Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

L'obiettivo generale di questa tecnica è identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità colonica nei topi mediante imaging video. Questa tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze enteriche, ad esempio se mutazioni genetiche sottili nei geni neuronali influenzino la motilità colonica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il tessuto è isolato in assenza di input dal sistema nervoso centrale, consentendo così di studiare il coinvolgimento del sistema nervoso enterico nel controllo della motilità gastrointestinale.

Questa tecnica si estende alla terapia di malattie neurosviluppati come l'autismo, poiché mutazioni geniche che alterano la funzione sinaptica nel cervello potrebbero inoltre alterare la motilità intestinale. Iniziare utilizzando pinze e forbici da dissezione per praticare un'incisione attraverso l'epidermide sovrastante i muscoli addominali inferiori. Aprire la cavità addominale lungo la linea mediana fino allo sterno.

Inumidire il tessuto con soluzione fisiologica e utilizzare la pinzetta per sollevare delicatamente il cieco di quattro-cinque centimetri al di sopra dell'addome. Quindi, utilizzando forbici da dissezione fini, rimuovere il mesentere, avendo cura di non toccare, stirare o tagliare il tessuto gastrointestinale. Rimuovere la vescica, i testicoli e qualsiasi altro tessuto in eccesso.

Quindi, utilizzando forbici da dissezione grossolane, effettuare due incisioni verticali approssimativamente a 0,5 centimetri dalla linea mediana nell'osso pelvico su ciascun lato del colon e usare le forbici fini per staccare il retto dal tessuto pelvico adiacente. Rimuovere il mesentere dal colon e risciacquare il tessuto del colon per tutta la sua lunghezza in un becher contenente soluzione salina fisiologica. Per rimuovere i pellet fecali e altri contenuti intestinali, tagliare innanzitutto circa un centimetro dall'estremità di una pipetta da 200 microlitri e collegare la pipetta a una siringa da cinque millilitri riempita con soluzione salina fisiologica.

Quindi, dopo aver rimosso il ceco e il retto, posizionare un ago da insetti nell'estremità più prossimale del colon, dove sono visibili le striature della mucosa, per orientare il tessuto. Ora, afferrare delicatamente il tessuto all'estremità prossimale e inserire la punta della pipetta nella luz per far scorrere la soluzione salina fisiologica attraverso il colon in un contenitore di rifiuti. Successivamente, utilizzando la stessa siringa e la stessa punta della pipetta, eliminare eventuali detriti dai tubi collegati a un bagnomaria a due camere con soluzione salina fisiologica fresca.

Impostare il bagno d'organo in modo che le camere vengano continuamente superfuse con soluzione salina fisiologica saturata con carbogeno e utilizzare una sonda termica per verificare regolarmente che la temperatura della soluzione salina rimanga compresa tra 33 e 37 gradi Celsius. Utilizzare un tappo di gomma con un tubo di vetro dal diametro interno di cinque millimetri inserito al centro per mantenere la pressione nel serbatoio di ingresso. Successivamente, immergere completamente un segmento di colon lungo da cinque a sette centimetri nella camera del bagno d'organo e utilizzare pinze e comune filo di cotone da cucito per canulare l'estremità prossimale del colon al tubo di ingresso e l'estremità distale del colon al tubo di uscita.

Dopo aver determinato la distanza di base tra le cannullazioni prossimale e distale del colon, equilibrare il tessuto in soluzione salina fisiologica per 30 minuti. Per registrare i movimenti intestinali, mentre il colon si sta adattando, posizionare una videocamera da 10 a 15 centimetri sopra il bagno d'organo su un normale treppiede da laboratorio e configurare il software appropriato per l'acquisizione video. Quando la videocamera è pronta, registrare quattro segmenti video di 15 minuti ciascuno del colon in condizioni di controllo.

Quindi, perfondere il farmaco di interesse nel bagno d'organo per 30-60 minuti, acquisendo altri quattro segmenti video di 15 minuti ciascuno. Infine, sostituire la soluzione trattata con soluzione salina fisiologica fresca e registrare altri quattro segmenti video di 15 minuti ciascuno durante il periodo di lavaggio di un'ora. Successivamente, possono essere generati mappe spaziotemporali del colon in risposta ai diversi periodi di trattamento.

Per valutare se le mutazioni sinaptiche alterino i complessi motori migranti del colon, o CMMC, quando il sistema nervoso enterico è perturbato farmacologicamente, in questo esperimento è stato aggiunto nella camera della bacinella per preparati organici del colon l'antagonista dei recettori 5-HT3 e 4, la tropisetrona. In presenza di tropisetrona, i topi NL3R451C hanno mostrato una riduzione della frequenza dei CMMC rispetto ai loro consanguinei di tipo selvatico. Sebbene non siano state osservate differenze significative tra la contrattilità dei topi di tipo selvatico e quella dei topi NL3R451C in condizioni controllate, la tropisetrona ha ridotto significativamente la frequenza dei CMMC sia nei topi di tipo selvatico che in quelli NL3R451C.

Inoltre, il tropisetron ha indotto un effetto maggiore sulla frequenza dei CMMC nei topi NL3R451C rispetto agli animali di tipo selvatico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa tecnica, assicurarsi che il bagno d'organo sia mantenuto a temperatura costante, che riceva un'apporto continuo di carbogeno e che l'eccesso di soluzione fisiologica sia prevenuto mediante un sistema a vuoto.

Seguendo questa procedura, altre tecniche come l'immunocitochimica possono essere eseguite per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se ci sono variazioni nelle proporzioni neuronali o nel numero di cellule nei topi che mostrano una motilità colica alterata. Da quando è stato sviluppato, questo metodo ha permesso una varietà di studi sulla motilità intestinale in specie come criceto, coniglio, ratto e altre, e in particolare, in questo caso, nel topo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come identificare i cambiamenti nella regolazione neuronale della motilità colica mediante imaging video.