Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo Xenopus Kidney
3 maggio 2016
Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare mappe del destino e traccianti di lignaggio per indirizzare le iniezioni nei singoli blastomeri che danno origine al rene degli embrioni di Xenopus laevis.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare le microiniezioni al rene xenopus in via di sviluppo. Questo metodo può aiutare ad affrontare domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio come si forma il rene e quali geni sono importanti per questo processo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che massimizza la consegna di reagenti microiniettati a un tessuto mirato.
La visualizzazione di questo metodo è importante perché l'identificazione del blastomero corretto per la microiniezione mirata è fondamentale. Per iniziare questa procedura, entrambi i testicoli sono stati isolati da una singola rana maschio e posti in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita con 10 millilitri di soluzione per la conservazione dei testicoli. Quindi conservare i testicoli a quattro gradi Celsius.
Successivamente, le uova sono state raccolte da una rana femmina in una capsula di Petri da 100 millimetri. Versare l'acqua in eccesso dalla capsula di Petri. Dopodiché, tagliare un quarto di testicolo nella soluzione di archiviazione dei testicoli.
Trasferire il pezzo di testicolo nella capsula di Petri contenente le uova. Successivamente, tagliare la parte del testicolo in piccoli pezzi. Aggiungi MMR e gentamicina alla capsula di Petri per coprire le uova.
Mescolateli facendo roteare il piatto e poi aspettate circa 30 minuti affinché la concimazione avvenga a temperatura ambiente. Dopo la fecondazione, il lato pigmentato degli embrioni dovrebbe essere rivolto verso l'alto. Rimuovere l'MMR dalla capsula di Petri utilizzando una pipetta di trasferimento e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di de-gelatina per coprire gli embrioni.
Successivamente, fai roteare il piatto nei minuti successivi per sciogliere il rivestimento gelatinoso sugli embrioni. Una volta che gli embrioni si toccano strettamente al centro del piatto, il rivestimento gelatinoso è stato rimosso. Rimuovere la soluzione di de-jelly con una pipetta di trasferimento.
Successivamente, lavare gli embrioni degelatinati da 3 a 5 volte in MMR più gentamicina versando accuratamente l'MMR e riempiendo il piatto con nuovo MMR. Non rimuovere tutto l'MMR dal piatto, che potrebbe danneggiare gli embrioni. Successivamente, rimuovi eventuali uova non fecondate o pezzi di testicoli dalla capsula di Petri.
Per scaglionare il loro sviluppo, metti metà degli embrioni di una singola fecondazione in una capsula di Petri mantenuta a 14 gradi Celsius e l'altra metà degli embrioni in una capsula di Petri mantenuta a 18 gradi Celsius. Gli embrioni si svilupperanno più lentamente a 14 gradi Celsius che a 18 gradi Celsius. Consente più serie di iniezioni da un'unica frizione fecondata.
Preparare la soluzione iniettabile contenente il punto zero di un nanogrammo per nanolitro di mRNA della proteina fluorescente rossa legata alla membrana. Mentre gli embrioni si stanno sviluppando fino allo stadio di 4 o 8 cellule. Tenere la soluzione iniettabile con ghiaccio fino al momento dell'uso.
Quindi, caricare un tubo capillare di vetro di ricambio da sette pollici in un estrattore per aghi con la parte superiore del tubo di ricambio allineata con la parte superiore della custodia dell'estrattore per ago. Impostare il valore del calore numero due su 800 e il valore di trazione su 650 e premere il pulsante di trazione per tirare l'ago. Dopodiché, taglia la punta dell'ago estratto con un paio di pinze Dumont.
Infilare la pinza della micropipetta sul retro dell'ago. Quindi, infilare l'O-ring a foro grande sul retro dell'ago dietro la pinza. Ora, riempi l'ago con olio minerale usando un ago iperdermico calibro 27, facendo attenzione a non far entrare bolle d'aria nell'ago.
Infilare l'ago sullo stantuffo del microiniettore, inserendo l'ago nel foro grande del distanziatore di plastica bianca installato sullo stantuffo. Fissare l'ago stringendo la pinza. Quindi, tenere premuto il pulsante "Vuoto" sulla scatola di controllo del microiniettore fino a quando non vengono emessi due segnali acustici.
Successivamente, pipettare tre microlitri di soluzione iniettabile su un pezzo di parafilm. Quindi, inserire la punta dell'ago nel cordone di soluzione iniettabile sul parafilm. Tenere premuto il pulsante Fill" sulla scatola di controllo del microiniettore per aspirare la soluzione di iniezione nell'ago.
Prima della microiniezione, è importante comprendere le prime divisioni cellulari dell'embrione di xenopus. L'embrione unicellulare ha un polo animale pigmentato scuro e un polo vegetale bianco e yoky. Nell'embrione a due cellule la prima scissione si verifica tipicamente tra i lati sinistro e destro dell'embrione.
Queste cellule contribuiscono in egual misura al lignaggio pronefrico. La seconda scissione divide le metà dorsale e ventrale dell'embrione portando a un embrione a 4 cellule. Le cellule dorsali sono più piccole e hanno meno pigmento rispetto alle cellule ventrali.
Se si inietta in un embrione a 4 cellule, iniettare il blastomero ventrale sinistro per colpire il rene sinistro. La terza scissione divide in due i lati animale e vegetale. Il risultato è un embrione di 8 cellule.
A questo punto ci sono quattro blastomeri animali e quattro blastomeri vegetali. Per colpire il rene sinistro di un embrione di 8 cellule, iniettare nel blastomero vegetale ventrale sinistro. Successivamente, riempire una capsula di Petri da 60 millimetri rivestita con una rete di poliestere da 500 micron con il cinque percento di fycol in MMR più gentamicina.
Pipettare con cura da 20 a 30 embrioni a 8 cellule nella piastra. Usando un cappio di capelli, manipolare gli embrioni in modo che il blastomero da iniettare sia rivolto verso l'ago. Per colpire il rene sinistro, allinea gli embrioni in modo che i blastomeri vegetali ventrali sinistro degli embrioni a 8 cellule siano rivolti verso l'ago.
Iniettare 10 nanolitri di soluzione iniettabile nel blastomero selezionato di ciascun embrione nella capsula. Quindi, trasferire gli embrioni iniettati nei pozzetti di una piastra di coltura con il cinque percento di fycol in MMR più gentamicina. Incubare gli embrioni iniettati a 16 gradi Celsius per circa una o due ore per consentire ai blastomeri iniettati di guarire.
Successivamente, trasferire gli embrioni microiniettati in nuovi pozzetti nella piastra di coltura riempita con MMR più gentamicina. Incubare gli embrioni a una temperatura compresa tra 14 e 22 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio 38-40. In questa procedura, trasferire da 10 a 20 embrioni di stadio da 38 a 40 in una fiala di vetro.
Aggiungere 10 microlitri di benzocaina al cinque percento in etanolo al 100 percento alla fiala. Mescolare capovolgendo la fiala e attendere 10 minuti per anestetizzare gli embrioni. Quindi, rimuovi l'MMR dalla fiala e riempila con MEMFA.
Quindi, posizionalo su una piattaforma a dondolo tridimensionale per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, rimuovere MEMFA dal flaconcino e riempirlo con metanolo al 100%. Quindi, posizionare la fiala su una piattaforma a dondolo tridimensionale per dieci minuti a temperatura ambiente.
Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta e conservare gli embrioni in metanolo al 100% durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Gli embrioni sono ora fissati e pronti per l'immunocolorazione. Questo schema mostra quale blastomero iniettare per il targeting del pronephros sinistro degli embrioni di xenopus allo stadio di 8 cellule utilizzando l'mRNA della proteina fluorescente rossa legata alla membrana come tracciante.
La localizzazione del tracciante dopo l'iniezione nel blastomero vegetale ventrale sinistro è mostrata in rosso, mentre il rene è etichettato in verde. Questa immagine mostra che il rene è stato colorato di verde con gli anticorpi 3G8 e 4A6. Ecco una vista ravvicinata della regione renale che mostra la loacalizzazione del tracciante e qui c'è l'immagine unita che mostra la co-localizzazione del tracciante con il rene.
Qui è mostrata l'immagine confocale del rene di un secondo embrione colorato con 3G8 e 4A6. Questa è la localizzazione del tracciante rosso nel rene e nel tessuto circostante e questa è l'immagine unita che mostra la co-localizzazione del tracciante 3G8 e 4A6 nel rene. Prima di eseguire questa procedura è importante familiarizzare con l'embrione precoce di xenopus.
Ciò ti consentirà di indirizzare correttamente le microiniezioni attraverso la mappa di dissolvenza xenopus stabilita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere adattata per colpire altri tessuti come il tubo neurale o il cuore.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare microiniezioni in singoli blastomeri che si sviluppano in reni di embrioni di Xenopus laevis. L'obiettivo è migliorare la comprensione della formazione renale e dei geni coinvolti in questo processo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
- Analisi della funzione genica
Sfondo
- Comprendere lo sviluppo renale è fondamentale nella biologia dello sviluppo.
- Le tecniche di microiniezione permettono un rilascio preciso di reagenti.
- Identificare il blastomero corretto è essenziale per eseguire con successo le iniezioni.
- Questo metodo può contribuire a chiarire il ruolo dei geni nell'organogenesi.
Scopo dello studio
- Studiare la formazione del rene in Xenopus laevis.
- Identificare geni importanti coinvolti nello sviluppo del rene.
- Migliorare le tecniche per microiniezioni mirate negli embrioni.
Metodi Utilizzati
- Isolamento dei testicoli da una rana maschio.
- Preparazione della soluzione per la conservazione dei testicoli.
- Conservazione dei testicoli a basse temperature.
- Tecniche di visualizzazione per l'identificazione dei blastomeri.
Risultati principali
- Indirizzamento preciso delle microiniezioni verso specifici blastomeri.
- Migliore comprensione dei processi di sviluppo renale.
- Identificazione dei geni chiave che influenzano la formazione del rene.
- Metodologia migliorata per futuri studi in biologia dello sviluppo.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio dello sviluppo renale.
- Iniezioni mirate di microiniezione possono fornire informazioni significative sulla funzione genica.
- La ricerca futura può basarsi su questi risultati per esplorare l'organogenesi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'iniezione mirata in microscala in embrioni di Xenopus consente un controllo spaziale preciso dell'espressione genica, riducendo gli effetti fuori bersaglio e migliorando la chiarezza meccanicistica negli studi sullo sviluppo. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio collegando geni specifici a percorsi di organogenesi, come la formazione del pronefro, con minima perturbazione sistemica. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, isolando la funzione genica all'interno di contesti tissutali definiti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'overespressione o l'abbassamento dell'espressione genica in blastomeri specifici che contribuiscono al pronefro.
- Valore operativo: Riduce gli effetti secondari nei tessuti non bersaglio, aumentando il rapporto segnale-rumore nei rilievi fenotipici.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando il ruolo dei geni nello sviluppo renale attraverso manipolazioni spazialmente limitate.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera sistemi biologici validati con cellule tracciate nella linea discendente, per l'analisi successiva del contributo pronefrico.
- Valore operativo: Utilizza la marcatura immunoistochimica su preparati interi allo stadio 38–40 per valutare quantitativamente l'integrazione delle cellule bersaglio nel pronefro.
- Riproducibilità: Si basa su mappe di destino consolidate e sulla coerenza del targeting dei blastomeri negli embrioni a 4 e 8 cellule.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Il pronefro di Xenopus rappresenta un sistema rilevante per la malattia, utile per modellare meccanismi conservati dello sviluppo renale nei vertebrati.
- Continuità meccanicistica: Permette di passare dalla scoperta della funzione genica negli embrioni all'analisi dei percorsi in modelli preclinici.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta decisioni di prosecuzione o interruzione del progetto, validando l'interazione con il bersaglio in un sistema organico in via di sviluppo prima di intraprendere studi nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si inserisce nei flussi di lavoro di scoperta precoce, collegando la modulazione genica specifica per blastomeri alla valutazione fenotipica nei tessuti in via di sviluppo e guidando la selezione di bersagli per ulteriori conferme.
- Biologia della Scoperta: Supporta il test delle ipotesi limitando la manipolazione genica ai blastomeri della linea del pronefro, chiarificando il coinvolgimento dei percorsi nell'organogenesi.
- Prontezza del Saggio: Produce embrioni con localizzazione del tracciante verificata, consentendo immunomarcature e analisi mediante imaging standardizzati per l’analisi quantitativa del pronefro.
- Analisi: Facilita il confronto tra la struttura pronefrica e la co-localizzazione del tracciante per valutare l’impatto della funzione genica sullo sviluppo renale.
- Ricerca Translazionale: Collega i risultati ottenuti sul pronefro embrionale a meccanismi conservati applicabili nei modelli di malattia renale nei mammiferi.
- Riutilizzo Aziendale: Adattabile ad altri tessuti (ad esempio, tubo neurale, cuore) utilizzando lo stesso schema di microiniezione guidato dalla mappa del destino cellulare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la precisione della validazione degli obiettivi riducendo al minimo gli effetti confondenti derivanti dalla modulazione genica diffusa.
- Valore operativo: Consente microiniezioni riproducibili e scalabili in blastomeri definiti, utilizzando passaggi standardizzati di preparazione e incubazione.
- Valore strategico: Migliora la selezione del portafoglio fornendo collegamenti più chiari tra genotipo e fenotipo in un sistema organico in via di sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Riduce il rischio biologico in fasi avanzate grazie a una riduzione precoce del rischio meccanicistico per bersagli legati al rene.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allestimento di embrioni di Xenopus, nell'identificazione dei blastomeri e nelle tecniche di microiniezione.
- Dipende da attrezzature per iniezione funzionanti, incluse estrusori per capillari, microiniettori e sistemi di incubazione con controllo termico.
- Necessita di protocolli standardizzati per lo stadio embrionale, la fissazione e l'immunomarcatura al fine di garantire coerenza tra esperimenti.
- L'adattamento ad altri tessuti si basa su mappe di destino accurate e sulla precisione del targeting dei blastomeri.
- I limiti pratici includono la sensibilità della vitalità embrionale alle variazioni di temperatura e al trauma da iniezione.
