Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

L'obiettivo generale di questi esperimenti è quello di selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e di rilascio di colorante è utile per la scoperta funzionale di nuovi antimicrobici con attività litica contro bersagli specifici come un batterio patogeno di interesse. I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono semplici da eseguire, offrono flessibilità per la variazione dei parametri sperimentali e possono essere eseguite con apparecchiature di laboratorio comunemente presenti nella maggior parte dei laboratori di microbiologia.

Prima di iniziare il test di diffusione su microvetrino, la concentrazione dell'enzima antimicrobico da valutare deve essere determinata utilizzando un kit di dosaggio della proteina BCA, secondo il protocollo del produttore. Eseguire una diluizione seriale dell'enzima antimicrobico, utilizzando il PBS come tampone di reazione. Erogare la proteina in singole provette per microfugi e regolare i volumi a 20 millilitri utilizzando PBS.

Successivamente, preparare una soluzione di agarosio allo 0,5% sciogliendo 0,25 grammi di agarosio in 50 millilitri di PBS. Scaldare questa soluzione a ebollizione fino a quando l'agarosio non si sarà completamente sciolto. Determinare in peso l'acqua persa durante il processo di fusione e aggiungerla nuovamente alla soluzione.

Per inibire la crescita batterica contaminante durante l'incubazione del saggio, aggiungere 15 microlitri di azoturo di sodio al 10% in acqua alla soluzione di agarosio e regolare la temperatura della soluzione a 50 gradi Celsius a bagnomaria. Se si utilizzano cellule vitali come substrato, omettere l'azoturo di sodio dalla soluzione di agarosio. Scongelare il substrato batterico ucciso dal calore sul ghiaccio.

Risospendere il substrato batterico in 12 millilitri di soluzione di agarosio per corrispondere approssimativamente alla torbidità di uno standard di torbidità di equivalenza McFarland 2.0. Confronta le torbidità delle soluzioni visualizzando una linea nera su sfondo bianco attraverso le soluzioni, aggiungendo substrato batterico all'agarosio fino a raggiungere la torbidità approssimativa. Immediatamente, ma con attenzione, versare tre millilitri della soluzione del substrato di agarosio in ogni microvetrino, assicurandosi che la soluzione non trabocchi dal microvetrino.

Dopo che i vetrini si sono solidificati, utilizzare una trivella di sughero di 4,8 millimetri di diametro per perforare tre pozzetti nello strato di substrato di agarosio di ciascun microvetrino. Aggiungere 20 microlitri di ciascuna diluizione seriale proteica aggiustata nei rispettivi pozzetti. Utilizzare l'albumina sierica bovina in un pozzetto di controllo negativo.

Come controllo positivo, utilizzare enzimi batteriolitici noti e appropriati per il substrato come il lisozima. Incubare i vetrini in una camera di umidità a 37 gradi Celsius, o la temperatura ottimale di attività dell'enzima. La durata dell'incubazione dipende dalla concentrazione e dall'attività specifica dell'enzima antimicrobico.

Un tempo di reazione tipico è di circa 16 ore. Al termine dell'incubazione, osservare i vetrini sotto la luce indiretta e acquisire immagini del test in via di sviluppo. Utilizzare una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo con un obiettivo da 60 millimetri a una distanza focale di circa 30 centimetri.

Nel saggio di rilascio del colorante dimostrato nel segmento successivo, il substrato è legato in modo covalente al colorante Remazol Brilliant Blue R o RBB. Iniziare questo protocollo preparando una soluzione di RBB da 200 millimolari. Sciogliere 1,25 grammi di RBB in una soluzione di idrossido di sodio appena preparata.

Successivamente, risospendere le cellule batteriche uccise dal calore a una concentrazione di 0,5 grammi di peso umido in 30 millilitri di soluzione di RBB. Per il peptidoglicano purificato, risospendere il peptidoglicano a una concentrazione di 0,3 grammi di peso umido in 30 millilitri di soluzione di RBB. Poiché i passaggi successivi sono gli stessi, indipendentemente dal substrato utilizzato, la marcatura sarà dimostrata solo per le cellule batteriche.

Incubare la miscela di reazione su una piattaforma rotante per sei ore a 37 gradi Celsius mescolando delicatamente. Dopo sei ore, trasferire la miscela di reazione in un incubatore a quattro gradi Celsius e incubare per altre 12 ore mescolando delicatamente. Al termine dell'incubazione, raccogliere il substrato colorato mediante centrifugazione a 3000 x g per 30 minuti.

Decantare la soluzione colorante dal pellet di substrato. Risospendere accuratamente il pellet in acqua di tipo I seguita da centrifugazione. Innaffiare le cellule marcate con il colorante da tre a cinque volte in questo modo per rimuovere il colorante solubile non covalentemente legato dai substrati.

Per i lavaggi finali, trasferire la parte di pellet che verrà utilizzata nel saggio di rilascio del colorante in provette per microfuge da 1,5 millilitri. Il surnatante dell'ultimo lavaggio deve essere limpido mentre il substrato rimane blu. Conservare il substrato tinto sospeso in una quantità minima di acqua a 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Per prepararsi al test di rilascio del colorante, lasciare che il substrato colorato congelato torni a temperatura ambiente e lavare due volte con il tampone di analisi che è stato determinato empiricamente per l'enzima. In questo caso viene utilizzato PBS. Calcolare il volume della sospensione del substrato necessario moltiplicando il volume di reazione di 200 microlitri per il numero di saggi di rilascio del colorante da eseguire.

Per preparare la sospensione del substrato, aggiungere prima il substrato colorato al volume appropriato di PBS. Effettuare una diluizione uno a uno e prendere una misura iniziale della densità ottica a 595 nanometri, utilizzando PBS come bianco. Aggiungere quantità incrementali del substrato colorato alla sospensione fino a raggiungere una densità ottica di 2,0 a 595 nanometri.

In questa dimostrazione, il saggio di rilascio del colorante verrà utilizzato per determinare le condizioni di incubazione ottimali per una proteina antimicrobica. Innanzitutto, preparare una sospensione antimicrobica proteica standard regolando la concentrazione a un milligrammo per millilitro utilizzando PBS come descritto nel testo del protocollo. Quindi diluire la sospensione antimicrobica proteica stock a una concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro.

Questa concentrazione fornisce una massa di reazione finale di un microgrammo di proteine per volume aggiunto alla reazione del saggio. Eseguire i saggi di reazione in provette microfuse da 0,5 millilitri per l'intervallo termico da valutare. Per ogni condizione termica, aggiungere 10 microlitri di proteina madre a 200 microlitri di sospensione di substrato preparata.

Incubare in termociclatore per otto ore mescolando per inversione una volta all'ora. Dopo l'incubazione, arrestare le reazioni aggiungendo 25 microlitri di etanolo a ciascuna provetta per microfuge. Per rimuovere il substrato insolubile non digerito, centrifugare a 3000 x g per due minuti.

Dopodiché, facendo attenzione a non rompere il pellet di substrato non digerito, trasferire 150 microlitri del surnatante di reazione per ogni miscela di reazione in una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Per quantificare l'attività enzimatica, utilizzare uno spettrofotometro per micropiastre per misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nanometri. L'aumento dell'assorbanza da parte del colorante solubile rilasciato nel surnatante dal substrato marcato è una misura quantitativa dell'attività enzimatica.

Il saggio di diffusione su microvetrini è stato utilizzato per valutare qualitativamente l'attività di una proteina antimicrobica sconosciuta contro il substrato di cellule intere di Salmonella enterica uccisa termicamente. L'antimicrobico è stato aggiunto in quantità crescenti dai pozzetti A fino a F e il PBS è stato utilizzato per i controlli negativi. Dopo sei ore, è stata osservata la dimensione della zona chiara di idrolisi che si è formata intorno a ciascun pozzo.

Un'elevata attività enzimatica si riferisce qualitativamente a una zona più grande, mentre una bassa attività enzimatica si riferisce qualitativamente a una zona più piccola. Il saggio quantitativo di rilascio del colorante è stato utilizzato per determinare la temperatura di reazione ottimale per una proteina antimicrobica. Come si vede dalle quantità di colore blu nei surnatanti di reazione e dalle unità di attività derivate dalle misure di assorbanza a 595 nanometri, 35 gradi Celsius è la temperatura ottimale.

Il test di rilascio del colorante è stato utilizzato anche per determinare l'intervallo di attività di una proteina antimicrobica sconosciuta contro il substrato ucciso termicamente da Bacillus subtilis. Un confronto con l'intervallo di attività dell'alfa-chimotripsina ha rivelato che l'enzima antimicrobico sconosciuto ha quasi il doppio dell'affinità per il substrato. Inoltre, mentre l'attività dell'alfa-chimotripsina inizia a stabilizzarsi intorno a 0,3 microgrammi, l'attività dell'enzima sconosciuto ha continuato a crescere in tutte le quantità di enzimi.

Una volta padroneggiato, il saggio di diffusione su microvetrini può essere completato in 30 minuti. Il test di rilascio del colorante può essere completato entro un'ora. I tempi di incubazione per ciascun test dipenderanno dall'attività enzimatica e dalle loro concentrazioni.

Espandendo queste procedure, il metodo di rilascio del colorante può essere modificato per determinare le influenze chimiche che influenzano l'attività enzimatica dell'enzima antimicrobico manipolando aspetti della reazione come il pH del tampone e la salinità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica utilizzando i saggi di diffusione su microvetrini e rilascio di colorante.