Name: Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Scopri un protocollo per differenziare cellule staminali pluripotenti umane in melanociti maturi e pigmentati attraverso stadi intermedi di cresta neurale. Questo metodo consente la produzione su larga scala per studi sullo sviluppo cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per i ricercatori di melanoma dal Joanna M. Nicolay Foundation e dal National Institutes of Health sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Premio Research Service F31. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato attraverso sovvenzioni dal NYSTEM e l&#39;iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).

NOTA: Il protocollo di melanociti qui delineato è stato dimostrato da Mica et al. 1. Preparazione del terreno di coltura, patinata Piatti e manutenzione di hPSCs <ol><li> Media Preparazione Nota: Conservare tutto media a 4 ° C al buio fino a 2 settimane. Filtro di medie per la sterilizzazione. <ol><li> Preparare DMEM / 10% FBS. Mescolare 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina. Filtro per la sterilizzazione. </li><li> Preparare hESC-media. Mescolare 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 10 ml minimo indispensabile soluzione MEM aminoacidi, 1 ml di beta-mercaptoetanolo, e 5 ml Pen / Strep. Dopo filtrazione aggiungere 10 ng / ml FGF-2. </li><li> Preparare medio KSR-differenziazione: Mescolare 820 ml Knockout DMEM, 150 ml di KSR, 10 ml di L-glutammina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimo indispensabile soluzione aminoacidi e 1 ml di β-mercaptoetanolo. Filtro per la sterilizzazione. </li><li> Preparare medio N2-differenziazione. Sciogliere 12 g DMEM / F12 in polvere in 980 ml ​​dH 2 O. Aggiungere 1,55 g di glucosio, 2 g di sodio bicarbonato e 100 mg apo transferrina umana. Mescolare 2 ml dH 2 O con 25 mg di insulina umana e 40 microlitri 1 N NaOH; una volta sciolto, aggiungere il composto al mezzo. Aggiungere 100 ml dicloridrato putrescina, 60 microlitri selenite, 100 ml progesterone. Portare il volume finale di 1 litro con dH 2 O prima della filtrazione. </li><li> Preparare medio melanociti completa. Combinare il 50% medio Neurobasal, il 30% DMEM bassa di glucosio, e il 20% MCDB201. Per questo componente aggiuntivo: 0,8% ITS +, 250 Nm L-glutammina, 100 micron Acido ascorbico (L-AA), 50 ng / ml tossina colerica, 50 ng / ml SCF, 0,05 micron desametasone, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . filtro sterile quindi aggiungere i reagenti rimanenti: 2% B27 supplemento, 25 ng / ml BMP4, 3 micron CHIR99021, 500 micron cAMP. </li></ol></li><li> Rivestimento di cultura Piatti <ol><li> Effettuare rivestimento utilizzando proteine ​​gelatinosa come Matrigel. All&#39;apertura, aliquota e congelare Matrigel in 1 ml parti per evitare il congelamento ripetitivo disgelo cycles. Scongelare e risospendere un 1 ml un&#39;aliquota congelato con 19 ml DMEM / F12. Tavola 5 ml su un piatto 10 cm. Incubare i piatti per 1 ora a RT. Aspirare la proteina gelatinosa immediatamente prima placcatura le cellule e lavare con DMEM / F12. </li><li> Effettuare il rivestimento utilizzando Poli-L ornitina hydrobromide / mouse laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). piatto Cappotto con PBS contenente 15 mg / ml Poly-L ornitina bromidrato. Incubare O / N a 37 ° C in un incubatore umidificato. Aspirare la soluzione e lavare le piastre con PBS per tre volte prima del rivestimento con PBS contenente 1 mg / ml di mouse laminina-I e 2 mg / ml fibronectina. Incubare le stoviglie O / N a 37 ° C in un incubatore umidificato. <ol><li> Prima di placcatura cellule, aspirare la soluzione e lasciare le piastre asciugare completamente senza coperchio nella cappa coltura tissutale. Lasciare le piastre ad asciugare per circa 10-15 min. Nota: I piatti sono asciutto e pronto per la placcatura cella quando strutture cristalline affiorano ad occhio. il plates possono essere mantenuti con PBS contenente LAM / FN in incubatrice per due settimane, fino a quando il liquido non evapori. Le piastre possono essere conservati essiccati a temperatura ambiente per qualche ora. </li></ol></li></ol></li><li> Manutenzione di hPSCs Nota: hPSCs sono mantenuti sul 0,1% di gelatina e mouse mitoticamente inattivato fibroblasti embrionali (MEF) in hESC-media. Le cellule devono essere divisi ogni 6-8 giorni. <ol><li> Coat un piatto 10 centimetri con 0,1% di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Scongelare MEF congelati rapidamente in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Aspirare la gelatina e piastra le cellule. MEF piastra a una densità di ~ 50.000 cellule / cm 2 in DMEM / 10% FBS. Incubare MEF a 37 ° CO / N prima di aggiungere hPSCs. </li><li> Aspirare il% FBS DMEM / 10 dalla piastra MEF preparato, lavare piatto con PBS e aggiungere 10 ml di hESC-media con hPSCs. Passaggio le hPSCs in un rapporto di 1: 5/10 seconda densità prima passaging. Nota: Se i hPSCs vengono scongelati o diversi passaggi come singole cellule, supcomplemento con 10 mM Y-27632 dicloridrato (Rocki) fino al primo passaggio. </li><li> Nutrire le cellule quotidianamente con fresco 10 ml di hESC-media. </li><li> Prima di iniziare una differenziazione rimuovere eventuali colonie pluripotenti che sembrano contenere cellule differenziate, bordi irregolari, o centri trasparenti 28. Meccanicamente rimuovere e aspirare le colonie irregolari con una pipetta sotto una cappa a flusso laminare con un microscopio da dissezione. </li></ol></li></ol> 2. placcatura di hPSCs per la differenziazione Nota: le condizioni di differenziazione sono descritti per 10 piatti cm. <ol><li> Preparare 10 cm piatti Matrigel prima di iniziare la differenziazione come descritto al punto 1.3.1. </li><li> Quando placcatura hPSCs per una differenziazione iniziano con un piatto di hPSCs ad una densità pronto per il passaggio (~ 80% confluenti) aspirare il hESC-media, lavare con PBS e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA alle cellule. </li><li> Agitare vigorosamente il horizontall piattoy per 2 minuti, mentre la visualizzazione al microscopio fino a quando il MEF sollevare come singole cellule. Le colonie HPSC devono rimanere attaccati come colonie. </li><li> Aspirare il tripsina dopo i MEF hanno sollevato, ma prima che le colonie hPSCs staccano. </li><li> Aggiungere 10 ml di hESC-mezzo contenente 10 mM Y-27632 dicloridrato alla piastra e staccare le cellule pipettando su e giù per le colonie. </li><li> Aspirare la soluzione Matrigel dal 10 centimetri piatto preparato al punto 2.1 e lavare con DMEM / F12 per eliminare grumi. Piastra le hPSCs in un rapporto 1: 2 sulla piastra Matrigel. Aggiungere hESC-mezzo contenente 10 mM Y-27632 dicloridrato fino a 10 ml. Incubare a 37 ° CO / N. Nota: Questo rivestimento dovrebbe tradursi in circa 100.000 cellule / cm 2. </li></ol> 3. Induzione di differenziazione neurale Nota: La differenziazione deve essere iniziata (giorno 0) quando le hPSCs sono 80% confluenti. Le cellule possono essere alimentati quotidianamente con hESC-mediumcontenente 10 mM Y-27632 dicloridrato fino all&#39;inizio della differenziazione. <ol><li> Il giorno 0 e 1 giorno, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 100 nM LDN193189 e 10 micron SB431542. </li><li> Il giorno 2, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 100 nM LDN193189, 10 micron SB431542 e 3 micron CHIR99021. </li><li> Il giorno 3, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 10 mM SB431542 e 3 micron CHIR99021. </li><li> Nei giorni 4 e 5 nutrire le cellule con 15 ml di 75% medio KSR-differenziazione e il 25% di media N2-differenziazione contenente 3 micron CHIR99021. Nota: non essere allarmato per vedere una grande quantità di morte cellulare in termini di cellule galleggianti. Questo è normale e prevedibile. </li><li> Nei giorni 6 e 7 di alimentazione delle cellule con 15 ml di 50% medio KSR-differenziazione e il 50% di media N2-differenziazione entrambi contenenti 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3. </li><li> Nei giorni 8e 9 nutrire le cellule con 20 ml di 25% medio KSR-differenziazione e il 75% di media N2-differenziazione entrambi contenenti 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3. </li><li> Nei giorni 9 e 10 preparare piatti PO / Lam / FN, come indicato al punto 1.2.2 per ri-placcatura delle cellule il giorno 11. </li><li> Il giorno 10 celle di alimentazione con 20 ml di terreno N2-differenziazione contenente 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3. </li></ol> 4. replating in gocce per NC Specification <ol><li> Il giorno 11 aspirato Lam / FN dal Po / LAM / piastre preparate FN e asciugare completamente. </li><li> Rimuovere media a partire dal giorno 11 cellule, lavare con PBS e aggiungere la soluzione di distacco delle cellule 4 ml come Accutase per 10 cm piatto. Incubare per 25 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di terreno completo Melanocita al piatto e risospendere le cellule pipettando manualmente su e giù con una pipetta 10 ml fino a quando tutte le celle hanno tolto la piastra. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 ml. </li><li> Gira lacellule scorrimento per 5 minuti a 200 xg e risospendere le cellule a 2 x 10 6 cellule per ml in mezzo completo Melanocyte. Contare le cellule utilizzando l&#39;esclusione blu trypan su un emocitometro o tecnica equivalente. </li><li> goccioline piastra 10 microlitri vicine tra loro (senza toccarle) sulle secche PO / Lam / FN 10 cm piatti. Se la piastra è stata sufficientemente asciugato, le goccioline dovrebbero essere ben bordi definiti e non correre. Nota: Questo crea un ambiente locale ad alta densità per le cellule, il che è importante quando replating cellule, mantenendo camera entro il piatto per l&#39;espansione. </li><li> Lasciare le goccioline riposare a temperatura ambiente per 10-20 minuti per consentire alle cellule di aderire, poi lentamente (per non disturbare le cellule attaccate) aggiungere 10 ml di terreno pieno melanociti. Spostare piatto per l&#39;incubatore. </li></ol> 5. Espansione melanocita Progenitori <ol><li> Continuare l&#39;alimentazione con il mezzo Melanocyte completa ogni 2 o 3 giorni. Nota: Pigmentazione dovrebbe iniziare ad essere visibile well&#39;ambito gruppi di cellule dalla fine della prima settimana e diventare molto chiaro dalla seconda settimana. Osservando la lastra su uno sfondo bianco, quale un foglio di carta di discernere questi primi piccoli ammassi oscuri. Le cellule saranno diventano progressivamente più pigmentata nel tempo, fino a quando l&#39;intera piastra è uniformemente pigmentata (vedere Figura 2B). </li><li> cellule Passage una volta a settimana con un rapporto di circa 1: 6 (placcatura come gocce non è più necessario in questa fase). Utilizzare Accutase dissociare le cellule e lavare due volte con il mezzo Neurobasal pianura prima di ri-placcatura in media completa melanociti. Mantenere le cellule su PO / LAM / piastre FN. Nota: Abbiamo scoperto che il medium completa Melanocyte è più adatto per il mantenimento e l&#39;espansione hESC e melanociti iPSC-derivati. Tuttavia, le cellule possono essere coltivate in terreno brevemente M254 disponibile in commercio ma i media semplificato aumenta il rischio di cellule morenti e sollevamento dalla piastra. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi in conflitto di rivelare.

Per la differenziazione di successo dei melanociti da hPSCs i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Innanzitutto, è essenziale lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. Inoltre, è importante iniziare con pluripotenti, hPSCs completamente indifferenziate; se la popolazione di partenza contiene cellule differenziate del rendimento invariabilmente cadere come gli agenti inquinanti non possono essere indirizzate verso i melanociti e può anche distruggere ulteriormente le celle cor...

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) forniscono una piattaforma per imitare la differenziazione normale in un modo scalabile per la modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie di sostituzione cellulare 1-6. Di particolare interesse, hPSCs aprono strade per studiare difficili da isolare o tipi di cellule rare / transitori in cui i campioni dei pazienti sono scarse. Cellule staminali pluripotenti Inoltre, indotte (iPSCs) permettono ai ricercatori di studiare lo sviluppo e la modellazione della malattia in modo specifico paziente a svelare i meccanismi unici 1,2,7-11. Il protocollo precedentemente pubblicato per la differenziazione dei melanociti da hPSCs richiede fino a 6 settimane di differenziazioni e coinvolge le cellule di coltura con medium condizionato dalle cellule L-Wnt3a 12. Il protocollo prima presentata da Mica et al. E qui descritto produce cellule pigmentate in tre settimane e rimuove l&#39;ambiguità e incoerenze associate a mezzo condizionato. I melanociti are derivati ​​dalla cresta neurale, una popolazione di cellule migratoria unici per vertebrati. La cresta neurale è definita durante gastrulation e rappresenta una popolazione di cellule sul bordo della piastra neurale, al confine tra la ectoderma neurale e non neurale. Durante neurulazione, il tessuto nervoso evolve da una piastra neurale per formare pieghe neurali, che convergono sulla linea mediana dorsale, con conseguente 13,14 tubo neurale. Le cellule della cresta neurale emergono dalla piastra tetto del tubo neurale, di fronte alla notocorda, e subiscono una transizione epitelio mesenchimale prima di migrare via per dare luogo ad una popolazione eterogenea di cellule differenziate. I destini delle cellule della cresta sono definite in parte dalla posizione anatomica della lamiera del tetto lungo l&#39;asse del corpo dell&#39;embrione. Derivati ​​di cellule della cresta neurale includono linee caratteristiche di entrambi mesoderma (cellule muscolari lisce, osteoblasti, adipociti, condrociti) e le cellule ectoderma (melanociti, Schwann cells, neuroni) 14. Le cellule staminali della cresta neurale upregulate il fattore di trascrizione SOX10 e possono essere isolate da cellule di fluorescenza-attivato l&#39;ordinamento con anticorpi anti p75 e HNK1. Le cellule della cresta neurale destinato a diventare melanociti passare attraverso una fase melanoblast e upregulate KIT e MITF (fattore di trascrizione microftalmia-associato) 6,21 MITF è un regolatore Master di Sviluppo melanociti ed è un fattore di trascrizione responsabile del controllo gran parte dello sviluppo melanociti 22- 24. melanoblasts umani migrano allo strato basale dell&#39;epidermide dove risiedono sia nel ringrosso capelli o circondato da cheratinociti nell&#39;epidermide (unità formanti pigmentazione) da utilizzare come precursori delle maturi, melanociti pigmentati. La differenziazione e la maturazione delle melanoblasts in melanociti pigmentati avviene in concomitanza con la colonizzazione del bulbo pilifero e l&#39;espressione della filiera di produzione di melanina (TYRP1, TYR, OCA2 ePMEL) 25,26. Isolare melanociti umani e melanoblasts da pazienti è costoso, difficile e limitante nella quantità. Questo protocollo consente ai ricercatori di differenziare hPSCs (indotta o embrionali) in melanociti o precursori melanociti in un metodo ben definito, rapida, riproducibile, scalabile ed economica, senza l&#39;ordinamento delle cellule. Il protocollo è stato utilizzato in precedenza per identificare i difetti malattie specifiche quando differenziare iPSCs da pazienti con disturbi della pigmentazione.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>apo transferrina umana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico (L-AA)</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>B27 (integratore B27)</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-bp</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>4423</td><td>6 mM</td></tr><tr><td>Tossina colera</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>cAMP (AMP ciclico)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>50 &mu; M</td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11985-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1133--032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 polvere</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>EDN3 (Endotelina-3, umana)</td><td>American Peptide Company</td><td>88-5-10B</td><td>100 &mu; M</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>200 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>di gelatina (PBS senza Mg/Ca)</td> <td>in casa</td><td></td><td>0,1% in PBS</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina umana</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Universal Culture Supplement Premix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>KSR (sostituzione del siero knockout)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Matrice Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Dissolvenza 1:20 in DMEM/F12</td></tr><tr><td>MCDB201 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>MEM soluzione minima di aminoacidi essenziali</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-080</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali di topo (7 milioni di cellule/fiala)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-8105M</td><td></td></tr><tr><td>Laminina-I di topo</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicina</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml</td></tr><tr><td>Poly-L Omithin bromidrato</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>15 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>0,032 g in 100 ml 100% etanolo</td></tr><tr><td>Putrescina dicloridrato</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (FGF umano ricombinante basico)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1814</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SCF (Fattore di cellule staminali, umano ricombinante)&nbsp;</td><td>Peprotech Inc.</td><td>300-07</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>TYRP1 (G-17) Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>10443</td><td>1:200</td></tr><tr><td>TYRP2 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>74073</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1254</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) rappresentano una piattaforma per studiare lo sviluppo umano in vitro sia in condizioni normali che di malattia. I ricercatori possono dirigere la differenziazione delle hPSC nel tipo di cellula di interesse manipolando le condizioni di coltura per ricapitolare i segnali osservati durante lo sviluppo. Uno di questi tipi di cellule è il melanocita, una cellula produttrice di pigmenti di origine cresta neurale (NC) responsabile della protezione della pelle dall'irradiazione UV. Questo protocollo rappresenta un'estensione di un protocollo di differenziazione in vitro delle creste neurali attualmente disponibile dalle hPSC per differenziare ulteriormente le NC in melanociti completamente pigmentati. I precursori dei melanociti possono essere arricchiti dal protocollo Neural Crest tramite un'esposizione temporizzata agli attivatori della segnalazione WNT, BMP e EDN3 in condizioni di doppia inibizione SMAD. I precursori dei melanociti risultanti vengono quindi purificati e maturati in melanociti completamente pigmentati mediante coltura in un mezzo selettivo. I melanociti risultanti sono completamente pigmentati e si colorano in modo appropriato per le proteine caratteristiche dei melanociti maturi.

Questo protocollo fornisce un metodo per derivare completamente pigmentate, melanociti adulte hPSCs in un alimentatore-libera, economicamente efficiente e riproducibile modo in vitro. In contrasto con il precedentemente stabilito Fang et al. Protocollo per melanociti HPSC-derivati, il protocollo descritto non richiede terreno condizionato e diminuisce il tempo richiesto. Il protocollo Fang et al. Utilizzato mezzo condizionato da una linea di cellule murine Wnt3...

Questo lavoro descrive un protocollo in vitro la differenziazione di produrre pigmentate, i melanociti maturi da cellule staminali pluripotenti umane tramite una cresta neurale e melanoblast fase intermedia utilizzando un protocollo senza alimentatore 25 giorni.

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è differenziare cellule staminali pluripotenti umane in melanociti maturi completamente pigmentati. Questo metodo può aiutare a identificare i fattori chiave durante lo sviluppo dei melanociti. Inoltre, questo protocollo ci permetterà di individuare i fattori alterati durante lo sviluppo delle malattie, nonché di effettuare screening di farmaci importanti nel corso della scoperta di nuovi farmaci.Il principale vantaggio di questo protocollo è che ci permette di produrre un elevato numero di melanociti completamente pigmentati. Mentre l'isolamento di melanociti da pazienti di solito porta a un numero relativamente basso di cellule. Dopo aver frazionato e congelato la proteina gelatinosa, scongelare e risospendere un'aliquote di un millilitro in 19 millilitri di DMEM f12.Quindi aggiungere cinque millilitri di questa miscela in una singola piastra per colture cellulari da 10 centimetri. Dopo aver preparato diverse piastre di questo tipo, procedere con l'incubazione per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, iniziare a preparare le piastre rivestite con PO, laminina e fibronectina aggiungendo prima PBS contenente 15 microgrammi per mil

feeder-free-derivation-melanocytes-from-human-pluripotent-stem

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.

Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

Cresta neurale (NC), le cellule derivate da cellule umane staminali pluripotenti (HPSC) hanno un grande potenziale per modellare lo sviluppo umano e la malattia e per le terapie di sostituzione cellulare. Qui, un libero adattamento-feeder della tuttora ampiamente...

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare il protocollo per la riprogrammazione dei linfociti infiltranti il tumore del melanoma in cellule staminali pluripotenti indotte.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Questo documento riporta che l'aggiunta di Y-27632 al mezzo TIVA può aumentare significativamente la resa dei melanociti dai tessuti della pelle adulti.

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

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Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

Scopri un protocollo per differenziare cellule staminali pluripotenti umane in melanociti maturi e pigmentati attraverso stadi intermedi di cresta neurale. Questo metodo consente la produzione su larga scala per studi sullo sviluppo cellulare.

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

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