Name: Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Impara la tecnica di video imaging per mappare la motilità colica nei topi. Questo metodo permette di studiare la regolazione neuronale del sistema enterico e rilevare mutazioni genetiche sottili.

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JCB e ELH-Y sono stati sostenuti dal Dipartimento della Difesa statunitense CDMRP Programma Autism Research (AR11034). NHMRC (1047674) per ELH-Y.The maggio Stewart Bursary-Università di Melbourne fiducia finanziato borse di studio a MS. Ringraziamo Ali Taher, Fátima Ramalhosa e Gracia Seger per i contributi tecnici.

movimentazione degli animali e dislocazione cervicale degli animali prima di tutti gli esperimenti sono stati eseguiti rigorosamente secondo protocolli approvati dal Comitato sperimentazione animale per l&#39;Università di Melbourne (Etica ID: 1.212.494,7) 1. Tessuto Raccolta e dissezione <ol><li> Euthanize topi adulti per dislocazione cervicale. Se possibile evitare l&#39;anestesia per evitare influenze sulla funzione intestinale attraverso recettori situati sulle popolazioni neuronali di interesse. </li><li> Registrare il peso totale del corpo dell&#39;animale, pin il corpo (attraverso i quattro zampe, lato ventrale esposto a sperimentatore) saldamente ad una tavola di dissezione utilizzando aghi ipodermici (Dimensioni: 20 G). </li><li> Utilizzando dissettore e forbici; fare un&#39;incisione attraverso l&#39;epidermide sovrapponendo strati muscolari addominali inferiori. Continuare a utilizzare le pinze e forbici per aprire la cavità addominale lungo la linea mediana dell&#39;addome allo sterno. </li><li> Per evitare che la disidratazione dei tessuti, versare Physisalina meto- (soluzione Krebs: 118 NaCl, 4.6 KCl, 2,5 CaCl 2, 1.2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-glucosio in mM - bollito a RT con gas CarboGen; 95% O 2 e 5 % CO 2 per almeno 20 min) sul contenuto addominale a intervalli regolari (per esempio, ogni 30-60 sec) durante il processo di dissezione. </li><li> Per isolare i due punti, mentre attaccato al cieco e retto, tenere premuto il cieco (che si trova adiacente alla estremità prossimale del colon) delicatamente con dissettore circa 4-5 cm sopra il corpo dell&#39;animale durante il taglio del mesentere con le forbici dissezione multa. </li><li> Fare attenzione a non gestire, allungare o tagliare il tessuto gastrointestinale durante la rimozione del mesentere adiacente. </li><li> Rimuovere il tessuto in eccesso (cioè, vescica e testicoli). Utilizzando le forbici dissezione grossolana, fanno due incisioni verticali (cioè, circa 0,5 cm dalla linea mediana) per tagliare l&#39;osso pelvico su EAlato ch del colon. </li><li> Usare le forbici sottili per separare il retto dalla adiacente tessuto pelvico e finiture che circonda il muscolo dal colon. </li><li> Posizionare il colon full-length (da cieco al retto) in un bicchiere contenente soluzione fisiologica (in precedenza ossigenata con CarboGen) e continuare a ossigenare a temperatura ambiente. Rimuovere il cieco e del retto con le forbici dissezione pregiati e sostituire in coppa. </li><li> Vuoti pellet fecali / contenuto intestinale da preparati colon mediante l&#39;applicazione di una leggera pressione positiva al termine orale utilizzando una siringa da 5 ml collegata ad un puntale 200 ml riempita con soluzione fisiologica. Al fine di orientare il tessuto in futuro, utilizzare un perno di insetto per marcare la fine più prossimale del colon, dove striature nella mucosa sono visibili. <ol><li> Modificare la punta di plastica della pipetta per adattare la siringa da 5 ml, rimuovendo circa 1 cm dalla fine più ampio / prossimale usando una lama di rasoio. Per aumentare la portata, ampliare l&#39;/ estremità più piccola distale tagliando su un angle (circa 45 ° C) usando una lama di rasoio. </li></ol></li><li> Grip il tessuto del colon delicatamente alla sua estremità prossimale con dissettore, inserire la punta della pipetta nel lume del colon e del filo soluzione fisiologica attraverso il lume. </li></ol> 2. Preparazione del colon tessuti e set up sperimentale per Video Imaging <ol><li> Salina fisiologica filo attraverso tutta la tubazione collegata ad un bagno di due Chambered organo impostare (Figura 1 e Figura 3), utilizzando una siringa collegata ad una punta di pipetta 200 microlitri. Questo passaggio rimuove i detriti all&#39;interno del tubo che potrebbero bloccare il flusso di soluzione. Per tubi specifiche fare riferimento alla tabella dei materiali. </li><li> Assicurarsi che le camere del bagno per organi sono continuamente superfused con soluzione fisiologica bollito con CarboGen (95% O 2 e il 5% di CO 2, il tasso di 5 ml min -1 flusso). Utilizzando una sonda di temperatura ad intervalli regolari, affinché la temperature del bagno viene mantenuta tra 33 ° C -37 ° C. </li><li> Riempire il serbatoio afflusso collegato attraverso un rubinetto a 3 vie per il tubo di ingresso con 20-30 ml di soluzione salina fisiologica utilizzando una siringa da 50 ml. </li><li> Durante l&#39;esperimento, mantenere la pressione nel serbatoio afflusso utilizzando arubber tappo con un tubo di vetro (5 mm di diametro interno) inserito attraverso il suo centro. Assicurarsi che l&#39;apertura superiore del serbatoio di afflusso è sigillato in modo sicuro (con il tubo di vetro interno rimanendo sigillata). </li><li> Posizionare il colon (lunghezza 5-7 cm) nella camera di bagno per organi, assicurandosi che sia completamente immerso in soluzione salina fisiologica. </li><li> Cannulate ogni estremità del segmento colico ai due tubi di ingresso / uscita sommerse (ingresso / tubi di uscita di diametro può essere modificata in base alle dimensioni del lume tessuto es. Tessuto postnatale, topi adulti e cavia) in bagno usando standard di di cotone filati per cucire. Attaccare l&#39;estremità prossimale del colon al tubo di ingresso e laestremità distale del colon al tubo di uscita (collegato tramite un rubinetto a 3 vie per un tubo di efflusso verticale, 6 cm di altezza). Assicurarsi che il tessuto non sia ridotto al minimo o troppo rilassati dopo incannulamento per evitare interferenze con le misurazioni e le analisi future. </li><li> Registrare la lunghezza del colon misurando la distanza tra prossimali e distali cannulazioni utilizzando un righello di 15 cm. Questo è importante per interpretare variazioni di lunghezza di contrazione, velocità di propagazione e punti contrazione iniziazione. </li><li> Assicurare una pressione stabile di base del lume (cm H 2 O) è stabilito prima di iniziare l&#39;esperimento. Calcolare pressione luminale misurando la distanza verticale dal tessuto al menisco di soluzione fisiologica all&#39;interno del tubo di vetro di serbatoio di afflusso (orale) e il tubo di efflusso verticale (anale). </li><li> Mantenere preparati tissutali a pressione intraluminale costante (ad esempio, 1-2 cm H 2 O) assicurando che la pressio afflusso tappo ciecore è mantenuta costante e che non blocchi sono presenti nel set up. </li><li> Lasciare il colon ad equilibrarsi in soluzione salina fisiologica per 30 minuti prima di registrare i movimenti intestinali. Verificare la presenza di eventuali blocchi derivanti nei tubi in- o deflusso e rimuoverli applicando pressione attraverso il serbatoio di afflusso o da ri-cannulating le estremità orali e anali del colon. </li></ol> 3. Acquisizione Immagine e il protocollo sperimentale <ol><li> Movimenti intestinali record come file video con una videocamera (30 fotogrammi / sec, 640 x 840 pixel) posizionati 10-15 cm al di sopra del bagno per organi in una storta di laboratorio standard supporto (figura 1). </li><li> Aprire Virtual Dub (video software per la cattura) dalla icona sul desktop. Dalla scheda &#39;File&#39;, selezionare &#39;capture AVI&#39; per visualizzare l&#39;immagine della telecamera. Nella scheda deselezionare &#39;Audio&#39; &#39;consentire la cattura audio&#39; disabilitare il suono. <ol><li> Nella scheda Video selezionare &#39;compressione&#39; e &#39;DivX6.9.2. Codec &amp; #39; per comprimere i file video per ridurre al minimo l&#39;utilizzo di spazio di archiviazione. Questa funzione sarà disponibile sulla installazione del software di compressione &#39;DivX&#39;. </li></ol></li><li> Regolare manualmente la posizione della fotocamera in modo che l&#39;intero segmento del colon cannulato è visibile (con le regioni cannulated immediatamente adiacenti ai bordi verticali del fotogramma video) attraverso la finestra del software di acquisizione video (vedi Figura 1). Al fine di migliorare la qualità dell&#39;immagine e ridurre al minimo i riflessi, fissare uno schermo di carta / cartone al supporto della fotocamera per bloccare la luce estranea sul bagno di organo. Ottimizzare la qualità video regolando le impostazioni di luminosità, contrasto e l&#39;esposizione utilizzando l&#39;interfaccia software della fotocamera. <ol><li> Prima della registrazione, impostare un nome di file specifico; nella scheda &#39;File&#39;, selezionare &#39;file di cattura Set&#39; e specificare un nome univoco per il video. </li><li> Iniziare la cattura video premendo &#39;file di Capture&#39; dalla barra degli strumenti &#39;Capture&#39;. Per interrompere Recording selezionare il pulsante &#39;Stop capture&#39; o il tasto &#39;Esc&#39; sulla tastiera. </li></ol></li><li> Sostituire la soluzione salina fisiologica contenuta nel serbatoio di afflusso con soluzione fisiologica salina fresca ogni 30 min. <ol><li> pressione Record luminale (vedi 2.9) e l&#39;utilizzo di una sonda di temperatura, prendono atto della temperatura del bagno d&#39;organo. Ripetere questi passaggi durante l&#39;esperimento (ad esempio, ogni 30 minuti), al fine di garantire che queste variabili sono costanti. </li></ol></li><li> l&#39;attività del colon Record in totale per 3 ore (compresa l&#39;applicazione di droga e la durata washout). Per scopi di archiviazione dati, registrare i dati in segmenti video 15 min. Una completa esperimento in genere composto da registrazioni video 12 x 15 min. <ol><li> attività Record per 1 ora in condizioni di controllo (soluzione fisiologica). </li><li> Applicare il farmaco (sia superfused nel bagno o somministrata nel lume attraverso il serbatoio di afflusso) per 30 minuti a 1 ora. Nota: diverse vie di somministrazione possono yield effetti diversi 23. </li><li> Applicare fisiologica fresco al bagno o lume nel corso di un periodo di washout 1 ora. </li></ol></li></ol> 4. Elaborazione dati e la generazione di mappe spazio-temporale <ol><li> Processo di ogni linea di registrazione video utilizzando il software in-house scritto in MATLAB (R2012a, la versione 7.4, disponibile a richiesta), al fine di generare mappe spazio-temporali che illustrano la motilità del colon. <ol><li> Aperto software di analisi dalla icona sul desktop. </li><li> Nella finestra di comando, digitare &quot;Analyse2&quot; per aprire il pannello di controllo di analisi. </li></ol></li><li> Utilizzare la funzione di rilevamento dei bordi per generare mappe spazio-temporali cliccando su &quot;rilevamento bordo per i file .avi&quot; nella finestra del pannello di controllo. Questa funzione permetterà al software di analisi per leggere i video ricodificato in formato Audio Video Interleaved (AVI). </li><li> Eseguire le seguenti operazioni in sequenza per generare mappe spazio-temporali utilizzando un adaalgoritmo di rilevamento dei bordi ptive. <ol><li> Aprire i file video registrati selezionando la scheda &quot;Aggiungi file&quot;, selezionare &#39;Apri video&#39; e selezionare la posizione dei file video. </li><li> Dalle file video elencati all&#39;interno del software di analisi, selezionare il file di interesse. </li><li> Selezionare una regione rettangolare di interesse all&#39;interno della cornice del video, ad esempio, l&#39;intera lunghezza del colon, dal punto in cui il colon è cannulata oralmente alla cannulazione anale. Assicurarsi che i punti di incannulamento prossimale e distale sono adiacenti ai confini verticali della regione di interesse. Linee rilevamento dei bordi (rosso e verde) saranno automaticamente appaiono sovrapposta l&#39;immagine in tempo reale su. </li><li> Assicurarsi che le linee di soglia di rilevamento dei bordi sono immediatamente adiacente al colon su entrambi i limiti superiore e inferiore del tessuto colon (questo può essere ottimizzato per ogni video alterando valori di soglia di rilevamento sul pannello di controllo). Assicurarsi che il bordo di rilevamento lines sono continui lungo la lunghezza dell&#39;immagine colon regolando il contrasto e luminosità utilizzando il pannello di controllo. </li><li> Inserire l&#39;intera lunghezza del colon (mm) nella finestra di dialogo larghezza (come registrato al punto 2.7). Quindi selezionare &quot;Genera mappa di calore&quot;. </li><li> Nella finestra pop-up, selezionare un percorso per il file da salvare e specificare un nome di file per la mappa spazio-temporale. </li><li> Selezionare il formato &#39;.su2&#39; e selezionare &#39;Aggiungi alla coda&#39;. Nota: formato .su2 comprime i dati di un file di dimensioni più piccole e più file video possono essere aggiunti alla coda. </li><li> Seleziona &#39;Inizia il rilevamento&#39; per generare mappe spazio-temporali. </li></ol></li></ol> 5. Analisi di mappe spazio-temporale <ol><li> Utilizzare mappe spazio-temporali per stimare i parametri come la frequenza, la velocità di propagazione, la lunghezza e la durata di CMMCs, diametro intestinale e il punto di inizio e la direzione delle contrazioni. <ol><li> Per avviare l&#39;analisi spazio-temporalemappe, tipo &#39;analyse2&#39; nella finestra di comando, come descritto nella sezione precedente. Invece di &quot;rilevazione Edge&quot;, selezionare il pulsante &quot;Heat mappa di analisi&quot;. </li><li> Aprire file mappa spazio-temporali (file .su2) selezionando la scheda &#39;Aggiungi file&#39; e specificando la posizione dei file precedentemente ottenuti .su2. </li><li> Una volta che la mappa spazio-temporale è visibile sullo schermo, specificare un intervallo di colori sul pannello di controllo, assicurando che il minimo è impostato su 1. Si noti che il massimo può variare del 5-10 secondo la contrattilità del tessuto. </li><li> Seleziona &#39;gamma di colori di blocco&#39; al fine di garantire tutte le mappe da un singolo esperimento sono analizzate nelle medesime condizioni. </li><li> Verificare che le impostazioni del telaio di tempo sono costanti per tutte le mappe spazio-temporali di un dato esperimento. </li></ol></li><li> Al fine di determinare la frequenza CMMC, contare manualmente contrazioni che attraversano più del 50% della lunghezza del colon. Queste contrazioni possono essere visuazato come striature rosso / arancio (indice di colore standard HSV) sulla mappa spazio-temporale (vedi figura 2 per un esempio). Altri contrazioni che sono più o non si propagano possono anche essere identificati e quantificati. </li><li> Se lo si desidera, condurre ulteriori analisi a una risoluzione maggiore di esse. Ad esempio, le proprietà dettagliate inclusa la velocità e la durata di ogni contrazione possono essere esaminati. <ol><li> Per misurare la velocità e la durata, selezionare il pulsante &quot;Annota onde contrazione&quot; sulla mappa di calore pannello di controllo analisi. </li><li> Successivamente, lo zoom per ogni CMMC facendo clic sul pulsante &quot;Zoom&quot; e selezionando la zona di interesse. Quindi selezionare il pulsante &quot;annotare manualmente&quot; per annotare ogni contrazione usando il mouse per disegnare una linea dalla posizione più iniziale alla fine di ogni contrazione. Questo metodo può essere usato per misurare la velocità di propagazione apparente e la durata di dilatazioni che sembrano propagare (per esempio, vedere unaal fine di mappe in Figura 2A, 2B). Nota: appariranno i dati per la velocità e la durata sotto la finestra dei risultati. Questi valori possono essere trasferiti ad un foglio di calcolo di interesse selezionando la scheda &quot;Esporta dati&quot;. annotazioni indesiderati possono essere rimossi facendo clic sul pulsante &quot;Rimuovi le annotazioni selezionati&quot;. </li></ol></li><li> Se lo si desidera, utilizzare il coordinate xey delle mappe spazio-temporali (tempo e posizione lungo il colon, rispettivamente) per determinare la posizione di apertura di piccole contrazioni o CMMCs. </li><li> Allo stesso modo, al fine di determinare gli intervalli tra le contrazioni, utilizzare la funzione &quot;Annota&quot; per misurare la durata tra le contrazioni. Come in precedenza, questi risultati possono essere esportati in un foglio di calcolo selezionando la scheda &quot;Esporta dati&quot;. </li><li> Al fine di misurare la larghezza intestino riposo, selezionare il pulsante &quot;Take sezione&quot; sul pannello di analisi cartina calore. <ol><li> Seleziona &#39;Aggiungi9; sul pannello sezioni trasversali temporale. Fare doppio clic in qualsiasi posizione all&#39;interno della mappa per generare una linea orizzontale sovrapposta alla mappa di calore. Dati diametro Gut verranno visualizzati in una nuova finestra. </li><li> Per misurare il diametro dell&#39;intestino, posizionare il cursore su un picco e di valle adiacente per ottenere larghezza media intestino per una condizione sperimentale specifica. Cambiamenti di diametro budello possono essere confrontati tra le condizioni sperimentali. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Utilizzando questa tecnica di imaging video, frequenza CMMC è stata misurata come un&#39;indicazione di motilità del colon in topi wild-type e NL3 R451C, un modello murino di spettro autistico disturbo 17. I nostri risultati indicano una riduzione del numero di CMMCs nei topi mutanti NL3 R451C rispetto ai topi wild-type in presenza del 5HT 3/4 antagonista del recettore Tropisetron suggerendo che i topi NL3 R451C mostrano una maggiore sensibilità agli Tropisetron. Di...

Il sistema nervoso enterico (ENS) è la rete neuronale intrinseca del tratto gastrointestinale e modula diverse funzioni come la digestione del contenuto intestinale, l&#39;assorbimento delle sostanze nutritive e la secrezione e riassorbimento di fluido. I neuroni del ENS si trovano nelle mienterici e sottomucosa plessi. Il plesso mioenterico svolge un ruolo importante nella regolazione della motilità gastrointestinale 1 mentre il plesso sottomucoso è principalmente coinvolto nel controllo della secrezione 2,3. Il plesso mioenterico si trova tra gli strati muscolari longitudinali e circolari della parete gastrointestinale. L&#39;attività contrattile degli strati muscolari lisce della parete intestinale facilita le funzioni primarie del tratto gastrointestinale mescolando e propulsione contenuto intestinale lungo la lunghezza dell&#39;intestino 3. Sebbene l&#39;innervazione estrinseca al tratto gastrointestinale dal CNS contribuisce alla funzione gastrointestinale in vivo, L&#39;ENS è in grado di regolare la funzione gastrointestinale in modo indipendente. Questa caratteristica unica permette l&#39;indagine funzionale dei circuiti neuronali enterici e il loro contributo alla motilità gastrointestinale ex vivo. Colon migrazione complessi a motore (CMMCs) sono spontanee, eventi neurogene che sono il modello del motore predominante osservato nel colon isolato mouse in assenza di pellet fecali 4-9. CMMCs sono definiti come contrazioni ritmiche che si propagano lungo una distanza orizzontale che è almeno metà della lunghezza totale del colon (cioè, dal cieco al retto) 10. Il rapporto tra CMMCs e gli schemi contrattili che spingono pellet fecali è ancora da essere chiaramente stabilita, tuttavia alcune differenze farmacologiche sono stati segnalati 11. Tuttavia, la capacità del ENS di funzionare indipendentemente del SNC e l&#39;esistenza di schemi motori neurali mediata nella SIcolon olated fornisce un sistema di test ideale per esaminare i disturbi della motilità che derivi dalla sottostante disfunzione ENS. La spontaneità di schemi motori gastrointestinali permette cambiamenti funzionali in risposta a stimoli farmacologici da valutare. L&#39;uso di immagini video e mappatura spazio-temporale è stato sviluppato per esaminare quantitativamente piccolo peristalsi intestinale nelle cavie 12. Qui, una tecnica ex vivo è descritto che consente lo studio di topo modelli di motilità del colon utilizzando immagini video e l&#39;analisi di queste registrazioni per costruire ad alta risoluzione (~ 100 micron, 33 msec) mappe del diametro del colon in funzione della posizione lungo il colon e di tempo (mappe spazio-temporali). L&#39;utilizzo in-house software di rilevamento dei bordi (Analyse2; a richiesta), i dati di piena lunghezza segmenti del colon contraente in tempo reale vengono elaborate per generare mappe spazio-temporali per ogni esperimento. In questa fase, i file video (AVI) sono summarizzato e convertito in mappe spazio-temporali che utilizzano Analyse2. Mappe spazio-temporali (Figura 2) descrivono contrattilità nel tempo e consentono di misurare più parametri quali la velocità di propagazione, ampiezza, lunghezza e durata. diametro Gut è registrato anche per tutta la durata dell&#39;esperimento come misura della contrattilità complessiva del segmento tissue. Questo metodo può essere applicato per identificare differenze nel punto di innesco di complessi contrattili che potrebbe indicare connettività neuronale enterica alterata. Un simile protocollo video di imaging progettato per valutare pellet propulsione in cavie &#39;stato segnalato 13 tuttavia qui descriviamo l&#39;applicazione dell&#39;approccio immagini video per la quantificazione della motilità del colon spontanea (cioè in assenza di pellet). Forniamo anche informazioni dettagliate per facilitare la dissezione e preparazione del tessuto gastrointestinale per l&#39;approccio di immagini video. Questoprotocollo fornisce ai ricercatori con uno strumento accessibile e facilmente replicato per l&#39;analisi enterico controllo neurale della funzione gastrointestinale in modelli animali di malattie tra cui modelli genetici di topo. La tecnica di immagini video permette l&#39;analisi della motilità del colon in risposta a vari agenti farmacologici. I farmaci possono essere somministrati tramite lume intestinale o il bagno per organi esterni alla preparazione del colon. Diverse regioni del tratto gastrointestinale topo mostrano modelli di motilità specifici come piccola segmentazione intestinale e CMMCs nel colon. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare le differenze di deformazione in piccola funzione intestinale; sensibilità differenziale 5-HT 3 e 5-HT 4 antagonisti sono stati osservati nel digiuno di Balb / c topi C57 / BL6 causa della natura polimorfica del gene TPH2 espressa nei due ceppi 6. L&#39;effetto di inibizione 5-HT sulla motilità rimane controversa, come dati contrastanti stato segnalato l&#39;importanza di endogena 5-HT su peristalsi del colon e CMMCs 14,15. Alterazioni della motilità pre e dopo la nascita durante lo sviluppo 7, e gli effetti di mutazioni del gene sulla motilità gastrointestinale in modelli animali di malattia 10 possono essere esaminati anche dal utilizzando immagini video. Qui illustriamo uso del metodo per lo studio della motilità del colon nel modello murino NL3 R451C di autismo, che esprime una mutazione missense nel gene che codifica per la NLGN3 sinaptica proteina di adesione neuroligin-3 16. Questa mutazione è stato identificato in pazienti con diagnosi di disturbo dello spettro autistico (ASD) 17, che è fortemente associato con IG disfunzioni 18-22. Abbiamo studiato se la mutazione sinaptica NL3 R451C colpisce uscite neurali nel ENS con la tecnica video di imaging. Presentiamo i dati che caratterizzano CMMCs al basale e in risposta alla 5H serotoninergicaT 3/4 antagonista del recettore tropisetron nel modello murino NL3 R451C di autismo.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (MW: 58,44)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl (MW: 74,55)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O (MW: 156,01)</td><td>Alimentazione chimica</td><td>471-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 .7H20 (MW: 246.48)</td><td>Fornitura chimica</td><td>MA048</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O (MW: 147.02)</td><td>Fornitura chimica</td><td>CA033</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio anidro (MW: 180.16)</td><td>Fornitura chimica</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (MW: 84.01)</td><td>Fornitura chimica</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'organo a due camere Dimensioni: 14 cm x 8 cm x 3 cm</td> Laboratorio <td>di contatto su misura</td><td></td><td>direttamente...</td></tr><tr><td>&nbsp; 732 SIGILLANTE MULTIUSO TRASPARENTE</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1890573</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 KIT ELASTOMERO SILICONICO</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>0912-2006</td><td></td></tr><tr><td>SIRINGHE con punte Luer Lock 50 ml, 20 ml, 10 ml</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1,57 mm (ID) x 3,16 mm (OD) - Tubi Silastic Masterflex</td><td></td><td>508-008</td><td></td></tr><tr><td>1,02 mm (ID) x 2,16 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>1,50 mm (diametro interno) x 2,50 mm (diametro esterno) - Tubi Silastic</td><td>Masterflex</td><td>508-007</td><td></td></tr><tr><td>1,60 mm (diametro interno) - Tubi in silicone polimerizzato al platino&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 14</td><td></td></tr><tr><td>4.40 mm (ID) - Tubo in silicone polimerizzato al platino&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3,10 mm (ID) - Tubo in silicone polimerizzato al platino&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 -16</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi in Vetro Graduati da Laboratorio - 500 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>100-400</td><td></td></tr><tr><td>TAPPO IN GOMMA CHIMICA 57 x 65 mm&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAPPO IN GOMMA CHIMICA 29 mm x 32 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scaldabagno&nbsp; (termoregolatore)&nbsp;</td><td>Ratek&nbsp;</td><td>TH7000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virtual Dub - 1.9 11</td><td>virtualdub.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2012a&nbsp;</td><td>Graph Pad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logitech Software per webcam</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

video imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Il sistema nervoso enterico (ENS) gioca un ruolo importante nella regolazione gastrointestinale (GI) motilità e può funzionare indipendentemente dal sistema nervoso centrale. Cambiamenti nella funzione ENS sono una delle principali cause di sintomi gastrointestinali e malattie e possono contribuire a sintomi gastrointestinali riportati in disturbi neuropsichiatrici, tra cui l&#39;autismo. E &#39;ben noto che isolati segmenti del colon generano spontanei, contrazioni ritmiche note come colon Migrazione motore Complessi (CMMCs). Una procedura per analizzare la regolazione neurale enterica di CMMCs in ex vivo preparazioni di due punti del mouse è descritto. Il colon è sezionato dall&#39;animale e lavato per rimuovere i contenuti fecale prima di essere cannulate in un bagno d&#39;organo. I dati vengono acquisite tramite una telecamera posizionata sopra la vasca organo e convertito in mappe spazio-temporali ad alta risoluzione tramite un pacchetto software in-house. Utilizzando questa tecnica, i modelli contrattili di base e gli effetti farmacologici sulla funzione ENS a colon segments possono essere confrontati più di 3-4 ore. Inoltre, la lunghezza e la velocità di propagazione di CMMCs possono essere registrate così come i cambiamenti di diametro intestino e la frequenza di contrazione. Questa tecnica è utile per la caratterizzazione di modelli della motilità gastrointestinale in modelli di topi transgenici (e in altre specie, tra cui ratti e cavie). In questo modo, i cambiamenti indotti farmacologicamente in CMMCs sono registrati nei topi wild-type e nel modello di topo R451C neuroligin-3 di autismo. Inoltre, questa tecnica può essere applicata ad altre regioni del tratto gastrointestinale compreso il duodeno, digiuno e ileo e a diverse età dello sviluppo nei topi.

Fino al 90% dei pazienti con ASD sperimentare una vasta gamma di disturbi gastrointestinali, come diarrea e costipazione 18,24,25. Tuttavia, le cause di questi problemi gastrointestinali sono sconosciuti. Molte mutazioni identificate nei pazienti con ASD sono associati a proteine ​​sinaptiche che contribuiscono ad alterazioni e disturbi nella trasmissione o la funzione sinaptica. Una tale mutazione, nel gene che codifica per la molecola di adesione delle cellule neuroligin-3 (...

Questo articolo descrive una tecnica di imaging video e una mappatura spazio-temporale ad alta risoluzione per identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità del colon nei topi adulti. Effetti sottili sulla funzione gastrointestinale (GI) possono essere rilevati utilizzando questo approccio in preparati tissutali isolati per migliorare la nostra comprensione della malattia gastrointestinale.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità colonica nei topi mediante imaging video. Questa tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze enteriche, ad esempio se mutazioni genetiche sottili nei geni neuronali influenzino la motilità colonica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il tessuto è isolato in assenza di input dal sistema nervoso centrale, consentendo così di studiare il coinvolgimento del sistema nervoso enterico nel controllo della motilità gastrointestinale.Questa tecnica si estende alla terapia di malattie neurosviluppati come l'autismo, poiché mutazioni geniche che alterano la funzione sinaptica nel cervello potrebbero inoltre alterare la motilità intestinale. Iniziare utilizzando pinze e forbici da dissezione per praticare un'incisione attraverso l'epidermide sovrastante i muscoli addominali inferiori. Aprire la cavità addominale lungo la linea mediana fino allo sterno.Inumidire il tessuto con soluzione fisiologica e utilizzare la pinzetta per sollevare delicatamente il cieco di quattro-cinque centimetri al di sopra dell'addome. Quindi, utilizzando forbici da dissezione fini, rimuovere il mesentere, avendo cura di non toccare, stirare o tagliare il tessuto gastrointestinale. Rimuovere la vescica, i testicoli e qualsiasi altro tessuto in eccesso.Quindi, utilizzando forbici da dissezione grossolane, effettuare due incisioni verticali approssimativamente a 0,5 centimetri dalla linea mediana nell'osso pelvico su ciascun lato del colon e usare le forbici fini per staccare il retto dal tessuto pelvico adiacente. Rimuovere il mesentere dal colon e risciacquare il tessuto del colon per tutta la sua lunghezza in un becher contenente soluzione salina fisiologica. Per rimuovere i pellet fecali e altri contenuti intestinali, tagliare innanzitutto circa un centimetro dall'estremità di una pipetta da 200 microlitri e collegare la pipetta a una siringa da cinque millilitri riempita con soluzione salina fisiologica.Quindi, dopo aver rimosso il ceco e il retto, posizionare un ago da insetti nell'estremità più prossimale del colon, dove sono visibili le striature della mucosa, per orientare il tessuto. Ora, afferrare delicatamente il tessuto all'estremità prossimale e inserire la punta della pipetta nella luz per far scorrere la soluzione salina fisiologica attraverso il colon in un contenitore di rifiuti. Successivamente, utilizzando la stessa siringa e la stessa punta della pipetta, eliminare eventuali detriti dai tubi collegati a un bagnomaria a due camere con soluzione salina fisiologica fresca.Impostare il bagno d'organo in modo che le camere vengano continuamente superfuse con soluzione salina fisiologica saturata con carbogeno e utilizzare una sonda termica per verificare regolarmente che la temperatura della soluzione salina rimanga compresa tra 33 e 37 gradi Celsius. Utilizzare un tappo di gomma con un tubo di vetro dal diametro interno di cinque millimetri inserito al centro per mantenere la pressione nel serbatoio di ingresso. Successivamente, immergere completamente un segmento di colon lungo da cinque a sette centimetri nella camera del bagno d'organo e utilizzare pinze e comune filo di cotone da cucito per canulare l'estremità prossimale del colon al tubo di ingresso e l'estremità distale del colon al tubo di uscita.Dopo aver determinato la distanza di base tra le cannullazioni prossimale e distale del colon, equilibrare il tessuto in soluzione salina fisiologica per 30 minuti. Per registrare i movimenti intestinali, mentre il colon si sta adattando, posizionare una videocamera da 10 a 15 centimetri sopra il bagno d'organo su un normale treppiede da laboratorio e configurare il software appropriato per l'acquisizione video. Quando la videocamera è pronta, registrare quattro segmenti video di 15 minuti ciascuno del colon in condizioni di controllo.Quindi, perfondere il farmaco di interesse nel bagno d'organo per 30-60 minuti, acquisendo altri quattro segmenti video di 15 minuti ciascuno. Infine, sostituire la soluzione trattata con soluzione salina fisiologica fresca e registrare altri quattro segmenti video di 15 minuti ciascuno durante il periodo di lavaggio di un'ora. Successivamente, possono essere generati mappe spaziotemporali del colon in risposta ai diversi periodi di trattamento.Per valutare se le mutazioni sinaptiche alterino i complessi motori migranti del colon, o CMMC, quando il sistema nervoso enterico è perturbato farmacologicamente, in questo esperimento è stato aggiunto nella camera della bacinella per preparati organici del colon l'antagonista dei recettori 5-HT3 e 4, la tropisetrona. In presenza di tropisetrona, i topi NL3R451C hanno mostrato una riduzione della frequenza dei CMMC rispetto ai loro consanguinei di tipo selvatico. Sebbene non siano state osservate differenze significative tra la contrattilità dei topi di tipo selvatico e quella dei topi NL3R451C in condizioni controllate, la tropisetrona ha ridotto significativamente la frequenza dei CMMC sia nei topi di tipo selvatico che in quelli NL3R451C.Inoltre, il tropisetron ha indotto un effetto maggiore sulla frequenza dei CMMC nei topi NL3R451C rispetto agli animali di tipo selvatico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa tecnica, assicurarsi che il bagno d'organo sia mantenuto a temperatura costante, che riceva un'apporto continuo di carbogeno e che l'eccesso di soluzione fisiologica sia prevenuto mediante un sistema a vuoto.Seguendo questa procedura, altre tecniche come l'immunocitochimica possono essere eseguite per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se ci sono variazioni nelle proporzioni neuronali o nel numero di cellule nei topi che mostrano una motilit&agrave; colica alterata. Da quando &egrave; stato sviluppato, questo metodo ha permesso una variet&agrave; di studi sulla motilit&agrave; intestinale in specie come criceto, coniglio, ratto e altre, e in particolare, in questo caso, nel topo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come identificare i cambiamenti nella regolazione neuronale della motilit&agrave; colica mediante imaging video.

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Valutazione della motilità del colon nel colon distale cavia con il monitor Motilità Gastrointestinale (Gimm) è un approccio diretto e semplice per imparare a valutare quantitativamente motilità propulsiva nel tratto gastrointestinale.

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Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono le cellule pacemaker del tratto gastrointestinale (GI). Essi formano reti complesse tra le cellule muscolari lisce e fibre neuronali post-gangliari per regolare contrattilità gastrointestinale. Qui vi presentiamo metodi di immunofluorescenza trasversale e con tutto il supporto di visualizzazione murini reti ICC.

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Fabbricazione e impianto di miniatura a doppio elemento Estensimetri per misurazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinale Contrazioni nei roditori.

Utilizzando topi reporter transgenici ed etichette fluorescenti iniettabili, la microscopia confocale a disco rotante intravitale a lungo termine consente la visualizzazione diretta del comportamento delle cellule mieloidi nell'adenoma intestinale nel modello di cancro colorettale ApcMin/+.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in Apc Min / + Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Descriviamo metodi per il monitoraggio longitudinale dell'efficacia delle terapie per il trattamento delle patologie del colon nei topi utilizzando un endoscopio rigido. Questo protocollo può essere facilmente utilizzato per la caratterizzazione della risposta terapeutica di un singolo tumore in topi vivi e anche per il monitoraggio di potenziali recidive di malattia.

Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

Le tecniche di registrazione video e mappatura spaziotemporale (STmap) recentemente disponibili consentono di visualizzare e quantificare sia i modelli di propagazione che quelli di miscelazione della motilità intestinale. L'obiettivo di questo protocollo è quello di spiegare la generazione e l'analisi di STmap utilizzando il sistema di monitoraggio della motilità gastrointestinale (GIMM).

Mappatura spazio-temporale di motilità in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparazioni di intestini

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue.

Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Questo protocollo delinea un metodo di immunocolorazione dell'intero stomaco modificato dalla tecnica "Swiss roll" originariamente sviluppata per l'intestino murino.

Mappatura spaziale migliorata degli strati muscolari gastrici del topo utilizzando una tecnica modificata dello Swiss Roll

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Impara la tecnica di video imaging per mappare la motilità colica nei topi. Questo metodo permette di studiare la regolazione neuronale del sistema enterico e rilevare mutazioni genetiche sottili.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

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