incapsulante citocromo

L'obiettivo generale di questa procedura è incapsulare il citocromo c in sol-gel di silice. Successivamente, processare questi gel in condizioni supercritiche per formare bioaerogeli e utilizzare tali bioaerogeli per riconoscere rapidamente l'ossido nitrico attraverso una reazione in fase gassosa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori del biosensing e della bioanalisi, ad esempio quali condizioni sono necessarie affinché il citocromo c mantenga la sua attività quando incapsulato in un aerogel altamente poroso?

Il significato di questa tecnica consiste nel fatto che si tratta di una procedura semplice per incapsulare una proteina in una matrice in cui le proteine non sono state spesso incapsulate con successo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul citocromo c, potrebbe anche portare a sviluppi procedurali per l'incapsulamento di altre proteine in aerogeli, con possibili implicazioni per futuri dispositivi bioanalitici. Preparare una soluzione con una concentrazione di citocromo c compresa tra 0,7 e millimolare.

Oltre a una soluzione diluita di citocromo c 0,105 millimolare, come descritto nel protocollo testuale. Quindi, etichettare un becher monouso in polipropilene da 50 millilitri, Becher A. Posizionare il becher sul piatto di una bilancia analitica e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per aggiungere 1,88 grammi di tetra metossi silano nel becher. Azzerare la bilancia.

Quindi pipettare 2,88 grammi di metanolo nel Becher A. Coprire il Becher A con parafilm. Successivamente, aggiungere una barretta magnetica in un becher monouso in polipropilene da 50 millilitri etichettato come Becher B e posizionarlo sul piatto di una bilancia analitica. Utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere 0,75 grammi di acqua e 3,00 grammi di metanolo, prima di coprire il Becher B con parafilm.

Iniziare a mescolare il contenuto del becher B su un agitatore magnetico all'interno di una cappa chimica. Successivamente, utilizzare una siringa per aggiungere 5 µL di soluzione di idrossido di ammonio al 28,0-30,0% attraverso il tappo di parafilm nella miscela sotto agitazione. Non appena questo passaggio è completato, aggiungere il contenuto del becher A nel becher B. Mescolare la miscela per 20 minuti mantenendola coperta con parafilm.

Mentre il miscuglio di sol di silice si mescola, procurarsi da otto a nove viali di polipropilene per scintillazione e i rispettivi tappi. Coprire l'estremità del tappo del vial con della pellicola di plastica per creare una superficie piana sulla quale il gel si formerà. Quindi posizionare il tappo sopra di essa.

Assicurarsi che la pellicola di plastica rimanga intatta all'interno del tappo. Disporre le provette con il tappo rivolto verso il basso sul piano del bancone e le estremità aperte rivolte verso l'alto. Quindi tagliare dei pezzi di parafilm che verranno utilizzati per coprire ciascuna provetta.

Al termine del mescolamento del sol, aggiungere 3 millilitri della miscela di sol in un becher pulito monouso da 50 millilitri in polipropilene. Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per aggiungere molto lentamente 500 microlitri della soluzione diluita di citocromo c 0,105 millimolare lungo la parete del becher, nella miscela di sol da 3 millilitri, nell'arco di circa un minuto. Assicurarsi di agitare delicatamente la miscela durante l'aggiunta del citocromo c per evitare la formazione di grossi grumi rossi.

Si prelevino 0,5 millilitri del sol di silice di citocromo c risultante e si aggiungano in ciascuno stampo preparato. Inoltre, si aggiungano 0,5 millilitri del sol di silice semplice rimanente in uno o due stampi da utilizzare come campioni di controllo durante il processo di essiccazione supercritica. Si coprano le aperture degli stampi rivolte verso l'alto con pellicola di parafilm e si ripongano in frigorifero per tutta la notte, o per almeno 12 ore, al fine di ottenere i gel di sol.

Togliere gli stampi dal frigorifero. Rimuovere il parafilm dalla parte superiore di uno stampo contenente un sol-gel di citocromo c, quindi togliere anche il tappo e la pellicola di plastica dalla base. Dopo aver aggiunto un po' di etanolo da un flacone lavavetro nello stampo, utilizzare l'estremità circolare a disco dello stantuffo di una siringa per spingere con attenzione il gel fuori dallo stampo e all'interno di un vial di vetro pulito da 20 millilitri contenente circa 5 millilitri di etanolo.

Ripetere questa procedura di rimozione del gel fino a quando tutti i gel di citocromo c vengono aggiunti al vial e tutti i gel di silice vengono aggiunti a un vial separato. Quindi riempire i vial fino all'orlo con etanolo. Chiudere con tappo e conservare tra 2 e 8 gradi Celsius.

Ogni quattro ore durante la giornata, rimuovere i gel dal frigorifero. Decantare l'etanolo dai gel e sostituirlo con etanolo fresco. Per altri tre giorni, immergere i gel sol bagnati in acetone, decantando e aggiungendo acetone fresco tre volte al giorno.

Raffreddare un apparecchio per l'essiccazione in punto critico a 10 gradi Celsius, impostando la temperatura di un circolatore collegato a otto gradi Celsius. Una volta che l'apparecchio ha raggiunto i 10 gradi Celsius, eseguire un test di tenuta dell'apparecchio come descritto nel protocollo del testo. Dopo aver verificato che l'apparecchio non presenta perdite, versare con attenzione i gel bagnati dai vial per scintillazione, insieme alla maggior parte dell'acetone, nelle tre sezioni lunghe della barca di trasferimento.

Aggiungere ulteriore acetone se necessario, per assicurare che tutti i gel siano completamente immersi nell'acetone prima di sigillare la barchetta all'interno dell'apparato. Aprire la valvola di riempimento dell'apparato per aggiungere anidride carbonica. Una volta osservato, attraverso il finestrino dell'apparato, il depositarsi dell'anidride carbonica sul fondo dell'apparato, aprire la valvola di scarico per rilasciare l'acetone per cinque minuti.

Questa fuoriuscita di acetone verso il basso si verificherà prima che l'apparecchio sia completamente riempito di anidride carbonica. Pertanto, mantenere la valvola di riempimento aperta durante lo svuotamento in modo che l'apparecchio continui a riempirsi. Successivamente, chiudere la valvola di scarico.

Mantenere la valvola di riempimento leggermente aperta. Inizialmente, la miscela che defluisce contiene acqua, poiché l'acetone non è anidro. È possibile il congelamento, l'ostruzione e l'accumulo di pressione nel tubo di scarico.

Se viene rilevato un intasamento, chiudere la valvola di scarico fino a quando l'intasamento non si scioglie. Cinque minuti dopo, aprire la valvola di scarico per altri cinque minuti e regolare la valvola di riempimento in modo che sia sufficientemente aperta da mantenere l'apparecchiatura piena per tutta la durata dello scarico. Trascorsi cinque minuti, chiudere la valvola di scarico e lasciare leggermente aperta la valvola di riempimento.

Quindi, ripetere questo passaggio di drenaggio un'altra volta, cinque minuti dopo. Una volta completati i passaggi di drenaggio, chiudere la valvola di riempimento e drenare il biossido di carbonio liquido, in modo che il livello rimanga visibile appena al di sopra dei rebbi della barca attraverso il finestrino dell'apparato. Successivamente, impostare la temperatura del circolatore collegato all'apparato a 40 gradi Celsius per assicurare che il biossido di carbonio liquido superi la sua temperatura e pressione critica.

Dopo circa 15 minuti, osservare attraverso il finestrino dell'apparato la transizione da liquido a fluido supercritico, mentre il menisco liquido sopra i rebbi della barca scompare. Dopo almeno 15 minuti di tempo di equilibrazione, aprire leggermente la valvola di sfiato per iniziare il rilascio del fluido supercritico. Nel corso di circa 45 minuti, continuare ad aprire in modo incrementale la valvola di sfiato sempre di più, in modo da udire un sibilo costante ma molto lieve del fluido in rilascio e osservare la lenta diminuzione della pressione sul manometro fino a zero.

Dopo che la pressione dell'apparecchiatura è scesa a zero, aprire lo sportello dell'apparecchiatura. Rimuovere il portacampione e utilizzare pinzette per posizionare gli aerogel appena essiccati in vial di vetro puliti.

Gli aerogeli di citocromo c in silice sono ora pronti per essere utilizzati per rilevare la presenza di gas ossido nitrico, dopo essere stati caratterizzati come descritto nel protocollo testuale. Sono mostrati aerogeli che contengono citocromo c a 15 micromolare in tampone fosfato di potassio a 4,4 millimolare, 40 millimolare e 70 millimolare, in confronto con una moneta da dieci cent. Qui mostrato, uno spettro rappresentativo del citocromo c in tampone rispetto al citocromo c incapsulato negli aerogeli in una varietà di condizioni.

Il picco soret del citocromo c a 409 nanometri rimane sostanzialmente invariato all'interno degli aerogel e presenta un caratteristico spostamento verso il rosso quando gli aerogel biologici sono esposti all'ossido di azoto in fase gassosa. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare gel sol-silicei, incapsulare il citocromo c in questi gel sol, ed essiccare questi gel sol compositi fino a ottenere aerogel. Ulteriori informazioni sono disponibili nel protocollo testuale sulla caratterizzazione degli aerogel biologici e sull'uso degli aerogel biologici per rilevare l'ossido di azoto in fase gassosa.