Name: Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo Xenopus Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Impara la tecnica di microiniezione mirata per lo studio dello sviluppo renale in Xenopus laevis. Questo metodo consente di indagare la formazione del rene e identificare i geni coinvolti nel processo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un National Institutes of Health NIDDK concessione (K01DK092320) e il finanziamento di avvio del Dipartimento di Pediatria presso l&#39;Università del Texas Medical School McGovern.

Il seguente protocollo è stato approvato dalla University of Texas Health Science Center presso il Centro di Houston per animali da laboratorio Animal Medicine Comitato Welfare, che serve come cura e del Comitato Istituzionale Usa (protocollo #: HSC-AWC-13-135). 1. Identificazione e selezione dei blastomeri per iniezioni renali mirati <ol><li> Prima di generare embrioni, utilizzare la tabella Normale di Xenopus Sviluppo 21 per capire l&#39;orientamento delle divisioni cellulari primi nell&#39;embrione. In alternativa, gli schemi di accesso dei primi stadi di sviluppo di Xenopus su Xenbase 11. </li><li> Accedere alle mappe interattive destino delle cellule Xenopus su Xenbase 11 per selezionare quali blastomere sarà mirato per microiniezione. </li><li> Si osservi che l&#39;embrione singola cella ha un polo animale pigmentazione scura e un polo vegetale, che è bianco e yolky. Si noti che una membrana protettiva, noto come vitellina envelope, copre l&#39;embrione. </li><li> Si noti che la prima scissione si verifica in genere tra i lati sinistro e destro dell&#39;embrione. Queste cellule contribuiscono ugualmente al lignaggio pronephric. </li><li> Si noti che la seconda scissione divide la dorsale e metà ventrali dell&#39;embrione, portando ad un embrione 4 celle. Le cellule dorsali sono più piccoli e hanno meno pigmento rispetto alle cellule ventrale (Figura 2A e la Figura 3A). <ol><li> Identificare i blastomeri ventrale (V; i grandi, cellule scure) sui lati sinistro e destro, che contribuiscono di più al rene in via di sviluppo rispetto alla dorsale (D; piccole celle luce) blastomeri (Figura 2A). </li><li> Se l&#39;iniezione in un embrione a 4 celle, iniettare il blastomeri ventrale sinistro per colpire il rene sinistro (figura 3A e la Sezione 3). </li></ol></li><li> La terza fenditura biseca lati animali e vegetali, risultante in un embrione di otto cellule. A questo punto, ci sono quattro blastomeri animali [a destra ea sinistra ventrale(V1) e dorsale (D1)] e quattro blastomeri vegetali [sinistra e destra ventrale (V2) e dorsale (D2)] (Figura 2B e Figura 3B). <ol><li> Individuare i blastomeri, vegetali ventrali (V2). Questi blastomeri contribuire maggiormente al rene sviluppare eventuali altre cellule in questa fase (Figura 2B). Per indirizzare il rene sinistro di un embrione di 8 cellule, iniettare il V2 blastomere sinistra (Figura 3B e la Sezione 3). </li></ol></li><li> Si noti che il quarto e quinto spaccature si intersecano i blastomeri animali e vegetali. Due progenie sono generati da ciascuna blastomere, risultando in un embrione di 16 cellule. Le cellule sono chiamati dopo il loro predecessore. Ad esempio, il blastomero V2 dallo stadio 8 cellule dà origine a V2.1 e V2.2 progenie allo stadio di 16 cellule (Figura 2C). La cella V2.2 allo stadio di 16 cellule fornisce la maggior parte delle cellule che contribuiscono al rene sviluppo. </li><li> Nota fratture sesto e settimo comportano un Embry 32 celleo. Anche in questo caso, due discendenti sono generati da ogni blastomeri, che prendono il nome dopo la loro predecessore. Ad esempio, il blastomero V2.2 dalla fase 16 cellule dà origine a V2.2.1 e V2.2.2 nella fase 32 cellule. C&#39;è un sistema di denominazione alternativa nella fase 32 cellule in cui le cellule vengono identificate in quattro righe come A, B, C, e D (da animale a vegetale), e in quattro colonne 1, 2, 3, e 4 ( da dorsale ventrale). Così, il blastomeri V2.2.2, che contribuisce più ai pronephros in via di sviluppo, si chiama C3 con questo sistema di denominazione alternativa (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparazione di embrioni <ol><li> Preparare 50 ml di Dejelly Solution (2% cisteina, NaOH a pH 8,0). </li><li> Isolare entrambi i testicoli da una singola rana maschio secondo protocolli standard 14. Mettere i testicoli in una capsula di 60 millimetri di Petri riempita con 10 ml di testicoli Storage Solution (di 1x Marc Modified Ringers [MMR; 0,1 M di NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% di albumina sierica bovina, 50 ug / ml di gentamicina). Conservare i testicoli a 4 ° C. Nota: I testicoli possono essere conservati per circa 7 - 10 giorni a 4 ° C, ma l&#39;efficienza di fecondazione diminuirà il più i testicoli sono stati memorizzati. </li><li> Spremere una rana femminile per ottenere le uova secondo protocolli standard 14. Raccogliere le uova in un 100 millimetri piastra di Petri. Versare l&#39;acqua in eccesso. </li><li> Tagliare ¼ di testicoli mentre è in testicoli soluzione di conservazione con pinze e una lama di rasoio. Trasferire il pezzo di testicoli alla piastra di Petri contenenti uova. Regolare la dimensione della porzione testicoli utilizzato per conto per la dimensione del testicolo, da quanto tempo è stato memorizzato il testicolo, e quante uova devono essere fecondato. Generalmente usare ¼ a 1/3 di un testicolo fresco sezionato per fertilizzare una frizione di uova. </li><li> Tagliare la parte del testicolo in piccoli pezzi con pinze e una lama di rasoio. Aggiungere abbastanza MMR 0.3x+ 30 mg / ml gentamicina al piatto Petri per coprire le uova. Agitare la MMR nel piatto di mescolare. </li><li> Attendere circa 30 minuti per la fecondazione avvenga a temperatura ambiente. Si noti che l&#39;emisfero animale (lato pigmentata dell&#39;embrione) siederà sopra l&#39;embrione upon concimazione efficace. Poi, rimuovere il MMR dalla piastra di Petri con una pipetta di trasferimento. Aggiungere sufficiente soluzione Dejelly al piatto per coprire gli embrioni. </li><li> Nel corso dei prossimi minuti, agitare delicatamente il piatto in modo intermittente. agitazione vigorosa del piatto in questo momento può causare difetti assi. &#160; Il cappotto gelatina su embrioni si dissolverà, e gli embrioni si riuniscono nel centro del piatto durante vorticoso. Una volta che gli embrioni sono strettamente toccano nel centro del piatto, rimuovere la soluzione Dejelly con una pipetta di trasferimento. Non lasciare gli embrioni nella soluzione Dejelly per più di 5 minuti, o gli embrioni possono essere danneggiati. </li><li> Lavare gli embrioni dejellied 3 - 5 volte a 0.3xMMR + 30 mg / ml di gentamicina con attenzione versando o pipettaggio fuori MMR e riempiendo il piatto con nuova MMR. Non rimuovere tutto il MMR dal piatto, o gli embrioni possono essere danneggiati. </li><li> Rimuovere eventuali uova non fecondate o pezzi di testicoli dalla piastra di Petri con una pipetta di trasferimento. </li><li> Incubare gli embrioni tra i 14 ei 22 ° C. Nota: embrioni coltivati ​​a temperature inferiori sviluppano più lentamente rispetto embrioni coltivati ​​a temperature più elevate. Tempi di stadi di sviluppo può essere trovato sul Xenbase 22. <ol><li> Per distanziare il loro sviluppo, posto metà degli embrioni da un singolo fecondazione in una capsula di Petri mantenuta a 14 ° C, e l&#39;altra metà degli embrioni in una capsula di Petri mantenuta a 18 ° C. Questo permette per due serie di iniezioni in embrioni di 4 cellule o 8 celle da un&#39;unica fecondazione. </li></ol></li></ol> 3. preparazione di soluzioni iniezione e la microiniezione di embrioni <ol><li> Preparare la soluzione iniettabile contenente 0,01ng / nl proteine ​​di membrana rosso fluorescente (MEM-RFP) mRNA 9, mentre gli embrioni stanno sviluppando alla fase 4 celle o 8 celle. Conservare la soluzione di iniezione sul ghiaccio fino al momento per iniettare. </li><li> Caricare un &quot;tubo capillare di vetro sostituzione in un estrattore ago, con la parte superiore del tubo di sostituzione allineato con la sommità della cassa dell&#39;ago estrattore. Impostare il valore di calore ° 2 a 800, e il valore di tiro al 650. Premere il&quot; 7 tirare &quot;per tirare l&#39;ago. Ciò creerà 2 aghi da un singolo 7&quot; tubo capillare di vetro. </li><li> Tagliare la punta di un ago tirato con un paio di pinze Dumont. Nota: Dopo aver tirato l&#39;ago, la punta è sigillata chiusa e deve essere tagliato aperto. Il più vicino al punto dell&#39;ago che viene tagliato, minore è il diametro della punta dell&#39;ago sarà. Anche se il diametro della punta non influenzerà il volume di iniezione con il sistema di microiniezione usato qui, una punta con un diametro più grande è più probabile che danneggiare l&#39;embrione. </li><li> Infilare il micropipette pinza sul retro dell&#39;ago. Successivamente, scivolare l&#39;O-ring foro grande sul retro dell&#39;ago dietro la pinza. </li><li> Riempire l&#39;ago con olio minerale con un ago ipodermico calibro 27, facendo attenzione a non ottenere bolle d&#39;aria nel ago. </li><li> Infilare l&#39;ago sulla stantuffo della microinjector, sedere l&#39;ago nel foro grande del distanziatore plastica bianca installata sul pistone. Il pistone deve avere un piccolo O-ring più vicino al corpo del microinjector, seguito dal distanziale bianco, grande O-ring buche e pinza. Fissare l&#39;ago stringendo la pinza. Tirare delicatamente l&#39;ago per assicurarsi che sia fissata correttamente. </li><li> Premere e tenere premuto il tasto &quot;vuoto&quot; sulla scatola di comando microinjector fino a quando ci sono due segnali acustici. </li><li> Pipettare 3 ml di soluzione per l&#39;iniezione su un pezzo di Parafilm. Inserire la punta dell&#39;ago nella goccia di soluzione di iniezione sul Parafilm. Premere e tenere premuto il pulsante &quot;riempire&quot; il microinjector scatola di controllo per disegnare la soluzione iniezione nel ago. </li><li> Riempire un piatto 60 millimetri Petri foderato con 500 micron di poliestere maglia con il 5% Ficoll a 0.3x MMR + 30 mg / ml di gentamicina. pipetta con attenzione 20 - 30 embrioni a 4 celle o 8 celle nel piatto. </li><li> Con un&#39;ansa capelli 14, manipolare gli embrioni in modo che il blastomere da iniettare è di fronte all&#39;ago. Per indirizzare il rene sinistro, allineare gli embrioni in modo che i blastomeri ventrale sinistro di embrioni a 4 cellulari o blastomeri V2 sinistra di embrioni 8 celle si affacciano sul ago. </li><li> Iniettare 10 nl di soluzione di iniezione nel blastomere selezionata di ogni embrione nel piatto. Nota: La mesh sul fondo del piatto Petri stabilizza gli embrioni e impedisce loro di laminazione, permettendo loro di essere iniettato senza l&#39;uso di un anello di capelli per la stabilizzazione. </li><li> Trasferimento iniettato embrioni nei pozzetti di una piastra di coltura che sono stati riempiti con 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml di gentamicina. Incubare l&#39;embrione iniettatos a 16 ° C per almeno un&#39;ora per consentire i blastomeri iniettati di guarire. </li><li> Trasferire gli embrioni guarite in pozzetti di una nuova piastra di coltura che sono stati riempiti di 0.3x MMR + 30 mg / ml di gentamicina per stadio 9 (prima della gastrulazione). </li><li> Incubare gli embrioni a 14-22 ° C, fino a raggiungere gli embrioni fase 38-40 21. </li></ol> 4. Fissazione e Immunocolorazione di embrioni <ol><li> Preparare 50 ml di MOPS / EGTA / solfato di magnesio / Formaldeide Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 3,7% (v / v) di formaldeide]. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, mettere 10-20 stadio 38 - 40 embrioni in un flaconcino di vetro. Aggiungere 10 ml 5% benzocaina in 100% di etanolo al flaconcino e invertito flacone per mescolare. Attendere 10 minuti per anestetizzare gli embrioni. </li><li> Rimuovere la MMR dalla fiala usando una pipetta di vetro. Se l&#39;elaborazione più flaconi allo stesso tempo, le fiale possono essere tenuti in posizione verticale in una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. </li><li> Con un tubo di vetrotte, riempire il flacone con MEMFA. Posizionare il flaconcino su una piattaforma oscillante tridimensionale per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il MEMFA dalla fiala con una pipetta di vetro. Riempire il flacone con 100% di metanolo. Posizionare il flaconcino su una piattaforma oscillante tridimensionale per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta, e conservare gli embrioni in metanolo 100% durante la notte a -20 ° C. </li><li> Preparare 1x tampone fosfato isotonico-albumina sierica bovina-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml albumina sierica bovina, 0,1% Triton X-100. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo primario: 1x PBT con 10% siero di capra con una diluizione 1: 5 di topo monoclonale 4A6 anticorpi (per etichettare le membrane degli intermedi, distale e collegamento tubuli 20), una diluizione 1:30 di topo monoclonale 3G8 (a lume etichetta dei tubuli prossimali 20), e una diluizione 1: 250 di coniglio anticorpo policlonale RFP (per etichettare tracciante MEM-RFP). Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la Secondasoluzione di anticorpi ry: 1x PBT con il 10% di siero di capra, 1: 500 Alexa 488 di capra anti-topo IgG (magazzino concentrazione 2 mg / ml, per l&#39;etichetta 4A6 e 3G8), e 1: 500 Alexa 555 capra anti-IgG di coniglio (magazzino concentrazione 2 mg / ml, per etichettare il tracciante MEM-RFP). Conservare a 4 ° C, che copre il tubo in un foglio per proteggere dalla luce. </li><li> In alternativa, raccogliere gli anticorpi primari e secondari dopo la colorazione, e salvare a 4 ° C per il riutilizzo in esperimenti futuri. Se l&#39;anticorpo deve essere salvato per il riutilizzo, aggiungere lo 0,01% di sodio azide. </li><li> Immunostain gli embrioni utilizzando protocolli stabiliti 18. </li></ol> 5. Visualizzazione di embrioni e analisi dei mirata del tessuto Pronephric <ol><li> Schermo gli embrioni immunostained per verificare che il blastomere corretto è stato iniettato visualizzando la fluorescenza del tracciante sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza a 1X (per visualizzare tutto embrionale) e 5X (per visualizzare rene) ingrandimento. Luogo embrioni in una lastra di vetro multi-bene con il noiLLS pieni di 1x PBT con una pipetta di trasferimento con la punta tagliata. Manipolare gli embrioni con un ciclo di capelli. Utilizzare solo embrioni che hanno il co-iniettata tracciante presente nei pronephros sul lato sinistro dell&#39;embrione (Figura 3C, F e Figura 4C, F) per la sovraespressione del gene o l&#39;analisi knockdown. </li><li> In alternativa, eliminare gli embrioni a Clear di Murray (2 parti benzoato benzilico: 1 parte benzilico alcool) posizionando gli embrioni in un flacone di vetro e riempire il flacone con Clear di Murray. Visualizza gli embrioni utilizzando una lastra di vetro bene. Nota: Sereno di Murray è un solvente organico, e deve essere maneggiato con cura. Indossare guanti, e utilizzare solo flaconi di vetro e pipette con Clear di Murray. </li><li> embrioni Conservare a 4 ° C in 1x PBT per 2 - 3 settimane. Per la conservazione a lungo termine di embrioni, disidratano gli embrioni lavando due volte in metanolo 100% a temperatura ambiente per 10 min. Conservare gli embrioni a -20 ° C in 100% metanolo. </li></ol>

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<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
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<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Targeting le pronephros di sviluppo di embrioni di Xenopus si basa sull&#39;identificazione e iniettare la blastomeri corretta. L&#39;iniezione del blastomero V2 di embrioni 8 celle obiettivi dei pronephros sinistra 18. Questo lascia i pronephros controlaterale destra come un controllo interno. Se morpholino knockdown o RNA sovraespressione è usato per alterare lo sviluppo del rene, i pronephros controlaterale destra possono essere utilizzati per confrontare gli effetti di knockdown gene o sovraespre...

Il rene embrionale di Xenopus, i pronephros, è un buon modello per lo studio dello sviluppo dei reni e le malattie. Gli embrioni sviluppano esternamente, sono di grandi dimensioni, può essere prodotto in grandi quantità, e sono facilmente manipolati tramite microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, i geni che regolano lo sviluppo del rene nei mammiferi e anfibi sono conservati. Reni mammiferi progredire attraverso tre fasi: Pronefro, mesonefro e metanefro 1, mentre gli anfibi embrionali hanno un pronephros e anfibi adulti hanno una metanefro. L&#39;unità di filtraggio di base di queste forme di rene è il nefrone, ed entrambi i mammiferi e gli anfibi richiedono la stessa cascate di segnalazione ed eventi induttivi di sottoporsi nefrogenesi 2, 3. Le pronephros Xenopus contiene un singolo nefrone composto da prossimale, intermedio, distale e collegamento tubuli, e un glomo (analogo al glomerulo mammiferi) 1, 4-6 (Figura 1 </strong&gt;). Il singolo, grande nefrone presente nelle pronephros Xenopus lo rende adatto come un semplice modello per lo studio dei geni coinvolti nei processi di sviluppo renale e malattie. Mappe cellulare destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus, e sono liberamente disponibili online all&#39;indirizzo Xenbase 7-11. Qui, descriviamo una tecnica per microiniezione di rivelatori di derivazione per indirizzare le sviluppo pronephros Xenopus, anche se la stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tessuti come il cuore o gli occhi. traccianti Lineage sono etichette (tra cui coloranti vitali, destrani fluorescente, enzimi istochimicamente rilevabili, e mRNA che codifica per proteine ​​fluorescenti) che possono essere iniettati in un blastomero precoce, che permette la visualizzazione della progenie di cellule che durante lo sviluppo. Questo protocollo utilizza MEM-RFP mRNA, membrana codifica mirata proteina fluorescente rossa 12, come tracciante lignaggio. Il tecnico microiniezione miratoniche per i singoli blastomeri in embrioni di 4 e 8 celle qui descritti possono essere utilizzati per l&#39;iniezione con morpholinos per abbattere l&#39;espressione genica, o con l&#39;RNA esogeno di iperespressione di un gene di interesse. Iniettando nella ventrale, blastomeri vegetale, in primo luogo i pronephros dell&#39;embrione saranno mirati, lasciando i pronephros controlaterale come controllo dello sviluppo. Co-iniezione di un tracciante verifica che il blastomere corretto è stato iniettato, e mostra quali tessuti nell&#39;embrione nasce dalla blastomero iniettato, verificando mira dei pronephros. Immunocolorazione dei pronephros permette la visualizzazione di come tubuli pronephric sono stati presi di mira. Sovraespressione e knockdown effetti possono essere ottenuti contro il lato controlaterale dell&#39;embrione, che serve come controllo dello sviluppo, e possono essere utilizzati per calcolare l&#39;indice pronephric 13. La disponibilità di mappe destino delle cellule permette questa tecnica microiniezione mirato da utilizzare per indirizzare i tessuti OTHer rispetto alle pronephros e co-iniezione di un tracciante fluorescente permette la microiniezione mirato per ciascun tessuto da verificare prima dell&#39;analisi. Durante embrione microiniezione, la temperatura di sviluppo dovrebbe essere regolata strettamente, dato che il tasso di sviluppo di Xenopus è fortemente dipendente su di esso 14. Gli embrioni devono essere incubate a temperature più fredde (14 - 16 ° C) per preparazioni iniettabili 4 e 8-cell, perché il tempo di sviluppo è rallentato. A 22 ° C, tempo di sviluppo dallo stadio 1 (1 cellula) alla fase 3 (4 celle) è di circa 2 ore, mentre a 16 ° C il tempo di sviluppo alla fase 3 è di circa 4 ore. Ci vogliono circa 15 minuti per andare da un embrione a 4 celle a 8 celle (fase 4) embrione a 22 ° C, ma richiede circa 30 minuti a 16 ° C. Allo stesso modo, a 22 ° C, ci vogliono solo 30 minuti per un embrione a 8 celle a progredire a un embrione di 16 cellule (fase 5). Questo tempo è aumentato a 45 minuti a 16 ° C. Ilto, è è utile a rallentare il tasso di sviluppo degli embrioni per consentire un tempo sufficiente per iniezioni nello stadio di 8 cellule prima gli embrioni passare alla fase 16 cellule. Inoltre, le temperature di crescita possono essere modulate per accelerare o rallentare lo sviluppo embrionale fino a quando il rene è completamente sviluppato. L&#39;epidermide di girino stadio Xenopus embrioni è relativamente trasparente, consentendo una facile l&#39;imaging dei pronephros in via di sviluppo senza dissezione o compensazione del tessuto 15. A causa della relativa trasparenza di embrioni di Xenopus, l&#39;imaging cellulare dal vivo è anche fattibile 16,17. Tutto il montaggio immunocolorazione per visualizzare le pronephros è possibile con anticorpi stabilito che etichettano prossimale, intermedio, distale e tubuli di collegamento della fase 38 - 40 embrioni che permettono di valutare lo sviluppo pronephric dopo la manipolazione dell&#39;espressione genica mirata in Xenopus embrioni 18-20.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gentamicina, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Incubatrice da banco per embrioni.</td></tr><tr>Plasmide <td></td><td></td><td>Gap43-RFP</td><td>Per la produzione di RNA tracciante. Rif: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Destrano di rodamina, 10.000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare, acqua purificata sterile USP</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Provette di ricambio Drummond da 7</td>" <td>Aghi per microiniezione</td> <td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td>.</tr><tr><td>Estrattore per aghi</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Per rompere la punta dell'ago per microiniezione.</td></tr><tr><td>Microiniettore</td> <td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td>.</tr><tr><td>Olio minerale, pesante</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Olio per aghi.</td></tr><tr><td>27 G Ago ipodermico monogetto</td>, <td>Covidien</td> 8881200508 <td>Per caricare l'olio minerale nell'ago per microiniezione.</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok da 5 ml</td><td>BD</td><td>309646</td><td>Per caricare l'olio minerale nell'ago per microiniezione.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micron Rete in poliestere</td><td>Piccole parti</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Per il trasferimento di embrioni. Tagliare la punta in modo che gli embrioni vengano facilmente assorbiti dalla pipetta.</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Fiala con filettatura a vite</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>Per il fissaggio, la colorazione e la conservazione degli embrioni.</td></tr><tr><td>Piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x polvere</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Albume sierico bovino</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, modello 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra, origine neozelandese</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale 3G8</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Anticorpo primario da marcare prossimale Tubuli.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale 4A6</td> European <td>Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Anticorpo primario per marcare tubuli intermedi, distali e di collegamento.</td></tr><tr><td>anticorpi anticorpi anti-RFP, IgG/MBL</td><td></td><td>PM005</td> purificati <td>per marcare il tracciante Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Anticorpo secondario per marcare i tubuli renali.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 capra anti-coniglio IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Anticorpo secondario per marcare il tracciante Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Piastra spot a 9 cavità</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzil benzoato</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Opzionale - per la pulizia degli embrioni</td></tr><tr><td>Alcool benzilico</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Opzionale - per la pulizia degli embrioni</td></tr></tbody></table>

tecnica a target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; xenopus</em&gt; kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Il rene embrionale di Xenopus laevis (rana), le pronephros, costituito da un unico nefrone, e può essere usato come modello per malattie renali. Embrioni di Xenopus sono grandi, sviluppano esternamente, e possono essere facilmente manipolati da microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, le mappe destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus. microiniezione mirata nella blastomere individuo che alla fine darà origine a un organo o tessuto di interesse può essere usata per iperespressione selettivamente o abbattere l&#39;espressione genica all&#39;interno di questa regione ristretta, diminuendo gli effetti secondari nel resto dell&#39;embrione in via di sviluppo. In questo protocollo, si descrive come utilizzare le mappe di Xenopus destino stabilito di indirizzare il sviluppo di Xenopus rene (i pronephros), tramite microiniezione in specifiche blastomeri di embrioni a 4 e 8 celle. Iniezione di traccianti lineage permette la verifica del targeting specifico dell&#39;iniezione.Dopo gli embrioni si sono sviluppati a mettere in scena 38-40, tutto il montaggio immunostaining viene usato per visualizzare lo sviluppo pronephric, e il contributo da parte delle cellule mirati alle pronephros può essere valutata. La stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tipi di tessuto oltre ai pronephros.

Microiniezioni di 4 e 8-cell embrioni di Xenopus con MEM-RFP mRNA mostrano diversi livelli di targeting ai pronephros. Figura 4 spettacoli 40 embrioni con MEM-RFP pattern di espressione di mRNA corretti. Gli embrioni sono stati iniettati nel blastomere ventrale sinistro (Figura 4A), e ordinati per il corretto pattern di espressione di MEM-RFP mRNA. Oltre ad esprimere MEM-RFP nel prossimale, intermedio, distale e collegando tubuli del rene, embri...

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare mappe del destino e traccianti di lignaggio per indirizzare le iniezioni nei singoli blastomeri che danno origine al rene degli embrioni di Xenopus laevis.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indirizzare microiniezioni al rene in via di sviluppo di Xenopus. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio come si forma il rene e quali geni sono importanti per questo processo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che massimizza il rilascio di reagenti microiniettati in un tessuto mirato.La visualizzazione di questo metodo è importante perché l'identificazione del blastomero corretto per la microiniezione mirata è fondamentale. Per iniziare questa procedura, entrambi i testicoli sono stati isolati da una singola rana maschio e posti in una piastra di Petri da 60 millimetri contenente 10 millilitri di soluzione di conservazione per testicoli. Successivamente, conservare i testicoli a quattro gradi Celsius.Successivamente, le uova sono state raccolte da una rana femmina in una piastra di Petri da 100 millimetri. Versare l'acqua in eccesso dalla piastra di Petri. Successivamente, tagliare un quarto di un testicolo nella Soluzione di Conservazione dei Testicoli.Trasferire il pezzo di testicolo nella piastra di Petri contenente le uova. Successivamente, t

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Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica...

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

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I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.

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Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Impara la tecnica di microiniezione mirata per lo studio dello sviluppo renale in Xenopus laevis. Questo metodo consente di indagare la formazione del rene e identificare i geni coinvolti nel processo.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo

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