Name: Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Scopri come coltivare cellule epiteliali nasali da bambini e riprogrammarle in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Questo metodo non invasivo permette di studiare l'asma e le malattie respiratorie.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il pluripotenti cellule staminali strumento e la Confocale Imaging Nucleo presso l&#39;Ospedale dei bambini di Cincinnati. Questo lavoro è stato sostenuto da R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana istituzioni. 1. Campionamento la mucosa nasale NOTA: ottenere campioni da soggetti che sono liberi di segni di infezione virale delle vie respiratorie. <ol><li> Preparare un 15 ml fresca conica prima della visita partecipante e aggiungere 2 ml BEGM (epiteliali bronchiali Media cellulare crescita) più 20 ml sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). </li><li> spazzola di citologia aperto poco prima di prendere il campione, ed essere sicuri di mantenere il pennello sterile e non toccare a tutte le superfici oltre alle superfici nasali. </li><li> Chiedi partecipante a stare fermo e inclinare la testa verso soffitto. Avere più piccolo o più figli irrequieti siedono sulle loro mani e / o sdraiati per evitare di schiacciare la spazzola via. </li><li> Puntare pennello nella parte posteriore del naso dove il passaggio si restringe (Sembra un piccolo buco nero). Far scorrere la spazzola verso il basso e ruotare i polsi come il pennello viene rimosso dal Nostril. </li><li> Mettere pennello in conica e immergere in BEGM. Tagliare pennello in eccesso e rimettere il tappo sul tubo. NON FARE VORTEX. NOTA: Se il partecipante è disposto, ottenere una seconda spazzola nello stesso modo ma nella seconda narice. Ottenere una spazzolatura di entrambe le narici si tradurrà in una maggiore probabilità che il campionamento avrà successo. Campionamento stessa narice può provocare sanguinamento e non sarà probabilmente migliorare il campione. </li><li> I campioni più vicino a 37 ° C possibile durante il trasporto utilizzando un becher con acqua calda. </li></ol> 2. numero di celle e Cytospin <ol><li> Agitare delicatamente il pennello in BEGM e prendere 10 ml di campione per un conteggio di cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere 10 ml di una macchia live / morti e contare solo vivere cellule al microscopio. </li><li> Introdurre 50 ml di campione e portare a 200 ml con PBS 1x. Aggiungi a imbuto cytospin attaccato al vetrino e far girare a 300 giri al minuto per 2 minuti. Lasciate scorrere secca O / N e macchia scivolo followinle istruzioni del produttore g. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente al buio. </li><li> Far scorrere macchia con Hema 3 Stain <ol><li> Trasferire ogni soluzione (Hema fissativo, la luce blu; Hema 3 Soluzione, rosa; e Hema 3 Solution II, blu scuro) in un piatto colorazione; Mantenere coperto quando non in uso. Inserire diapositive in slitta barca colorazione </li><li> Immergere i vetrini continuamente in fissativo per 30 secondi, quindi permettono in eccesso di defluire. Dip scorre continuamente in Solution I per 30 secondi, quindi lasciare in eccesso di defluire. Dip scorre continuamente in Solution II per 30 secondi, quindi lasciare in eccesso di defluire </li><li> Risciacquare con acqua deionizzata fino a quando l&#39;acqua è pulita. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente al buio </li></ol></li><li> Guardate slitta sotto le cellule al microscopio e conteggio, determinare la percentuale di cellule epiteliali. Dovrebbe essere del 90% o superiore, se il campionamento è buono. </li></ol> 3. Cellule Seeding NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in una cultura adeguata e certificata dei tessutiCappuccio con tecnica sterile. <ol><li> Piastre cappotto con Bovine Collagen Dermal (BDC), digitare 1. Aggiungere 0,5 ml di 3 mg / ml BDC diluiti in 49,5 ml di PBS 1x. Preparare meno se verranno utilizzati solo pochi piatti. Coat un pallone T25 con 2 ml BDC e incubare sterile cappa O / N oa 37 ° C per 2 ore, se necessario. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aspirare il liquido rimanente. Esporre fiaschi a luce UV per 30 minuti in cappa sterile. palloni Conservare fino a un mese a 4 ° C, ma portarli a RT o 37 ° C prima della semina cellule. </li><li> Mantenere pennello e le cellule in BEGM a 37 ° C fino al momento di seminare. Delicatamente pennello swish all&#39;interno conica, ma non fare vortice. <ol><li> Tavola 7 x 10 5 cellule in un pallone T25. Se c&#39;è meno, utilizzare un contenitore più piccolo, come un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Questa piastra dimensioni richiede circa 3 x 10 5 cellule. NOTA: Se non ci sono questo molte cellule, non è consigliabile per continuare. </li></ol></li><li> Sotto una cappa sterile, prendere pennello di tubo e gente ruotare pennello sulla superficie del pallone rivestito, facendo attenzione a non graffiare il rivestimento. Scartare pennello in un contenitore adeguato rischio biologico. </li><li> Lentamente pipettare le cellule rimanenti BEGM fuori dalla conica e nel pallone T25. Osservare le cellule sotto il microscopio. Verrà osservato un numero di cellule galleggianti e ci possono essere alcuni detriti dal naso, che è accettabile in questa fase (Figura 3A). </li></ol> Cultura 4. cellulare <ol><li> Dopo la semina delle cellule, far loro accontentarsi di 48 ore senza interruzioni (Figura 3). Dopo 48 ore, lentamente e delicatamente con 2 ml di caldo BEGM e 20 ml sterile penicillina / streptomicina / Fungizone (P / S / F). NOTA: NON aspirare l&#39;originale 2 ml di media. </li><li> Al 4 ° giorno dopo la semina, aspirare accuratamente tutto il liquido, e sostituirlo con 4 ml freschi, riscaldati BEGM più 1x Pen / Strep (Fungizone non è più necessario). Modificare i media ogni due giorni e valutare le cellule per attaccaremento, la crescita, e la confluenza. Quando le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza, di solito in 2-3 settimane, sono pronti per essere diversi passaggi. </li><li> Un pallone T25 (circa 2,5 x 10 6 cellule quando confluenti) possono essere diversi passaggi in tre palloni T25 o di un pallone T75. Dopo il primo passaggio, le cellule devono essere robusti e sani, raggiungendo confluenza circa ogni tre giorni. </li></ol> 5. Le cellule passaging <ol><li> Aspirare delicatamente il supporto dal piatto. Aggiungere 1 ml di soluzione 0,05% tripsina per bombola T25 alla piastra e posto in incubatrice per circa 4 min, o fino a quando le cellule si staccano dal piatto. Controllare il livello di distacco delle cellule ogni 2 minuti e non lasciare tripsina su più di 10 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di tripsina soluzione neutralizzante (TNS), o un supporto siero contenente per neutralizzare l&#39;enzima. Rimuovere tutto il liquido e le cellule dal pallone e mettere in un tubo da 15 ml. </li><li> Centrifugare a 200 xg (accelerazione 0 decelerazione 0) per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule. Aspirare SupernaTant cellule e risospendere in BEGM + P / S nel volume richiesto per i nuovi palloni (4 ml per un pallone T25, 10 ml per un pallone T75) </li><li> Eseguire conteggio delle cellule con una macchia Live / Dead come descritto sopra (2.1). Aggiungere la quantità appropriata di BEGM e cellule per i fiaschi rivestiti e tornare alla incubatore. Mantenere come dettagliato sopra o cryopreserve a congelamento medio (70% BEGM, 20% FBS e 10% DMSO) ad una concentrazione di 0,5-2 x 10 6 cellule per ml. </li></ol> 6. Riprogrammazione a iPSCs NOTA: Prima di generare iPSCs, assicurare il rispetto di tutte le prescrizioni istituzionali che regolano la generazione e l&#39;uso di iPSCs umani. tecnica sterile è particolarmente importante per le culture IPSC, come terreno di coltura non di routine contiene antibiotici. E &#39;fondamentale che CNE appaiono in buona salute e sono robusto proliferativa per la riprogrammazione di successo. <ol><li> Piastra 5 x 10 5 CNE per pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6 bene. Dopo 24 ore, aggiungere polibrenea BEGM ad una concentrazione finale di 8 mg / ml e trasdurre NEC con l&#39;aggiunta di particelle lentivirali che esprimono Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc ai media. Lo scopo di raggiungere una molteplicità di infezione (MOI) di ~ 5 27. <ol><li> Per la determinazione del MOI, preparare diluizioni seriali del magazzino concentrato-lentivirali e trasdurre cellule HT1080 con queste diluizioni. Dopo la prima inequivocabile individuazione di espressione dTomato nelle cellule HT1080, calcolare il numero di &quot;unità di trasduzione / ml&quot; segnando il numero di cellule dTomato-positivo / piccoli grumi di cellule in ogni diluizione. NOTA: in genere, ci saranno le diluizioni che sono troppo alti (tutto è dTomato positivo) e troppo bassa (nessuno o solo un paio di cellule positive). </li><li> Eseguire punteggio da diluire che viene identificato cellule positive discreti / piccoli grumi di cellule. Determinare il titolo correggendo il numero di trasduzione unità / ml con il fattore di diluizione appropriata. MOI è allora il rapporto del numerodi trasdotte cellule al numero di particelle virali 27. NOTA: Ogni dTomato cellulare positiva / piccolo ciuffo si presume che derivare da una singola particella di virus. </li></ol></li><li> Circa 3 ore post-trasduzione, rimuovere il supporto e sostituirlo con fresco BEGM. Eliminare i media lentivirali contenenti utilizzando procedure istituzionalmente approvati. Rientro CNE trasdotte per l&#39;incubatore per 3 giorni. </li><li> Il giorno 3, sostituire il supporto con fresco BEGM, e poi incubare per altri 3 giorni. Aspirare speso media, lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere 1 ml di soluzione 0,05% tripsina al pozzo. cellule Passage con tripsina come scritto in precedenza (sezione 5). Con attenzione aspirare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml BEGM + P / S. Le celle possono essere diversi passaggi di un nuovo pozzo di una piastra 6 e rivestito con BDC, o aggiunti alle culture MEF, se pronto (vedi punto successivo). </li><li> Preparare MEF piastre rivestite. Il giorno 4 aggiungere soluzione di gelatina 0,1% (1 ml / pozzetto) a 2 pozzetti di una 6 pozzo (per eseguire +/- Thiazovivin (SPT) vedi punto 6.6). Nella successivagiorno, scongelare una fiala di MEF inattivati ​​28. </li><li> Mettere MEF in 10 ml di media MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% DFCS). Spin a 200 g per 5 minuti per far sedimentare. Risospendere in mezzi MEF. Aspirare la gelatina da 6 pozzetti e aggiungere 1,87 x 10 5 MEF per pozzetto della piastra 6 bene la gelatina rivestite. Incubare O / N a 37 ° C, o per un minimo di 24 ore. </li><li> Trasferire 2 ml di BEGM contenenti trasdotte cellule per pozzetto in 2 pozzetti di una piastra 6 bene precedentemente ricoperto e incubare O / N. Il giorno successivo, sostituire BEGM con 2,5 ml per pozzetto di mezzi hESC standard contenenti 4 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti di base. Nutrire le cellule con i media hESC fresca +/- SPT giorno per 10 giorni NOTA: È possibile aggiungere un cocktail di piccole molecole (SB431542, PD0325901, e Thiazovivin () cocktail SPT) per migliorare l&#39;efficienza e la cinetica di riprogrammazione per NEC 23. </li><li> Dopo dieci giorni, continuare ad alimentare ogni giorno con hESC media senza SPT. Nutrire culture ogni giorno fino colonie hESC-like(Figura 5A, P0 colonia). Identificare le colonie che ospitano iPSCs putativi per la loro alta nucleo: rapporto citoplasma e nucleoli prominenti. </li><li> Manualmente accise e trasferire le colonie con morfologia hESC simil-pozzetti per la cultura e l&#39;espansione come linee separate in un sistema di libero alimentatore. colonie asportato devono adattarsi rapidamente a queste condizioni. <ol><li> Dopo colonie placcatura asportato queste linee IPSC putativi discrete sono ormai considerati passaggio 1 (p1). culture giornaliera di mangime con mTeSR1. Passage ed espandere le linee IPSC utilizzando le procedure standard. Potrebbero essere necessari diversi giorni a una settimana per le colonie P1 per raggiungere la dimensione in cui devono essere diversi passaggi. </li></ol></li></ol> 7. Mantenere iPSCs in cultura <ol><li> Alimentare e valutare le culture quotidiana. Manualmente aree accise esibendo differenziazione palese raschiando con una pipetta di vetro sterile o micro punta della pipetta. Cambiare media dopo la raccolta quotidiana. </li><li> cellule Passage dopo approssitamente ogni quattro giorni: Gently mezzi aspirato, aggiungere 1 ml dispasi calda (1 mg / ml) per pozzetto di un 6-pozzetti (metà del volume di alimentazione), poi incubare a 37 ° C per circa 4 minuti. I bordi delle colonie cominceranno a sollevare, che appare come un contorno bianco intorno alla colonia. Delicatamente aspirare il dispasi e lavare 3x con riscaldato DMEM / F12. </li><li> Aggiungere 2 ml mTeSR1 e utilizzare un sollevatore cella per sollevare le colonie dalla piastra. Utilizzare una pipetta da 5 ml sierologico o P1000 micropipetta per triturare delicatamente le cellule fino a quando le colonie sono suddivisi in gruppi più piccoli. <ol><li> Evitare di produrre molto piccoli gruppi o singole cellule, come la sopravvivenza e la successiva proliferazione saranno sub-ottimale. Quando le colonie ri-placcatura, un 1: 4 a 1: 6 spaccatura manterrà densità ottimale colonia. Rimuovere delicatamente colonie e dei media dal piatto e aggiungere nuovi pozzi Matrigel rivestite. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Cellule epiteliali nasali (NEC) sono una piattaforma accessibile per studiare le malattie delle vie respiratorie, e NEC-iPSCs offrono un viale emozionante di esplorare lo sviluppo della malattia, il trattamento e la terapia 1,31,32. NEC può essere facilmente ottenuto senza procedure nocive stressanti o potenzialmente 6,23. Nella nostra esperienza, il campionamento della mucosa nasale come descritto in questo protocollo appare meno stressante e meglio percepita di raccolta sangue per i bambini. Pert...

Le cellule staminali pluripotenti indotte da campioni umani (hiPSCs) sono una tecnologia in rapido sviluppo della ricerca sulle cellule staminali. Essi offrono un&#39;alternativa alle cellule staminali embrionali (hESC) ricerca con molti meno inconvenienti etici e morali 1,2. Anche se non sono identici a epigeneticamente hESC 3-5, hiPSCs offrono un modo unico per modello di sviluppo e di malattia fenotipi, e possono essere derivati ​​da tessuti rilevanti per lo stato di malattia 5-8. Nuovi metodi di hiPSCs elettrogeni sono costantemente in fase di studio per identificare i tipi di cellule ottimali per cominciare, come un modo per preparare iPSCs GMP qualità adatte per il trapianto, e anche per aumentare la tempestività e l&#39;efficienza del processo di riprogrammazione 6,9-11. Cellule epiteliali delle vie aeree sono fondamentali per lo sviluppo di infiammazione allergica 12, e l&#39;epitelio è una delle principali cause di reazioni allergiche e rimodellamento delle vie aeree attraverso l&#39;interazione con immunE e stromali cellule. L&#39;epitelio delle vie aeree gioca un ruolo essenziale nella genesi e la persistenza di malattie polmonari come asma. Tuttavia, più bassa delle vie aeree cellule epiteliali sono difficili da ottenere in un ambiente clinico, soprattutto da pazienti sani di controllo e bambini. I dati provenienti da diversi studi supportano la premessa che le cellule epiteliali da mucose nasali sono un proxy valido e pratico per vie aeree inferiori cellule epiteliali 13-20, soprattutto quando si studiano le risposte alle sostanze inquinanti e allergeni. La mucosa nasale si compone di oltre il 90% di cellule epiteliali ciliate delle vie aeree e di campionamento queste cellule epiteliali nasali (NEC) può essere facilmente effettuata in bambini di età quattro o cinque, in quanto è meno invasivo rispetto ad altre tecniche di campionamento di cellule / tessuti ed è associato con un rischio minimo di effetti collaterali come l&#39;infezione 20-23. Esso offre un modo veloce e semplice per assaggiare sia i bambini sani e malati senza lunghe, inutili, e spesso doloroso Operazi broncoscopiares che necessitano di sedazione. Studi precedenti hanno dimostrato che i sottotipi di malattia correlati alla gravità dell&#39;asma possono distinguere sia nella mucosa nasale e campioni di cellule bronchiali prelevati da bambini asmatici, e l&#39;espressione genica tra i due tipi di tessuto era simile in circa il 90% dei geni non onnipresenti 22 , 24. Come fonte per iPSCs, NEC offrono vantaggi rispetto ad altri tipi di cellule utilizzate di frequente. I fibroblasti sono spesso utilizzati per la generazione COPSI, ma anche se queste cellule possono essere facilmente coltivate da una biopsia cutanea, questo processo richiede tipicamente anestesia locale, una incisione e suture, ed è associata con qualche rischio di infezione. Pertanto, ottenendo consenso informato dai pazienti per questo tipo di biopsia può essere difficile 25. Una alternativa al fibroblasti è cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Tuttavia, può essere difficile ottenere sangue sufficiente per la generazione COPSI da pazienti pediatrici. In aggiunta, ci sono limitazioni di ap vallecomplicanze di fibroblasti e cellule del sangue iPSCs derivate, in particolare la loro capacità di differenziazione di alcuni tipi di cellule 5,26. Pertanto, data la relativa accessibilità e il basso rischio di effetti collaterali a seguito della loro raccolta, NEC rappresentano una fonte di cellule ideale per la generazione iPSC da popolazioni pediatriche. iPSCs hanno ricevuto molta attenzione recentemente come una piattaforma per lo studio dello sviluppo umano, la generazione di modelli di malattia romanzo, e come una potenziale fonte di cellule per le terapie personalizzate. Prima di tutto il potenziale di questa tecnologia può essere realizzato, le basi molecolari del processo di riprogrammazione hanno bisogno di essere chiariti, ma per ora questo protocollo e le procedure descritte nel potranno chiarire gli studi di ricerca focalizzati sulle esposizioni delle vie respiratorie, oltre a fornire una piattaforma per studiare gli effetti della medicina personalizzata che coinvolgono iPSCs. Il lavoro di collaborazione di diversi laboratori ha portato alla generation di una tecnica efficace non solo per campionare la mucosa nasale, ma anche coltura NEC, e riprogrammare queste cellule per iPSCs 23. Questo articolo fornisce uno schema di un protocollo per il campionamento ottimale, coltura e condizioni di riprogrammazione.

<table><tbody><tr><td>15 ml conico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocollo Passaggio 1.1.</td></tr><tr><td>Protocollo BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Passaggio 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocollo Passaggio 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocollo Passaggio 4.a.</td></tr><tr><td>pennello citologico cytosoft</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocollo Passaggio 1.2.</td></tr><tr><td>tripano blu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocollo Passaggio 2.1.</td></tr><tr><td>ematocitometro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocollo Passaggio 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocollo Passaggio 2.2.</td></tr><tr><td>Clip a imbuto citologico</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocollo Passaggio 2.2.</td></tr><tr><td>Citospin imbuto</td> Fisher <td>Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocollo Passaggio 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific A78300003</td><td></td><td>Protocollo Passaggio 2.2.</td></tr><tr><td>vetrino vuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocollo Passaggio 2.2.</td></tr><tr><td>kit di colorazione hema 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocollo Passaggio 2.2.</td></tr><tr><td>Colagen dermico bovino, tipo 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocollo Passaggio 3.2.</td></tr><tr><td>Pallone T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocollo Passaggio 3.3.</td></tr><tr><td>Protocollo Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Passaggio 5.2.</td></tr><tr><td>Soluzione neutralizzante della tripsina</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocollo Passaggio 5.2.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), sterilizzato a caldo a 65 ° grado; C per 30 minuti</td> Protocollo <td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Passaggio 5.5.</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido Hybri-Max, filtrato sterile, BioReagent, adatto per ibridomi, &ge; 99,7%</td><td>Protocollo Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Passaggio 5.5.</td></tr><tr><td>lentivirus policistonico*</td><td>ad es. Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocollo Passaggio 6.4. Viene elencata una fonte commerciale di vettore di riprogrammazione. Utilizziamo abitualmente il plasmide 4-in-1 riportato da Voelkel et al (PMID: 20385817) per generare internamente lentivirus di riprogrammazione policistronica pseudotipizzato VSV-G. Questo plasmide può essere ottenuto contattando&nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocollo Passaggio 6.4.</td></tr><tr><td>CF1 MEF irradiati</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>Passaggio 6.4 del protocollo</td> <td>GSC-6301G</td>.</tr><tr><td>Supporti hESC</td><td>Vedere la ricetta inclusa nel protocollo</td><td></td><td>Passaggio del protocollo 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Protocollo Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Passaggio 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protocollo Passaggio 6.11.</td></tr><tr><td>Tiazovivina</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protocollo Passaggio 6.11.</td></tr><tr><td>Protocollo Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td> qualificato hESC <td>Passaggio 6.13.</td></tr><tr><td>Piastra di corning, 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocollo Passaggio 6.13.</td></tr><tr><td>Protocollo mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Passaggio 6.13.</td></tr><tr><td>Pallone filtrante monouso da 250 ml (0,22 & micro; m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocollo Passaggio 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protocollo Passaggio 7.3.</td></tr><tr><td>sollevatore cellulare</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocollo Passaggio 7.4.</td></tr><tr><td>Fase</td><td></td><td></td> <td>6.11. i componenti devono essere miscelati e quindi sterilizzati con filtro. I supporti possono essere mantenuti a 4 &deg; C per un massimo di due settimane. Quando si riscaldano i fluidi, non lasciare a 37 gradi C più lungo di 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 media</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Concentrazione finale</td></tr><tr><td>Siero sostitutivo KO (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0,2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-mercaptoetanolo</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>100x aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &; g/ml Fattore di crescita basico dei fibroblasti (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Le cellule epiteliali nasali (NEC) sono la parte delle vie aeree che risponde agli inquinanti atmosferici e sono le prime cellule infettate da virus respiratori. Sono anche coinvolti in molte malattie delle vie aeree attraverso la loro risposta immunitaria innata e l'interazione con le cellule stromali immunitarie e delle vie aeree. I NEC sono di particolare interesse per gli studi sui bambini grazie alla loro accessibilità durante le visite cliniche. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) sono state generate da diversi tipi di cellule e sono un potente strumento per modellare lo sviluppo umano e la malattia, nonché per le loro potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa. Questo è il primo protocollo a delineare metodi per la generazione di successo di iPSC da NEC derivate da partecipanti pediatrici per scopi di ricerca. Descrive come ottenere cellule epiteliali nasali dai bambini, come generare colture primarie di NEC da questi campioni e come riprogrammare le NEC primarie in iPSC ben caratterizzate. I campioni di mucosa nasale sono utili negli studi epidemiologici relativi agli effetti dell'inquinamento atmosferico nei bambini e forniscono uno strumento importante per lo studio delle malattie delle vie aeree. Le cellule nasali primarie e le iPSC da esse derivate possono essere uno strumento per fornire materiale illimitato per la ricerca specifica del paziente in diverse aree della biologia epiteliale delle vie aeree, compresa la ricerca sull'asma e sulla BPCO.

La parte iniziale del naso, chiamato il vestibolo nasale, è l&#39;area circondata da cartilagine 29. La spazzola deve andare liscio passato questa zona del naso, oltre la valvola nasale (ostium internum, o &quot;buco nero&quot; visto sul retro della nare), e il campione è ottenuta dalla turbinato inferiore (Figura 1). I turbinati nasali sono strutture ossee che aumentano la superficie del naso 29, che li rende un luogo ideale per il campionamento. L...

Questa pubblicazione dimostra metodi per il campionamento e la coltura di successo della mucosa epiteliale nasale dai bambini e per la riprogrammazione di queste cellule in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).

Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule epiteliali nasali ottenute da bambini e riprogrammarle in cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie dell'apparato respiratorio, come ad esempio come si sviluppa l'asma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di raccogliere cellule epiteliali delle vie aeree da bambini senza ricorrere a procedure stressanti.In coltura, queste cellule costituiscono una popolazione omogenea e rappresentano un'ottima fonte per generare cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC. L'idea iniziale di questo studio è nata durante una conversazione con i dottori Ji e Hershey riguardo al loro progetto di raccogliere cellule meso-epiteliali da bambini per indagare le variazioni epigenetiche nell'asma e nell'inquinamento atmosferico.La dimostrazione visiva di queste tecniche è fondamentale perché il prelievo nasale e la riprogrammazione in iPSC delle cellule epiteliali nasali sono tecniche difficili da apprendere, in quanto si basano sull'esperienza personale e non su protocolli standardizzati. Prima della visita del partecipante, trasferire due millilitri di mezzo di crescita fresco per cellule epiteliali bronchiali, abbreviato in BEGM, in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere a questo mezzo 20 microlitri di una miscela di penicillina, streptomicina e anfotericina B per ottenere una concentrazione finale dello 0,01%. Quando il partecipante arriva, indirizzarlo verso una sedia per farlo sedere.Quindi aprire immediatamente un pennello citologico subito prima di prelevare il campione, evitando di toccare qualsiasi superficie per garantire che rimanga sterile. Procedere istruendo il partecipante a rimanere fermo e ad inclinare la testa verso l'alto, in direzione del soffitto. Se il soggetto è irrequieto, chiedergli di sedersi sulle mani in modo da non tentare di allontanare il pennello.Successivamente, indirizzare e inserire il pennello nella parte posteriore del naso, dove il passaggio si restringe. Successivamente, rimuovere il pennello dalla narice facendolo scivolare verso il basso con un movimento rotatorio del polso. Procedere inserendo il pennello nel tubo conico precedentemente preparato e assicurarsi che sia completamente immerso nel BEGM.Quindi tagliare la parte eccedente dello spazzolino e fissare il cappuccio sul tubo. Dopo aver raccolto il campione, posizionarlo immediatamente in un becher riempito con acqua calda, in modo da mantenerlo alla temperatura più vicina possibile a 37 gradi Celsius. Successivamente trasportarlo in laboratorio.Una volta in laboratorio, agitare delicatamente il pennello nel BEGM. Successivamente, prelevare 10 microlitri del campione e aggiungere 10 microlitri di un colorante per la vitalità cellulare (live/dead). Procedere quindi introducendo questa miscela su un emocitometro.Contare solo le cellule vitali al microscopio. Dopo il conteggio cellulare, prelevare 50 microlitri del campione e procedere a diluirlo fino a 200 microlitri con PBS 1X. Trasferire il resto della miscela cellulare non diluita, insieme al pennello, in un bagno d'acqua regolato a 37 gradi Celsius fino alla semina cellulare.Procedere aggiungendo il campione diluito in PBS a un imbuto per citospin collegato a un vetrino. E ruotare l'intero apparato a 400 rpm per due minuti. Successivamente, rimuovere l'imbuto e lasciare asciugare il vetrino tutta la notte al buio.Dopo aver colorato il vetrino con Hema 3, come descritto nel protocollo testuale, osservarlo al microscopio e contare le cellule. Identificare le cellule epiteliali in base alle loro caratteristiche peculiari: forma colonnare, ciglia e un nucleo rotondo, e determinare la percentuale di queste cellule nel preparato.Per iniziare la semina, agitare delicatamente il pennello all'interno del conico all'interno di una cappa certificata per colture cellulari, quindi rimuoverlo dal tubo. Successivamente, ruotare delicatamente il pennello sulla superficie interna di una fiala T25, precedentemente rivestita con collagene dermico bovino, avendo cura di non graffiare il rivestimento. Quindi smaltire il pennello in un apposito contenitore per rifiuti biologici pericolosi.Pipettare lentamente le cellule rimanenti in BEGM dal conico nel flask T25, almeno 7 volte 10 alla quinta cellule. Procedere con l'osservazione delle cellule al microscopio invertito. Dopo la coltivazione e il passaggio delle cellule, come descritto nel testo, procedere a seminare 5 volte 10 alla quinta cellule epiteliali nasali in due millilitri di BEGM per pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti.Quindi incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, verificare che le cellule stiano proliferando in modo robusto. Poi aggiungere la polibrena in ogni pozzetto contenente BEGM fino a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro in cappa a flusso laminare.Procedere alla trasduzione delle cellule epiteliali nasali aggiungendo alle particelle lentivirali, che esprimono Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc, il mezzo in ogni pozzetto come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver incubato le cellule trasdotte per circa tre ore, rimuovere il mezzo contenente il virus e smaltirlo seguendo le procedure approvate dall'istituzione. Successivamente, sostituire questo mezzo con BEGM e reinserire le cellule epiteliali nasali trasdotte nell'incubatore.Dopo tre giorni, sostituire il mezzo con BEGM fresco. Quindi incubare le cellule transdotte nelle stesse condizioni. Il giorno successivo, aggiungere una soluzione di gelatina allo 0,1% in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti per iniziare la preparazione delle piastre rivestite con fibroblasti embrionali murini.Quindi coprire la piastra con il relativo coperchio e incubarla durante la notte a 37 gradi Celsius. Procedere al quinto giorno scongelando una provetta contenente circa 5 volte 10 alla quinta fibroblasti embrionali di topo inattivati, abbreviati come MEF. Successivamente, collocare queste cellule in 10 millilitri di mezzo per MEF.E procedere a centrifugarli a 200 x g per cinque minuti. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere i MEF nello stesso mezzo. Una volta contate queste cellule, aspirare la soluzione di gelatina dalla piastra a sei pozzetti precedentemente preparata.Successivamente, aggiungere 1,87 × 10⁵ MEF in ciascun pozzetto rivestito con gelatina della piastra e incubare a 37 °C per un minimo di 24 ore. Quindi, al sesto giorno di coltura, aspirare il mezzo usato dalle cellule transdotte e lavarle con PBS 1X. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina 0,05% in ciascun pozzetto della piastra.Dopo il distacco delle cellule, procedere a neutralizzare con soluzione neutralizzante per tripsina o TNS, quindi raccogliere e centrifugare le cellule come precedentemente descritto. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in quattro millilitri di BEGM, integrato con penicillina e streptomicina. Procedere quindi introducendo due millilitri di questa sospensione cellulare in ciascun pozzetto rivestito con gelatina e MEF della piastra preparata in precedenza.Dopo aver incubato le cellule durante la notte, sostituire il BEGM con 2,5 millilitri di mezzo standard per cellule staminali embrionali umane, abbreviato in hESC, contenente quattro nanogrammi per millilitro di fattore di crescita delle cellule fibroblastiche di base. Procedere con la coltivazione delle cellule e alimentarle quotidianamente con mezzo hESC fresco fino a quando compaiono colture con colonie simili a hESC, che contengono presunte cellule staminali pluripotenti indotte, o iPSCs. Escindere manualmente queste colonie e trasferirle in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti, al fine di coltivarle ed espanderle come linee cellulari distinte in un sistema senza feeder.Inizialmente, i campioni nasali sono una miscela di tipi cellulari e detriti. Tuttavia, dopo la coltura e i cambi del mezzo, le cellule epiteliali diventano predominanti in queste preparazioni, come mostrato in questa immagine scattata un giorno dopo il passaggio cellulare. Qui, le cellule epiteliali, cresciute fino alla confluenza, mostrano nuclei grandi e citoplasma allungato.A causa delle proprietà delle particelle lentivirali utilizzate in questo studio, quando tali cellule epiteliali nasali vengono transdotte, esprimono il marcatore fluorescente tdTomato, come dimostrato dall'immagine in alto a destra delle cellule, quattro giorni dopo la trasduzione. Un confronto con la corrispondente immagine in campo chiaro rivela che non tutte le cellule mostrano il segnale di tdTomato, come evidenziato dall'immagine sovrapposta in basso. Pertanto, non tutte le cellule vengono transdotte.Tuttavia, l'efficienza di trasduzione è di circa il 90%. Quando le cellule epiteliali nasali trasdotte vengono coltivate come descritto nel protocollo, danno origine a colonie di iPSC. Dopo il raccolto delle colonie di iPSC e la coltura in condizioni standard senza feeder, le singole cellule all'interno di tali colonie mostrano una tipica morfologia simile a quella delle hESC, come forma rotonda, nucleo grande e alto rapporto nucleo/citoplasma, come dimostrato da questa immagine ingrandita. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e mezza, se svolta correttamente.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di prelevare correttamente il campione, mantenere le cellule a 37 gradi Celsius e seminare il più rapidamente possibile alla densità corretta. Dopo aver eseguito questa procedura, altri metodi, come l'allestimento di un'interfaccia aria-liquido utilizzando cellule epiteliali nasali primarie, possono essere effettuati per rispondere a ulteriori domande, ad esempio su come l'aria risponde ad allergeni e patogeni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per modellare malattie come l'asma, la BPCO e la fibrosi cistica.Questa tecnica aiuta inoltre a studiare gli effetti ambientali sullo sviluppo polmonare nel sistema umano in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come coltivare cellule epiteliali nasali da bambini e generare iPSC da questa popolazione. Poiché lavoriamo con cellule staminali embrionali umane e cellule staminali pluripotenti indotte, ricorda di seguire sempre le linee guida istituzionali e nazionali.

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