Name: Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e lapoptosi omeostasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri i meccanismi di omeostasi e differenziazione degli adipociti e l'impatto dell'ipossia sull'apoptosi. Questo metodo aiuta a studiare l'obesità e il diabete di tipo II.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. J. gentilmente Lutero e K. Ubieta per la preparazione dei dati e il dottor B. Grötsch per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli adipociti sono caratterizzati fenotipicamente per le loro dimensioni, numeri e zona, rivelando degli adipociti iperplasia e ipertrofia, indotta da stoccaggio eccessivo di energia a causa di un eccesso di nutrizione 5. Questi eventi portano alla disregolazione di acidi grassi e successive sindromi metaboliche sono afferma anche di un aumento della massa grassa con metabolismi conservati, che è indicato anche come l&#39;espansione grasso &quot;sano&quot;. Ad esempio, Kusminski et al. 21 hanno mostrato che i topi con espansione grasso massiccia rimangono metabolicamente sani, suggerendo che l&#39;espansione grasso non è necessariamente legata sindromi metaboliche e deve essere attentamente determinata a valutare le caratteristiche degli adipociti. Il tessuto adiposo (AT) gioca un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo del corpo. AT è il più grande organo endocrino che potrebbe influenzare la dislipidemia, l&#39;aterosclerosi, l&#39;iperinsulinemia e iperglicemia 3. Valutare AT omeostasi e la m molecolareECCANISMI regolano potrebbe consentire una migliore comprensione dei disturbi del sistema metabolici. Pertanto, svelare i meccanismi che regolano la differenziazione degli adipociti, le dimensioni degli adipociti e la massa cuscinetto adiposo aiuterebbero a sviluppare nuovi trattamenti terapeutici per i disturbi di obesità. Uso in vivo e metodi in vitro, è possibile determinare il ruolo degli impatti alimentari e di espressione genica sulla differenziazione e l&#39;attività degli adipociti. Per determinare l&#39;omeostasi AT, determinare l&#39;equilibrio tra differenziazione degli adipociti, proliferazione e apoptosi come suggerito dal nostro protocollo è importante come analizzare il glucosio e insulina metabolica risposta 22-24. Profili di espressione analisi di geni coinvolti nella adipogenesi, lipogenesi, la lipolisi, l&#39;assorbimento degli acidi grassi, ipossia, l&#39;apoptosi e la proliferazione in adipociti primari e viscerale AT è un metodo di alto rendimento per ottenere una panoramica degli adipociti omeostasi e la loro possibile disfunzione.i candidati interessanti dovrebbero essere ulteriormente analizzati a livello proteico mediante western blot o colorazione immunohistological. Per ottenere risultati ottimali attraverso tempo reale sistema PCR utilizzando coloranti cianinici asimmetrici, le concentrazioni di cDNA da 1 a 10 ng di primer e le concentrazioni ottimali da 50 a 900 nm dovrebbero essere testati per minimizzare l&#39;amplificazione non specifica. I componenti critici sono i primer; Per ciascuna prova, le curve di fusione devono essere controllati strettamente per garantire la specificità ed escludere la formazione di dimeri di primer. Pertanto, è consigliabile utilizzare un controllo negativo con H 2 O invece di cDNA. Inoltre, commerciali disponibili coloranti cianinici asimmetriche sono forniti come Master Mix contenenti un colorante di riferimento passivo (come ROX) per fornire un segnale di riferimento interno. Il segnale cDNA è normalizzata durante l&#39;analisi dei dati ai segnali ROX per correggere le fluttuazioni del segnale ben-to-bene. Un altro punto da considerare al fine di stabilire un good sistema qPCR è la scelta del gene housekeeping. Per ogni condizione, diversi geni housekeeping vengono utilizzati, ad esempio, HPRT, β-actina, GAPDH, β-2-mg o HSP90. Proteine ​​HIF stabilizzati da condizioni di ipossia sono regolatori principali che determinano non solo adipociti sopravvivenza, ma anche cambiamenti metabolici, come il glucosio, la tolleranza di insulina e il metabolismo dei lipidi 11,25,26. Per accertare le aree ipossiche nel cuscinetto adiposo, HIF-1α è determinato in AT sezioni di immunoistochimica. Poiché le proteine ​​HIF si stanno rapidamente degradati entro 5 o 10 minuti in condizioni normossiche, la procedura e la fissazione del cuscinetto adiposo per l&#39;analisi istologica devono essere strettamente controllati per evitare di tempo di latenza. Pertanto, per assicurare ipossia non solo attraverso HIF colorazione, pimonidazole viene utilizzato per determinare le aree ipossiche in AT. Pimonidazole è in grado di distribuire nei tessuti, come è stato già indicato in ossa 27, Ed effettivamente indicare le zone ipossiche legandosi alle proteine ​​contenente il tiolo specificatamente nelle cellule ipossiche, che viene ulteriormente rilevati in sezioni istologiche legandosi anticorpo specifico 28. Tuttavia, altri marcatori e metodi possono essere utilizzati per analizzare il percorso ipossia. Ad esempio, il coinvolgimento dell&#39;enzima prolyl idrossilasi (PHD), che inducono idrossilazione dei residui di prolina sotto normoxia, così come la proteina di von Hippel-Lindau (VHL), che riconoscono proline idrossilati e indurre il poli-ubiquitinazione di mediare proteasomale HIF degradazione, devono essere analizzati per una panoramica completa del percorso 29,30. Inoltre, il rilevamento onnipresente di HIF potrebbe anche determinare la stabilità proteica e la degradazione che può essere alterare 31,32. Inoltre, proliferazione Ki67 e l&#39;apoptosi da TUNEL sono determinati in vivo attraverso la colorazione di AT sezioni istologiche. La quantificazione della proliferazione da Ki67 e unpoptosis da TUNEL o annessina V colorazione attraverso citometria a flusso di analisi viene effettuata anche 33. Proliferazione potrebbe naturalmente essere misurata con altre tecniche come l&#39;analisi del ciclo cellulare adipociti, che non viene affrontato dalla misurazione di cellule positive Ki67. Inoltre, lo studio apoptosi mediante TUNEL può essere completata mediante FACS analisi di annessina V e TOP-PR-3 che determinerà i livelli di necrosi rispetto al processo di morte cellulare apoptosi. L&#39;apoptosi è un processo fondamentale per il programma di morte cellulare, che è importante per AT omeostasi. Infatti, disregolazione di adipociti apoptosi è stato implicato in precedenza nei processi che contribuiscono all&#39;obesità e lipodistrofia 34. Inoltre, nel 2011, Keuper et al. Legato adiposo infiammazione dei tessuti di adipociti apoptosi. Essi hanno dimostrato che i macrofagi apoptosi indotta in preadipocytes e adipociti, che a loro volta attirano macrofagi. Il reclutamento di macrofagi accelera infiammazione, che contributes a sindromi metaboliche come glucosio e di insulina tolleranza 35. Tuttavia, adipociti l&#39;apoptosi è un fenomeno ancora poco studiato, nonostante l&#39;ipotesi che l&#39;apoptosi indotta adipociti potrebbe portare ad una riduzione del peso. Il presente protocollo utilizza approcci immunoistochimica per studiare fenomeno diverso, come la proliferazione, l&#39;apoptosi e ipossia in vivo. Pertanto, il tessuto è stato fissato con 4% di formaldeide, che è un passaggio critico. Un tempo di fissaggio del tessuto prolungato porta al cambiamento degli epitopi, che diventano non accessibili per l&#39;anticorpo. Al contrario, un breve tempo di fissazione aumenta la sensibilità di epitopi ai reagenti. Il momento ottimale raccomandata di fissaggio è di 24 ore. Inoltre, lo spessore delle sezioni influenza anche gli anticorpi leganti ai loro epitopi; spessore ottimale è compreso tra 2 e 5 micron. Le sezioni più spesse di 5 micron darà risultati falsamente positivi a causa di un aumento dei siti di legame. Al contrario, sriflessioni più sottile di 2 micron contengono siti meno vincolante e le aree positive non sono ben definiti. Ulteriori fattori critici sono l&#39;anticorpo stesso, tempo di incubazione, la concentrazione e la temperatura uniforme, che influenzano la qualità del legame con gli epitopi specifici. Pertanto, convalidando la concentrazione e l&#39;incubazione tempo anticorpo è necessaria per ogni condizione. Per completare lo studio, mettiamo a disposizione in vitro adipociti protocollo di differenziazione, che potrebbe essere esteso per diversi trattamenti, la stimolazione o co-culture. Utilizzando nelle culture adipociti in vitro, è fattibile per determinare difetti di differenziazione degli adipociti e funzioni. Per ottenere risultati affidabili, come per tutte le celle primarie, il comportamento sano e l&#39;aspetto delle ADSCs e adipociti è molto importante. La granularità, vacuolations e / o distacco citoplasmatici sono segni di deterioramento, che indica medio inadeguata, la contaminazione microbica o senescenza del primariocellule. Questo protocollo utilizza adipociti isolati dal tessuto cuscinetto adiposo, che è pure possibile utilizzare mesenchimali cellule staminali isolate dal midollo osseo come descritto da altri protocolli 36. L&#39;ultima include cellule progenitrici stromali, che potrebbero riflettere problemi differenziazione supplementare che si verificano nella fase molto precoce di differenziazione degli adipociti, questo potrebbe essere perso nel nostro protocollo corrente. Inoltre, ADSCs possono essere espanse rapidamente (più di 10 volte entro una settimana), e ADSCs in coltura a lungo termine dopo alcuni passaggi ancora mantengono la loro pluripotenza mesenchimali 37,38. Un altro vantaggio utilizzando ADSCs è che si può facilmente passare a umano, dal momento che ADSCs possono essere raccolte da pazienti con la liposuzione, che è un metodo semplice e poco invasivo. Al influenza diversi altri organi in modo endocrino, il protocollo dovrebbe essere estesa a adipochine. Adipochine, come la leptina, adiponectina, fattore di necrosi tumorale-α (TNF) unND resistina, secreto dagli adipociti sono noti per influenzare malattie metaboliche controllando il metabolismo dei grassi, omeostasi energetica e la sensibilità all&#39;insulina 39. Pertanto, siero e adipociti secretoma analisi dovrebbero essere effettuate. Nel caso di AT erettile, adipochine e citochine pro-infiammatorie come IL-6, può portare a disregolazione di organi quali il fegato e pancreas, e della funzione muscolare 4. Al fine di escludere disfunzione d&#39;organo sistemica, modelli animali o colture cellulari potrebbero essere testati per la loro risposta al glucosio stimolazione e l&#39;assorbimento. Qui forniamo un protocollo per analizzare lo stato di base della AT e adipociti in vivo e in vitro per rivelare meccanismi molecolari di adipociti omeostasi e funzionalità.

Secondo il rapporto 2014 dell&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità, il 39% della popolazione adulta del mondo è in sovrappeso, e il 13% è obeso 1. Nel prossimo futuro, le persone in sovrappeso comprenderanno una quota significativa della popolazione anziana. Una caratteristica importante di obesità e l&#39;invecchiamento è disregolazione del grasso in relazione alla morbilità e mortalità 2. Adipochine, proteine ​​secrete dal tessuto adiposo (AT), possono innescare le sindromi metaboliche come l&#39;obesità e il diabete di tipo 2 3. Malattie metaboliche sono principalmente causati da eccessivo accumulo di energia nelle goccioline lipidiche di adipociti, che si traduce in AT espansione 4. E &#39;quindi di interesse per determinare le cause ed i meccanismi molecolari di espansione AT, al fine di trovare opportunità per controllarlo. Over-nutrizione porta ad espansione AT, che è regolata da due eventi: lo stoccaggio eccessivo di energia nelle gocce lipidiche di adipociti, un processoportando ipertrofia (aumento delle dimensioni degli adipociti), e aumento adipogenesis, noto anche come iperplasia adipocita 5. Adipogenesi è un processo di differenziazione delle cellule multipotenti mesenchimali staminali (MSC) in adipociti. In primo luogo, MSC sviluppano in preadipociti durante la fase di impegno. In secondo luogo, preadipocytes ulteriormente differenziano per acquisire le caratteristiche di adipociti maturi e funzionali 6. Diversi fattori di trascrizione sono stati identificati come maestri regolatori per la determinazione preadipocyte, come la proteina zinc finger 423 (Zfp423) e fattore di cella precoce B 1 (Ebf1). Mentre Zfp423 induce impegno precoce, Ebf1 è necessario per la generazione di progenitori degli adipociti 6. Differenziazione terminale è strettamente controllata da una cascata trascrizionale, per cui perossisomi γ del recettore proliferator-activated (PPAR) è il fattore di trascrizione essenziale 7. Ulteriori fattori trascrizionali chiave sono l&#39;/ proteine ​​enhancer-binding CCAAT (C/ EBP) i membri della famiglia (ad esempio, C / EBPα, C / EBPβ, e C / EBPδ), fattori Kruppel-like (KLFs), cAMP elemento sensibile binding protein (CREB) e di risposta rapida crescita 20 (Krox20) 6. Recentemente, è stato dimostrato che la proteina-1 (AP-1) famiglia attivatore è coinvolto nel processo di differenziazione degli adipociti 8,9. La famiglia AP-1 è costituito da un complesso proteico dimerica, composto Fos, Jun e / o l&#39;attivazione del fattore di trascrizione (ATF) membri. Fos-correlate antigene 1 e 2 (Fra-1 e Fra-2) sono in grado di regolare la differenziazione degli adipociti. Fra-1 altera differenziazione degli adipociti inibendo C / EBPα 8, mentre Fra-2 controlli adipociti fatturato 9. Fra-2 in tal modo non si riduce solo il numero degli adipociti reprimendo espressione PPARγ2 durante la differenziazione degli adipociti, ma diminuisce anche adipociti apoptosi attraverso la repressione diretta dei fattori ipossia-inducibile (HIF) espressione. La famiglia HIF è un heterodimeric complesso fattore di trascrizione, composto da HIF-1α, HIF-2α e HIF-1β. I eterodimeri sono costituiti da una proteina di ossigeno-sensibili HIF-α (HIF-1α o HIF-2α) e l&#39;HIF-1β subunità ossigeno-insensitive 10. Durante normoxia, proteine ​​HIF-α sono poli-ubiquitinylated e sono finalmente degradati da proteasomi 11. In condizioni di ipossia, si verificano in corso di espansione, proteine ​​HIF-α non sono più idrossilato. Essi hanno quindi diventano dimeri stabilizzati e forma con l&#39;HIF-1β costitutivamente espresso. Attivazione trascrizionale di geni controllati dagli elementi di risposta HIF è coinvolto nella regolazione dell&#39;angiogenesi, il metabolismo, e l&#39;infiammazione 12. Infatti, HIF-1α promuove AT disfunzione inducendo tolleranza al glucosio, inibendo dispendio energetico e l&#39;utilizzo periferico lipidi, nonché aumentando livello leptina e HFD indotta steatosi epatica 13. Inoltre, HIF-1α regola adipocyte apoptosi in vivo e in vitro 9. Il presente Protocollo descrive i metodi per lo studio in uno stato di svelare le caratteristiche molecolari di adipociti omeostasi in topi adulti. Essa mostra come l&#39;apoptosi, la proliferazione e la differenziazione di adipociti in vivo e in vitro possono essere regolate da ipossia. Per fare ciò, usiamo topi con adipociti specifico delezione di Fra-2 generato incrociando topi che trasportano i Fra-2 alleli floxed con i topi FABP4-CreERT 9. Utilizzando topi FABP4-Cre ERT, l&#39;eliminazione è adipociti specifica e inducibile per iniezione tamoxifene 14. Per il modello per adulti, intra iniezioni peritoneali di tamoxifene sono eseguite in 5 giorni consecutivi a partire all&#39;età di 6 settimane. Così, i topi sono sottoposti ad una dieta ricca di grassi o normale dieta per 6 settimane prima dell&#39;analisi è fatto. I topi utilizzati in questo studio sono stati maschio basano su uno sfondo C57Bl6 evitare ormoni femminili, quali estrogeni, Mostrato per regolare la distribuzione del grasso corporeo 15. Utilizzando un altro background genetico potrebbe anche alterare il fenotipo metabolico, a causa delle differenze di deformazione connessi nella gestione dei lipidi 16. Questo protocollo dimostra come analizzare al di sotto ipossia con istologia e come quantificare l&#39;apoptosi degli adipociti, proliferazione e la differenziazione in vivo utilizzando immunoistochimica e analisi del gene profiling. Lo studio è completato da esperimenti in vitro, che mostra come analizzare differenziazione degli adipociti primaria e l&#39;apoptosi alterato da esposizione a ipossia.

<table><tbody><tr><td>Soluzione RNAlater</td> Soluzione di <td>stabilizzazione dell'RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità</td><td>Biosystems</td> applicati <td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topo purificato Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Clone B56 (RUO)</td></tr><tr><td>Topo purificato Anti-umano Ki-67 Clone B56 (RUO)</td><td>550609</td><td>Marcatore</td><td></td>di proliferazione</tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Caspasi scissa-3 Corpo monoclonale di coniglio</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9664S</td><td>Clone 5A1E</td></tr><tr><td>Caspasi scissa-3 (Asp175) (5A1E) Corpo monoclonale di coniglio</td><td>9664</td><td>Marcatore</td><td></td>di apoptosi</tr><tr><td>Lipofectamin2000 Reagente&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Ioduro</td><td>T3605</td><td>Controcolorazione nucleare, colorazione monomerica dell'acido nucleico cianina, eccitazione&frasl; Emissione: 642&frasl; 661 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s hemalum</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>ematossilina</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, soluzione monofase di isotiocianato di guanidina e fenolo</td></tr><tr><td>Percellys Ceramic Kit 1.4&nbsp; mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>provette contenenti perle ceramiche (1,4 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>Omogeneizzatore</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Anticorpo</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Anticorpo, 16H4L13</td><td>700505</td><td>Marcatore</td><td></td> di ipossia</tr><tr><td>In Situ Kit di rilevamento della morte cellulare, Fluoresceina</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>Etichettatura nick end dUTP-biotina mediata da TdT (TUNEL)&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione Eosin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1&nbsp; unità/&micro; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>biotinilato anti topo IgG (H+L)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biotinilato anti topo IgG (H+L)</td><td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mezzo di montaggio con DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l&#39;apoptosi omeostasi

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considerando che il tessuto adiposo (AT) è un organo endocrino, può influenzare il metabolismo di tutto il corpo. Un eccessivo accumulo di energia porta alla disregolazione degli adipociti, che a sua volta induce una secrezione anomala di adipochine, innescando sindromi metaboliche come obesità, dislipidemia, iperglicemia, iperinsulinemia, insulino-resistenza e diabete di tipo 2. Pertanto, studiare i meccanismi molecolari alla base della disregolazione degli adipociti potrebbe aiutare a sviluppare nuove strategie terapeutiche. Il nostro protocollo descrive metodi per valutare il meccanismo molecolare influenzato dalle condizioni di ipossia dell'AT, che correla con l'apoptosi degli adipociti nei topi adulti. Questo protocollo descrive come analizzare l'AT in vivo attraverso il profilo di espressione genica e l'analisi istologica del differenziamento, della proliferazione e dell'apoptosi degli adipociti durante l'esposizione all'ipossia, accertata attraverso la colorazione di cellule ipossiche o della proteina HIF-1α. Inoltre, l'analisi in vitro del differenziamento degli adipociti e delle sue risposte a vari stimoli completa la caratterizzazione delle vie molecolari alla base di possibili disfunzioni adipocitarie che portano a sindromi metaboliche.

Mostriamo come determinare adipociti omeostasi in vivo e in vitro, utilizzando l&#39;esempio di Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT rispetto al wild-type cucciolata. Il nostro protocollo definisce come una maggiore espressione di HIF da ipossia è correlata con una disfunzione degli adipociti, come indicato da un aumento della apoptosi degli adipociti. topi aumento delle dimensioni degli adipociti e la zona a dieta ricca di grassi (HFD) trattati Over-nutrizione, tra gli altri fattori, si traduce in adipociti ipertrofia, causata da un eccessivo accumulo di energia nelle goccioline lipidiche. La dimensione degli adipociti e la zona è un indicatore di ipertrofia. Le sezioni del cuscinetto adiposo da normale (ND, figura 6a) e dieta ricca di grassi (HFD, figura 6b) topi e quantificazioni della dimensione degli adipociti e la zona mostrano chiaramente l&#39;ipertrofia degli adipociti dopo 6 settimanes di HFD, che è indicato da un aumento della dimensione degli adipociti nei topi trattati HFD (Figura 6c e d). L&#39;aumento ipossia nel tessuto adiposo (AT) degli adulti Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT porta ad un aumento di livello di HIF-1α e adipociti apoptosi Per determinare lo stato in vivo di ipossia in AT, Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT vengono analizzati 6 settimane dopo Fra-2 delezione all&#39;età di 12 settimane e confrontati con wild-type cucciolata. Pimonidazole viene somministrato a topi per via intraperitoneale come un marcatore ipossia efficace; non è tossico e in grado di distribuire in AT. Adipociti di ipossia in AT in vivo sono definiti dalla colorazione anticorpale immunoistochimica (Figura 7a). Inoltre, l&#39;aumento dello stato ipossico della AT nei topi è accompagnata da un aumento di HIF-1α ADIP positivoocytes come indicato dalla colorazione immunoistochimica figura 7b), che viene confermato dalla quantificazione dei livelli di espressione di HIF-1α e suoi obiettivi geni 9. Inoltre, TUNEL colorazione di sezioni a da Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT e nidiata di controllo (Figura 7c) mostra che l&#39;aumento degli adipociti apoptosi è correlata con la presenza di ipossia e di espressione di HIF-1α. L&#39;aumento dell&#39;espressione di HIF-1α in adipociti primari attraverso l&#39;ipossia indotta l&#39;apoptosi degli adipociti Per analizzare adipociti apoptosi in vitro, usiamo adipociti generati da cuscinetti di grasso sottocutaneo come descritto altrove 20. Come previsto, l&#39;espressione di HIF-1α in adipociti aumenta dopo 24 ore di ipossia (figura 8a). Per analizzare ulteriormente le attività di HIF-1α, i livelli di RNA di destinazione HIFgeni, come Inos (inducibile ossido nitrico sintasi) sono quantificati per qPCR. Figura 8b mostra che l&#39;aumentata espressione di HIF-1α in condizioni di ipossia porta ad aumento del livello di mRNA Inos. Dal momento che abbiamo già dimostrato in vivo (Figura 8), che ha aumentato l&#39;espressione di HIF-1α in adipociti correla con un aumento dell&#39;apoptosi degli adipociti, l&#39;apoptosi è anche quantificato in colture in vitro per annessina V colorazione in condizioni di ipossia. In accordo con i dati in vivo (Figura 7), un aumento del livello di HIF-1α è accompagnato da un aumento della apoptosi degli adipociti indotta da condizioni di ipossia (figura 8b). Inoltre, per dimostrare che l&#39;apoptosi ipossia indotta è HIF-dipendente; HIF-1α o HIF-2α è tacere da RNA interference in adipociti derivati ​​da wild-type o Fra-2 topi deficienti. L&#39;aumento di apoptosi degli adipociti viene ripristinata mettendo a tacere HIF-1α o HIF-2α come mostrato da Annessina<html> V colorazione in figura 8b, dimostrando che il sensore di ipossia HIF-α regola l&#39;apoptosi degli adipociti. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> Figura 6: Aumento della dimensione degli adipociti e la zona a dieta ricca di grassi topi (HFD) (a, b) H &amp; E colorazione di sezioni del cuscinetto adiposo perigonadal di topi wild-type maschi alimentati con dieta normale (ND) (a) o alto. dieta -Fat (HFD) (b) per 6 settimane. Barre rappresentano 500 micron. (C, d) quantificazioni delle dimensioni degli adipociti (c) e l&#39;area (d) del cuscinetto adiposo perigonadal di topi wild-type alimentati con ND (a) o HFD (b) per 6 settimane. n = 10. I dati sono riportati come valori medi ± SEM. L&#39;analisi statistica è stata effettuata utilizzando dello studente t-test. *** P &lt;0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> Figura 7: Aumento del livello di HIF-1α e apoptosi negli adipociti di adulti Fra 2-FL / FL topi FABP4-CreERT. L&#39;ipossia (a) e HIF-1α (b) colorazione in AT di Fra-2 fl / fl topi FABP4-creERT e controllo littermates maschi di 6 settimane dopo l&#39;iniezione tamoxifene maschile. Ingrandimento 20X, 40X inserire. frecce nere indicano le aree ipossiche e cellule positive HIF-1α. (C) TUNEL in Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT e fratellini di controllo a 6 settimane dopo l&#39;iniezione tamoxifene. Ingrandimento 20X, 40X inserire. frecce nere indicano cellule positive TUNEL. Questa cifra è stata modificata da Lutero etal. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> Figura 8:. L&#39;aumento dell&#39;espressione di HIF-1α e adipociti apoptosi in adipociti primari indotti da ipossia (a) Real-time PCR di HIF-1α e di destinazione HIF livelli Inos mRNA in adipociti primari sistemati in camere ipossiche analizzato nei punti di tempo indicato. (B) Quantificazione dell&#39;apoptosi da annessina V FACS colorazione in adipociti primari isolati da Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT o controlli wild-type trasfettate con controllo sh o sh plasmide contro HIF-1α o HIF-2α e posto sotto l&#39;ipossia (1% O 2) per 24 ore. Questa cifra è stata modificata da Lutero et al. <sup&gt; 9. I dati vengono visualizzati come valori medi ± SD L&#39;analisi statistica è stata effettuata utilizzando t-test di Student. * P &lt;0.05 e ** P &lt;0,01 sono stati accettati come significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Il tessuto adiposo (AT) può influenzare l'omeostasi di tutto il corpo, quindi è importante comprendere i meccanismi molecolari della differenziazione e della funzione degli adipociti. Forniamo un protocollo per ottenere nuove informazioni su questi processi analizzando l'omeostasi degli adipociti, la differenziazione e l'esposizione all'ipossia come modello per l'apoptosi indotta degli adipociti.

Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l&#39;apoptosi omeostasi

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Gli obiettivi generali di questi esperimenti sono analizzare l'omeostasi e la differenziazione degli adipociti e studiare i meccanismi dell'ipossia e dell'apoptosi degli adipociti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo, come l'obesità e il diabete di tipo II. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di procedure semplici ed economiche, che permettono l'analisi della biologia degli adipociti nel modello specifico di studio.Nicole Hannemann, una studentessa di dottorato del mio laboratorio, illustrerà le procedure. Per quantificare l'ipossia in vivo, determinare innanzitutto il peso corporeo del topo. Quindi somministrare 60 mg per kg di peso corporeo di pimonidazolo cloridrato solido per via intraperitoneale.Dopo 45 minuti fissare gli arti dell'animale e aprire la cavità peritoneale. Prelevare le tasche adipose perigonadali sinistra e destra dalla cavità ed eliminare i tessuti ghiandolari dalle tasche. Quindi pesare il tessuto per determinare il rapporto tra la massa della tasca adiposa e il peso corporeo, espresso in grammi.Per eseguire l'analisi istologica dell'omeostasi degli adipociti, inizialmente desparaffinare le sezioni di tessuto adiposo con tre lavaggi di cinque minuti in xilolo, seguiti da due reidratazioni di due minuti in etanolo al 100% e da altre due reidratazioni di due minuti in etanolo al 96%. Successivamente, lavare le sezioni in acqua distillata per cinque minuti e colorarle con ematossilina per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare nuovamente le sezioni in acqua per altri cinque minuti, seguiti da una colorazione di 30 secondi con soluzione di eosina.Lavare le sezioni come appena dimostrato. Quindi disidratare le sezioni in etanolo al 96% e in etanolo al 100%, due volte ciascuno per due minuti. Seguire con tre incubazioni in xilene di cinque minuti ciascuna.Quindi montare i preparati con un agente di montaggio anidro. Per l'analisi immunohistochimica dei tessuti, desparaffinare i preparati come appena illustrato, seguito da una digestione di 30 minuti con soluzione lavorativa di proteinasi K a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione, risciacquare i tessuti in PBS e bloccare la perossidasi endogena con perossido di idrogeno al 3% in PBS per 10 minuti.Dopo due lavaggi consecutivi di cinque minuti in PBS, bloccare qualsiasi legame non specifico degli anticorpi con il 10% di siero in PBS. Successivamente, incubare i tessuti con gli anticorpi di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, risciacquare le sezioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS.Quindi incubare i tessuti con gli opportuni anticorpi secondari biotinilati per un'ora a temperatura ambiente. Durante gli ultimi 30 minuti del periodo di marcatura con l'anticorpo secondario, equilibrare 50 microlitri di soluzione di avidina con 50 microlitri di perossidasi H biotinilata per sezione per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente lavare le sezioni due volte per cinque minuti ciascuna in PBS e trattare i tessuti con 100 microlitri di complesso ABC avidina-biotina a temperatura ambiente.Dopo 45 minuti, lavare i campioni due volte in PBS e incubare i tessuti nella soluzione del substrato perossidasi fino a quando la colorazione raggiunge il livello di intensità desiderato. A questo punto, lavare i campioni per cinque minuti con acqua distillata e controcolorare le cellule con ematossilina per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la controcolorazione, lavare nuovamente i tessuti in acqua.Quindi disidratare le sezioni e montare i campioni con coprivetrini utilizzando un agente di montaggio anidro. Le sezioni possono quindi essere valutate al microscopio in campo chiaro. Iniziare staccando la pelle del topo maschio adulto dalla coscia superiore, dalla zona lombare e dal fianco, fissando la pelle man mano che viene rimossa.Quindi, prelevare il tessuto adiposo sottocutaneo posteriore che circonda i linfonodi inguinali situati alla base delle zampe posteriori, per la coltura degli adipociti. Per analizzare la differenziazione adipogenica, posizionare la coltura cellulare adiposa differenziata sotto cappa chimica e lavare delicatamente le cellule con PBS. Successivamente, fissare le cellule in due mL di formalina al 10% per 60 minuti.Al termine della fissazione, lavare le cellule in acqua e trattare la coltura con due millilitri di isopropanolo al 60% per cinque minuti, seguiti da due millilitri di soluzione lavorativa di rosso O oil. Dopo cinque minuti, risciacquare le cellule con acqua corrente fino a quando l'acqua non diventa limpida. Quindi controcolorare le cellule con ematossilina come appena dimostrato.Le cellule possono quindi essere valutate al microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 100 volte. I lipidi degli adipociti appariranno rossi e i nuclei appariranno blu. Qui vengono mostrate sezioni del cuscinetto adiposo di topi alimentati con dieta normale e con dieta ricca di grassi.La quantificazione della dimensione e dell'area degli adipociti dimostra chiaramente l'ipertrofia adipocitaria dopo sei settimane di dieta ricca di grassi, come evidenziato dall'aumento della dimensione degli adipociti negli animali trattati con dieta iperlipidica. Nei topi trattati con il marcatore di ipossia pimonidazolo, lo stato ipossico aumentato del tessuto adiposo è accompagnato da un incremento degli adipociti positivi per HIF1 alfa. Inoltre, la colorazione TUNEL di sezioni adipose da animali knock out e relativi controlli dimostra che un aumento dell'apoptosi adipocitaria si correla con la presenza di ipossia e con l'espressione del fattore inducibile dall'ipossia 1 alfa.Come previsto, l'espressione di Hif1a negli adipociti aumenta dopo 24 ore di ipossia. Inoltre, la quantificazione dei geni bersaglio di Hif mediante QPCR indica che l'aumento dell'espressione di Hif1a in condizioni ipossiche determina un incremento dell'espressione di mRNA di Inos. Tuttavia, l'abbattimento di Hif1 o di Hif2 alfa mediante interferenza dell'RNA protegge gli adipociti dall'apoptosi in condizioni di ipossia, confermando il ruolo regolatorio sensoriale dell'ipossia svolto da Hif alfa nell'apoptosi degli adipociti.Seguendo queste procedure, tutti i saggi, come la determinazione del glucosio e della resistenza all'insulina, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo ai cambiamenti metabolici e alla disfunzione degli adipociti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi istologica dell'apoptosi adipocitaria e degli studi sull'ipossia.

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Biologia dello sviluppo

Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della "doratura" di grasso bianco.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).

L&#39;espansione e l&#39;adipogenesi dell&#39;induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per coltivare adipociti umani maturi. Qui dettagliamo come isolare gli adipociti dall'adiposo umano e come impostare il MAAC.

Isolamento e cultura degli adipociti maturi umani utilizzando le colture aggregate adipocite mature membrana (MAAC)

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.

Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Le interazioni proteina-proteina sono importanti per chiarire la funzione delle proteine bersaglio e la co-immunoprecipitazione (co-IP) può facilmente confermare i PPI. Abbiamo trasfettato transitoriamente un plasmide codificante una proteina marcata con epitopo in cellule HEK-293 e sviluppato un metodo di immunoprecipitazione per confermare facilmente il legame di due proteine bersaglio.

Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Scopri i meccanismi di omeostasi e differenziazione degli adipociti e l'impatto dell'ipossia sull'apoptosi. Questo metodo aiuta a studiare l'obesità e il diabete di tipo II.

Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l'apoptosi omeostasi

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