più gentamicina.
Pipettare con cura da 20 a 30 embrioni a 8 cellule nella piastra. Usando un cappio di capelli, manipolare gli embrioni in modo che il blastomero da iniettare sia rivolto verso l'ago. Per colpire il rene sinistro, allinea gli embrioni in modo che i blastomeri vegetali ventrali sinistro degli embrioni a 8 cellule siano rivolti verso l'ago.
Iniettare 10 nanolitri di soluzione iniettabile nel blastomero selezionato di ciascun embrione nella capsula. Quindi, trasferire gli embrioni iniettati nei pozzetti di una piastra di coltura con il cinque percento di fycol in MMR più gentamicina. Incubare gli embrioni iniettati a 16 gradi Celsius per circa una o due ore per consentire ai blastomeri iniettati di guarire.
Successivamente, trasferire gli embrioni microiniettati in nuovi pozzetti nella piastra di coltura riempita con MMR più gentamicina. Incubare gli embrioni a una temperatura compresa tra 14 e 22 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio 38-40. In questa procedura, trasferire da 10 a 20 embrioni di stadio da 38 a 40 in una fiala di vetro.
Aggiungere 10 microlitri di benzocaina al cinque percento in etanolo al 100 percento alla fiala. Mescolare capovolgendo la fiala e attendere 10 minuti per anestetizzare gli embrioni. Quindi, rimuovi l'MMR dalla fiala e riempila con MEMFA.
Quindi, posizionalo su una piattaforma a dondolo tridimensionale per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, rimuovere MEMFA dal flaconcino e riempirlo con metanolo al 100%. Quindi, posizionare la fiala su una piattaforma a dondolo tridimensionale per dieci minuti a temperatura ambiente.
Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta e conservare gli embrioni in metanolo al 100% durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Gli embrioni sono ora fissati e pronti per l'immunocolorazione. Questo schema mostra quale blastomero iniettare per il targeting del pronephros sinistro degli embrioni di xenopus allo stadio di 8 cellule utilizzando l'mRNA della proteina fluorescente rossa legata alla membrana come tracciante.
La localizzazione del tracciante dopo l'iniezione nel blastomero vegetale ventrale sinistro è mostrata in rosso, mentre il rene è etichettato in verde. Questa immagine mostra che il rene è stato colorato di verde con gli anticorpi 3G8 e 4A6. Ecco una vista ravvicinata della regione renale che mostra la loacalizzazione del tracciante e qui c'è l'immagine unita che mostra la co-localizzazione del tracciante con il rene.
Qui è mostrata l'immagine confocale del rene di un secondo embrione colorato con 3G8 e 4A6. Questa è la localizzazione del tracciante rosso nel rene e nel tessuto circostante e questa è l'immagine unita che mostra la co-localizzazione del tracciante 3G8 e 4A6 nel rene. Prima di eseguire questa procedura è importante familiarizzare con l'embrione precoce di xenopus.
Ciò ti consentirà di indirizzare correttamente le microiniezioni attraverso la mappa di dissolvenza xenopus stabilita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere adattata per colpire altri tessuti come il tubo neurale o il cuore.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per il targeting di microiniezioni in singoli blastomeri che si sviluppano nel rene di embrioni di Xenopus laevis. Mira a migliorare la nostra comprensione della formazione del rene e dei geni coinvolti in questo processo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
- Analisi della funzione genica
Sfondo
- Comprendere lo sviluppo del rene è cruciale nella biologia dello sviluppo.
- Le tecniche di microiniezione consentono una consegna precisa dei reagenti.
- Identificare il blastomero corretto è essenziale per iniezioni di successo.
- Questo metodo può aiutare a chiarire i ruoli dei geni nell'organogenesi.
Obiettivo dello studio
- Investigare la formazione del rene in Xenopus laevis.
- Identificare geni importanti coinvolti nello sviluppo del rene.
- Migliorare le tecniche di microiniezione mirata negli embrioni.
Metodi utilizzati
- Isolamento dei testicoli da una rana maschio.
- Preparazione della soluzione di conservazione dei testicoli.
- Conservazione dei testicoli a basse temperature.
- Tecniche di visualizzazione per identificare i blastomeri.
Risultati principali
- Targeting di successo delle microiniezioni verso blastomeri specifici.
- Comprensione migliorata dei processi di sviluppo del rene.
- Identificazione di geni chiave che influenzano la formazione del rene.
- Metodologia migliorata per futuri studi di biologia dello sviluppo.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per studiare lo sviluppo del rene.
- Le microiniezioni mirate possono fornire significative intuizioni sulla funzione genica.
- La ricerca futura può basarsi su questi risultati per esplorare l'organogenesi.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Targeted microinjection in Xenopus embryos enables precise spatial control of gene expression, reducing off-target effects and improving mechanistic clarity in developmental studies. This approach supports target validation by linking specific genes to organogenesis pathways, such as pronephros formation, with minimal systemic perturbation. The method enhances predictive confidence in early discovery by isolating gene function within defined tissue contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by overexpressing or knocking down genes in specific blastomeres that contribute to the pronephros.
- Operational Value: Reduces secondary effects in non-target tissues, increasing signal-to-noise ratio in phenotypic readouts.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in kidney development through spatially restricted manipulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems with lineage-traced cells for downstream analysis of pronephric contribution.
- Operational Value: Uses whole-mount immunostaining at stage 38–40 to quantitatively assess targeted cell integration into the pronephros.
- Reproducibility: Relies on established fate maps and blastomere targeting consistency across 4- and 8-cell embryos.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: The Xenopus pronephros serves as a disease-relevant system for modeling conserved vertebrate kidney development mechanisms.
- Mechanistic Continuity: Enables progression from gene function discovery in embryos to pathway analysis in preclinical models.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by validating target engagement in a developing organ system prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within early discovery workflows, connecting blastomere-specific gene modulation to phenotypic assessment in developing tissues, and informing target selection for further validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by restricting gene manipulation to pronephros-lineage blastomeres, clarifying pathway involvement in organogenesis.
- Assay Readiness: Produces embryos with verified tracer localization, enabling standardized immunostaining and imaging for quantitative pronephros analysis.
- Analytics: Facilitates comparison of pronephric structure and tracer co-localization to evaluate gene function impact on kidney development.
- Translational Research: Links embryonic pronephros findings to conserved mechanisms applicable in mammalian kidney disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other tissues (e.g., neural tube, heart) using the same fate map-guided microinjection framework.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation precision by minimizing confounding effects from widespread gene modulation.
- Operational Value: Enables reproducible, scalable microinjection into defined blastomeres using standardized preparation and incubation steps.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by providing clearer genotype-phenotype links in a developing organ system.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk through early mechanistic de-risking of kidney-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Xenopus embryo handling, blastomere identification, and microinjection techniques.
- Dependent on functional injection equipment, including needle pullers, microinjectors, and temperature-controlled incubation systems.
- Necessitates standardized protocols for embryo staging, fixation, and immunostaining to ensure cross-experiment consistency.
- Adaptation to other tissues relies on accurate fate maps and blastomere targeting accuracy.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to temperature shifts and injection trauma.
