Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l'apoptosi omeostasi

Gli obiettivi generali di questi esperimenti sono analizzare l'omeostasi e il differenziamento degli adipociti e studiare i meccanismi dell'ipossia e dell'apoptosi degli adipociti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei metabolici come l'obesità e il diabete di tipo II. Il vantaggio principale di questa tecnica è che sono procedure di base e poco costose è che l'analisi della biologia degli adipociti nel tuo particolare modello di studi.

Nicole Hannemann, una dottoranda del mio laboratorio, dimostrerà le procedure. Per quantificare l'ipossia in vivo, determinare prima il peso corporeo del topo. Quindi iniettare 60 mg per kg di peso corporeo di irocloruro solido di pimonidazolo per via intraperitoneale.

Dopo 45 minuti fissare gli arti dell'animale e aprire la cavità peritoneale. Raccogliere i cuscinetti adiposi perigonadici sinistro e destro dalla cavità e rimuovere i tessuti gonadici dai cuscinetti. Quindi pesare il tessuto per determinare il rapporto cuscinetto adiposo per peso corporeo in grammi.

Per eseguire l'analisi istologica dell'omeostasi degli adipociti, deparaffinare prima le sezioni di tessuto adiposo con tre lavaggi di cinque minuti in xilene, seguiti da due reidratazioni di due minuti in etanolo al 100% e due reidratazioni di due minuti in etanolo al 96%. Quindi lavare le sezioni in acqua distillata per cinque minuti e colorarle con ematossilina per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni in acqua per altri cinque minuti, seguito da una colorazione di 30 secondi con soluzione di eosina.

Lavare le sezioni come appena dimostrato. Quindi disidratare le sezioni in etanolo al 96% e etanolo al 100% due volte ciascuna per due minuti. Seguito da tre incubazioni di xilene di cinque minuti.

Quindi montare le sezioni con un agente di montaggio anidro. Per l'analisi immunoistochimica dei tessuti deparaffinare le sezioni come appena dimostrato, seguita da una digestione di 30 minuti con soluzione di lavoro di proteinasi K a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione sciacquare i tessuti in PBS e bloccare la perossidasi endogena con il 3% di perossido di idrogeno in PBS per 10 minuti.

Dopo due successivi lavaggi di cinque minuti in PBS bloccano qualsiasi legame anticorpale non specifico con il 10% di siero in PBS. Quindi incubare i tessuti e gli anticorpi di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva risciacquare le sezioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS.

Quindi incubare i tessuti con gli anticorpi secondari biotinilati appropriati per un'ora a temperatura ambiente. Durante gli ultimi 30 minuti del periodo di marcatura degli anticorpi secondari, equilibrare 50 microlitri di soluzione di avidina con 50 microlitri di perossidasi H biotinilata per sezione per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le sezioni due volte per cinque minuti ciascuna in PBS e trattare i tessuti con 100 microlitri di avidina biotina ABC complex a temperatura ambiente.

Dopo 45 minuti, lavare le sezioni due volte in PBS e incubare i tessuti nella soluzione di substrato di perossidasi fino a quando la colorazione non raggiunge il livello di intensità appropriato. Ora lavate le sezioni per cinque minuti con acqua distillata e controcolorate le cellule con ematossilina per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la colorazione del bancone, lavare nuovamente i fazzoletti in acqua.

Quindi disidratare le sezioni e utilizzare un agente di montaggio anidro per montare i campioni con i vetrini coprioggetti. Le sezioni possono quindi essere valutate al microscopio a campo chiaro. Inizia staccando la pelle del topo maschio adulto dalla parte superiore della zampa, dal lombo e dal fianco, appuntando la pelle mentre viene rimossa.

Quindi raccogliere il tessuto adiposo sottocutaneo posteriore che circonda i linfonodi inguinali situati alla base delle zampe posteriori per la coltura degli adipociti. Per analizzare il differenziamento adipogenico, posizionare la coltura di cellule adipose differenziate sotto una cappa aspirante e lavare delicatamente le cellule con PBS. Quindi fissare le cellule in due mL di formalina al 10% per 60 minuti.

Al termine della fissazione, lavare le cellule in acqua e trattare la coltura con due millilitri di isopropanolo al 60% per cinque minuti, seguiti da due millilitri di olio di soluzione di lavoro di O rosso. Dopo cinque minuti sciacquare le celle con acqua di rubinetto fino a quando l'acqua non diventa limpida. E controcolorare le cellule con ematossilina come appena dimostrato.

Le cellule possono quindi essere valutate al microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 100 volte. I lipidi degli adipociti appariranno rossi e i nuclei appariranno blu. Qui vengono mostrate sezioni del cuscinetto adiposo di topi con dieta normale e ricca di grassi.

La quantificazione delle dimensioni e dell'area degli adipociti dimostra chiaramente l'ipertrofia degli adipociti dopo sei settimane di dieta ricca di grassi, come evidenziato dall'aumento delle dimensioni degli adipociti negli animali trattati con una dieta ricca di grassi. Nei topi che erano stati trattati con il marcatore ipossico pimonidazolo, l'aumento dello stato ipossico del tessuto adiposo è accompagnato da un aumento degli adipociti alfa positivi HIF1. Inoltre, la colorazione a tunnel delle sezioni adipose da compagni di cucciolata knock out e di controllo dimostra che un aumento dell'apoptosi degli adipociti è correlato con la presenza di ipossia e l'espressione del fattore alfa inducibile dall'ipossia

Come previsto, l'espressione di Hif1a negli adipociti aumenta dopo 24 ore di ipossia. Inoltre, la quantificazione dei geni bersaglio di Hif mediante QPCR indica che l'aumento dell'espressione di Hif1a in condizioni di ipossia porta ad un aumento dell'espressione dell'mRNA di Inos. Il silenziamento di Hif1 o 2 alfa mediante interferenza dell'RNA, tuttavia, salva gli adipociti dall'apoptosi in condizioni di ipossia, confermando il ruolo regolatorio sensoriale dell'ipossia di Hif alfa nell'apoptosi degli adipociti.

Seguendo queste procedure, tutti i test come la determinazione della resistenza al glucosio e all'insulina possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul cambiamento metabolico e sulla disfunzione degli adipociti. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi istologica degli studi sull'apoptosi e l'ipossia degli adipociti.