Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

L'obiettivo generale di questo protocollo è differenziare cellule staminali pluripotenti umane in melanociti maturi completamente pigmentati. Questo metodo può aiutare a identificare i fattori chiave durante lo sviluppo dei melanociti. Inoltre, questo protocollo ci permetterà di individuare i fattori alterati durante lo sviluppo delle malattie, nonché di effettuare screening di farmaci importanti nel corso della scoperta di nuovi farmaci.

Il principale vantaggio di questo protocollo è che ci permette di produrre un elevato numero di melanociti completamente pigmentati. Mentre l'isolamento di melanociti da pazienti di solito porta a un numero relativamente basso di cellule. Dopo aver frazionato e congelato la proteina gelatinosa, scongelare e risospendere un'aliquote di un millilitro in 19 millilitri di DMEM f12.

Quindi aggiungere cinque millilitri di questa miscela in una singola piastra per colture cellulari da 10 centimetri. Dopo aver preparato diverse piastre di questo tipo, procedere con l'incubazione per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, iniziare a preparare le piastre rivestite con PO, laminina e fibronectina aggiungendo prima PBS contenente 15 microgrammi per millilitro di PO in una piastra per colture.

Quindi incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato. Successivamente, aspirare la soluzione e lavare le piastre tre volte con PBS 1X. Proseguire con la rivestimento aggiungendo 10 millilitri di PBS contenenti 1 microgrammo per millilitro di laminina 1 da topo e 2 microgrammi per millilitro di fibronectina.

Quindi, incubare le piastre come descritto in precedenza. Per iniziare, aggiungere 0,1% di gelatina in PBS in una piastra da 10 centimetri. Lasciare in temperatura ambiente per cinque minuti.

Mentre questa piastra viene rivestita, posizionare i fibroblasti embrionali di topo congelati, o MEFs, in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per scongelarli rapidamente. Successivamente, aspirare la gelatina dalla piastra e seminare i MEFs a una densità di circa 50.000 cellule per centimetro quadrato in DMEM integrato con il 10 percento di siero fetale bovino. Dopo aver incubato la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius, aspirare il mezzo e lavare la piastra di MEFs preparata con PBS 1X.

Procedere aggiungendo 10 millilitri di mezzo per hESC precedentemente preparato, contenente cellule staminali pluripotenti umane abbreviate come hPSCs, in una piastra da 10 centimetri. Dopo aver seminato le cellule a una densità di 5 milioni di cellule per piastra, incubare le piastre a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5 percento. Procedere alimentando le cellule ogni giorno con 10 millilitri di mezzo fresco per hESC.

Prima di iniziare la differenziazione, ispezionare la piastra alla ricerca di colonie che presentano cellule differenziate, bordi irregolari o centri trasparenti. Utilizzando un microscopio stereoscopico all'interno di una cappa a flusso laminare, staccare meccanicamente con una pipetta qualsiasi colonia irregolare. Per eseguire il rivestimento con proteine gelatinose come Matrigel, aliquotare inizialmente la proteina in porzioni da un millilitro e congelarle, al fine di evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Quindi, scongelare e risospendere un'aliquota congelata di un millilitro con 19 millilitri di DMEM F12. Procedere quindi a piastrare cinque millilitri di questa miscela su una piastra da 10 centimetri e incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare immediatamente la proteina gelatinosa prima di piastrare le cellule e lavare con DMEM F12. Mentre questa piastra viene rivestita, selezionare una piastra in cui le hPSC presentino una confluenza di circa l'80%.

Procedere all'aspirazione del mezzo delle cellule staminali embrionali umane. Quindi lavare le cellule con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsina-EDTA 0,05% alla piastra.

Procedere agitando energicamente la piastra in modo orizzontale per due minuti, fino a quando, osservando al microscopio, si noterà che i MEF iniziano a staccarsi come cellule singole. Durante questo periodo, ci si aspetta che le colonie di hPSC rimangano attaccate alla piastra. Procedere quindi all'aspirazione della tripsina una volta che i MEF si sono staccati, ma prima che le colonie di hPSC si siano distaccate.

Quindi, aggiungere alla piastra 10 millilitri di mezzo hESC contenente 10 micromolari di Y-27632 diidrocloruro, un inibitore della ROCK. Successivamente, staccare le cellule pipettando su e giù sopra le colonie. Poi tornare alla piastra con una proteina gelatinosa e aspirare la soluzione.

Lavare questa piastra con DMEM F12 per rimuovere eventuali aggregati. Successivamente, seminare le hPSC in un rapporto di 1 a 2. Poi, aggiungere alla piastra il mezzo per hESC contenente 10 micromolar di Y-27632 diidrocloruro fino a un volume di 10 millilitri.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Nutrire le cellule quotidianamente con mezzo integrato con inibitore della ROCK. Quando le hPSC raggiungono una confluenza dell'80%, procedere all'avvio della differenziazione neurale e indicare questo punto temporale come Giorno 0.

Per avviare la differenziazione, coltivare le cellule al Giorno 0 e al Giorno 1 con 10 millilitri di mezzo di differenziazione KSR contenente 100 nanomolar di LDN-193189, un inibitore di BMP, e 10 micromolar di SB 431542, un inibitore di activina e Nodal. Proseguire al Giorno 2 sostituendo il mezzo con uno contenente le stesse concentrazioni degli inibitori di BMP e di activina e Nodal, più 3 micromolar di CHIR99021, un agonista del pathway Wnt. Successivamente, al Giorno 3, nutrire le cellule con mezzo di differenziazione KSR, integrato soltanto con 10 micromolar di SB 431542 e 3 micromolar di CHIR99021.

Dopo aver preparato una miscela di mezzo di differenziamento KSR al 75% e mezzo di differenziamento N2 al 25%, contenente anche tre micromoli dell'agonista Wnt, aggiungere alle cellule 15 millilitri di questo liquido al Giorno 4 e 5. Successivamente, ai Giorni 6 e 7, aggiungere alle cellule 15 millilitri di mezzo costituito da mezzo di differenziamento KSR al 50% e mezzo di differenziamento N2 al 50%, integrato anche con tre micromoli di CHIR99021, 25 nanogrammi per millilitro di BMP4 e 100 nanomoli di EDN3.

Quindi, nei Giorni 8 e 9, nutrire le cellule con 20 millilitri di mezzo di differenziamento KSR al 25% e mezzo di differenziamento N2 al 75%, integrati con le stesse concentrazioni di fattori utilizzate nei Giorni 6 e 7. Procedere continuando il differenziamento neurale al Giorno 10, nutrendo le cellule con 20 millilitri di mezzo di differenziamento N2 contenente tre micromolar di CHIR99021, 25 nanogrammi per millilitro di BMP4 e 100 nanomolar di EDN3. Al Giorno 11, aspirare la soluzione dalle piastre precedentemente rivestite con PO lamanin 1 e fibronectina.

Quindi lasciare le piastre scoperte in una cappa a flusso laminare per circa 10-15 minuti, permettendo loro di asciugarsi completamente. Procedere rimuovendo il mezzo dalle cellule del giorno 11 e lavandole con PBS. Successivamente, aggiungere quattro millilitri di soluzione per il distacco cellulare alla piastra e incubare a 37 gradi Celsius per 25 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere cinque millilitri di mezzo completo per melanociti nella piastra e risospendere le cellule pipettando manualmente su e giù fino a quando non si sono staccate dalla piastra. Trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri e centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 G. Dopo il conteggio cellulare mediante esclusione al Triypan Blue e con un emocitometro, risospendere le cellule nel mezzo completo per melanociti a una densità di 2×10⁶ cellule per millilitro.

Deporre gocce da 10 microlitri della sospensione cellulare sulle piastre essiccate e rivestite. Assicurarsi che le gocce siano vicine tra loro ma non a contatto, con bordi ben definiti e che non si espandano. Per permettere l'adesione delle cellule, lasciare le gocce a temperatura ambiente per 10-20 minuti.

Successivamente, aggiungere lentamente 10 millilitri di mezzo completo per melanociti alla piastra avendo cura di non disturbare le cellule aderenti. Quindi, trasferire la piastra nell'incubatrice. Nutrire le cellule ogni due o tre giorni con mezzo completo per melanociti.

E si prevede di osservare la pigmentazione in gruppi di cellule entro la fine della prima settimana. Una volta alla settimana, sottoculturare le cellule dissociandole prima con una soluzione di distacco cellulare, come descritto in precedenza. Dopo aver raccolto e centrifugato le cellule, lavarle due volte con mezzo neurobasale semplice.

Quindi, ripiastrare le cellule in un rapporto di uno a sei in mezzo completo per melanociti su piatti rivestiti con PO, lamineina 1 e fibronectina. Dopo circa 30 giorni di differenziamento, le cellule appariranno fortemente pigmentate, caratteristica facilmente visualizzabile quando le cellule sono piastre a elevata densità o quando vengono pellettizzate durante il passaggio.

Qui è mostrata un'immagine in campo chiaro di cellule provenienti da una linea di cellule staminali embrionali umane transgeniche psox10 GFP, coltivate fino al Giorno 11 del protocollo di differenziamento descritto, prima del loro reimpiego. In queste colture sono evidenti scure formazioni lineari ben definite di cellule. Quando queste colture sono state analizzate per il segnale GFP, le formazioni scure si sono rivelate arricchite di cellule positive per sox10.

Dato che sox10 è un fattore di trascrizione upregolato dalle cellule staminali della cresta neurale e mantenuto nei melanoblasti, questi risultati suggeriscono che al giorno 11 questo metodo di differenziazione arricchisce le cellule che daranno origine ai melanociti. A conferma di ciò, al giorno 20 del protocollo le colture contenevano melanociti non pigmentati, in maturazione e completamente maturi e pigmentati. Al giorno 25, negli stessi tipi di colture si osservano cellule dello stesso tipo.

La presenza di melanociti in via di maturazione e pigmentati in questi preparati viene confermata mediante colorazione con due proteine coinvolte nella produzione di melanina. TYRP2, che funge da marcatore sia per i melanoblasti che per i melanociti, e TYRP1, che è un marcatore specifico per melanociti in stadio avanzato, espresso soltanto nei melanociti pigmentati. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere utilizzato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane in melanociti maturi completamente pigmentati in 25 giorni.

Il protocollo procede attraverso lo sviluppo normale dei melanociti passando prima attraverso lo stato di cresta neurale e successivamente attraverso la fase di melanoblasto.