Name: Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti In Vivo registrazioni intracellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Impara la registrazione intracellulare per determinare la sensibilità spettrale dei fotorecettori nell'occhio composto delle farfalle in vivo. Questo metodo elettrofisiologico permette di predire la gamma cromatica visibile dagli insetti.

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Ringraziamo il ritardo Rudy Limburgo per fabbricare le perimetro del braccio cardanici, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate per averci prestato attrezzature, e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, per incoraggiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship per KJM e Grant NSF IOS-1.257.627 a ADB

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

registrazione intracellulare può essere una tecnica difficile da padroneggiare a causa dei molti passaggi tecnici coinvolti. Per gli esperimenti di successo devono essere considerati diversi punti importanti. In primo luogo, è importante avere una tabella correttamente vibrazionalmente-isolato su cui viene eseguita l&#39;esperimento. Molti ricercatori utilizzano le tabelle d&#39;aria, che separano completamente il tavolo dalla base, dando isolamento dalle vibrazioni superiori. La nostra messa a punto prevede un tavolo d...

Le proprietà elettriche delle cellule come i neuroni si osservano misurando il flusso di ioni attraverso le membrane cellulari come un cambiamento di tensione o corrente. Una varietà di tecniche elettrofisiologiche sono state sviluppate per misurare eventi bioelettrici nelle cellule. I neuroni trovati nelle occhi degli animali sono accessibili e loro circuiti è spesso meno complesso nel cervello, rendendo queste cellule buoni candidati per lo studio elettrofisiologico. Le applicazioni più comuni di elettrofisiologia negli occhi includono elettroretinografia (ERG) 1,2 e microelettrodi registrazione intracellulare. ERG prevede il posizionamento di un elettrodo o sull&#39;occhio di un animale, applicando un stimolo luminoso, e misurando la variazione di tensione come somma delle risposte di tutte le celle vicine 3-6. Se uno è specificamente interessati a caratterizzare sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli, spesso contemporaneamente più tipi di cellule rispondono a diversi punti di forza per un dato stimolo; cosìpuò essere difficile determinare la sensibilità di specifici tipi cellulari a partire da dati ERG soprattutto se ci sono diversi tipi di fotorecettori spettralmente-simili negli occhi. Una possibile soluzione è quella di creare transgenici Drosophila con il fotorecettore (opsina) gene di interesse espressa nelle cellule di maggioranza R1-6 negli occhi e quindi eseguire ERGs 7. I potenziali svantaggi di questo metodo includono non a bassa espressione della proteina fotorecettore 8, e il periodo di tempo lungo per la generazione e lo screening di animali transgenici. Per gli occhi con un minor numero di tipi di fotorecettori spettralmente distinti, l&#39;adattamento dell&#39;occhio con filtri colorati può aiutare con la riduzione del contributo di alcuni tipi di cellule per l&#39;ERG, in tal modo consentendo la stima della sensibilità spettrale massimi 9. registrazione intracellulare è un&#39;altra tecnica nella quale un elettrodo multa infilza una cella e viene applicato uno stimolo. I record elettrodi solo indivLa risposta di cellule idual in modo che la registrazione e l&#39;analisi più celle individuali può produrre sensibilità specifiche delle fisiologicamente diversi tipi di cellule 10-14. Anche se il nostro protocollo si concentra sulla analisi della sensibilità spettrale, i principi fondamentali della intracellulare registrazione con elettrodi appuntiti sono modificabili per altre applicazioni. Usando una differente preparazione di un campione, per esempio, e utilizzando elettrodi quarzo taglienti, si può registrare dalla profonda nel lobo ottico o altre regioni del cervello, a seconda della domanda viene chiesto. Ad esempio, i tempi di risposta dei singoli fotorecettori 15, attività cellulare nell&#39;ottica lobi 16 (lamina midollare o lobula 17), cervello 18 o altri gangli 19 possono anche essere registrati con tecniche simili, o stimoli di colore potrebbe essere sostituito con polarizzazione 20 -22 o movimento sTIMOLI 23,24. Fototrasduzione, il processo attraverso il quale la lucel&#39;energia viene assorbita e convertita in un segnale elettrochimico, è un antico tratto comune a quasi tutti i presenti il giorno 25 phyla animali. Il pigmento visivo trovato nelle cellule fotorecettori e responsabile per l&#39;avvio fototrasduzione visivo è rodopsina. Rhodopsins in tutti gli animali sono costituiti da una proteina opsin, membro del 7 transmembrana G famiglia dei recettori accoppiati alle proteine, e un cromoforo associato che deriva dalla retina o una molecola simile 26,27. Opsina sequenza di aminoacidi e la struttura cromofori influenzare l&#39;assorbanza della rodopsina a diverse lunghezze d&#39;onda della luce. Quando un fotone viene assorbito dal cromoforo rodopsina viene attivato, avviando una cascata proteina G nella cella che conduce verso l&#39;apertura dei canali ionici di membrana 28. Diversamente dalla maggior parte dei neuroni, le cellule fotorecettori subiscono potenziali cambiamenti graduali che possono essere misurati come una variazione relativa di ampiezza risposta con il cambiamento stimolo luminoso. Tipicamente un determinatoTipo fotorecettore esprime un solo gene opsina (anche se esistono eccezioni 8,10,29-31). visione del colore sofisticata, del tipo presente in molti vertebrati e artropodi, si ottiene con un occhio complesso di centinaia o migliaia di cellule visive ogni esprimono uno o più tipi di tanto in tanto rodopsina. informazioni Visual viene catturato confrontando risposte oltre il mosaico fotorecettore tramite complesso segnalazione neurale valle nell&#39;occhio e nel cervello, provocando la percezione di un&#39;immagine completa di colori e movimento. Dopo aver misurato le risposte grezzi di una cellula fotorecettore a diverse lunghezze d&#39;onda della luce tramite registrazione intracellulare, è possibile calcolare la sua sensibilità spettrale. Questo calcolo è basato sul principio di Univariance, che afferma che la risposta di una cellula fotorecettore è dipendente dal numero di fotoni assorbe, ma non sulle particolari proprietà dei fotoni assorbe 32. Ogni fotone che è Absorbed da rodopsina indurrà lo stesso tipo di risposta. In pratica, ciò significa che l&#39;ampiezza risposta grezzo di una cella aumenterà dovuti a un aumento dell&#39;intensità della luce (più fotoni per assorbire), o ad un cambiamento nella lunghezza d&#39;onda verso la sua sensibilità di picco (maggiore probabilità di rodopsina assorbire quella lunghezza d&#39;onda). Noi facciamo uso di questo principio nel relativo risposte cellulari ad intensità nota e la stessa lunghezza d&#39;onda di risposte a diverse lunghezze d&#39;onda e la stessa intensità ma sconosciuto sensibilità relativa. Le cellule sono spesso identificati dalla lunghezza d&#39;onda alla quale loro picchi di sensibilità. Qui vi mostriamo un metodo per la registrazione e l&#39;analisi di sensibilità spettrale dei fotorecettori negli occhi di una farfalla intracellulare, con una particolare attenzione per rendere questo metodo più accessibile alla comunità di ricerca più ampia. Sebbene registrazione intracellulare tuttora comune in letteratura, in particolare relativamente alla visione dei colori in insetti, abbiamo trovato that descrizioni di materiali e metodi sono generalmente troppo breve per consentire una riproduzione della tecnica. Presentiamo questo metodo in formato video allo scopo di consentire la replicazione facile. Descriviamo anche la tecnica utilizzando attrezzature facilmente reperibili ea prezzi accessibili. Ci rivolgiamo avvertimenti comuni che spesso non sono segnalati, che rallentano la ricerca quando l&#39;ottimizzazione di una nuova e complessa tecnica.

<table><tbody><tr><td>Diverse</td><td></td><td></td><td>specie locali disponibili, necessitano di permessi USDA per la spedizione. Carolina Bio Supply ha diverse specie di insetti che possono essere ordinate negli Stati Uniti senza la necessità di ulteriori permessi Grande</td></tr><tr><td>cilindro</td><td></td><td></td> di plastica <td>Qualsiasi camera che rimane umidificata funzionerà</td></tr><tr><td>Perni per insetti, misura 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey Trader</td><td>Joe's</td><td></td><td>Qualsiasi soluzione di miele o saccarosio funzionerà</td></tr><tr><td>Xenon Arc</td><td>Lamp Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel fa ora parte di Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power</td><td>Supply Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel fa ora parte di Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel fa ora parte di Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel fa ora parte di Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, piccolo (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel fa ora parte di Newport Corporation</td></tr><tr><td>Adattatore filettato, da 8-32 maschio a 1/4-20 maschio, confezione da 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Perno di montaggio ottico, 1,0 pollici, 0,5 pollici Ø inossidabile, 8-32 e 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr> Supporto <tr><td>per perno ottico antiscivolo, 2 pollici, 0,5 pollici. Diametro perni, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Attacco obiettivo fisso, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Attacco obiettivo fisso, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Gruppo obiettivo condensatore</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Lente convessa in silice, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Ruota portafiltri a sei posizioni, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Mozzo per montaggio su ruota portafiltri</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Lente concava in silice, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Supporto collimatore</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Sonda a fascio di collimazione</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Convertitore a ghiera, terminazione SMA a ghiera standard da 11 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Questo adattatore consente alla fibra ottica di inserirsi nel supporto del collimatore&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu; m diametro cavo obtico in fibra UV-vis</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel è ora una parte di Newport Corporation</td></tr><tr><td>Otturatore con unità di azionamento</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metallico in silice fusa UV, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metallico in silice fusa UV, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metallico in silice fusa UV, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lampada</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 589 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 600 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 610 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 620 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 632 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 640 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 650 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 660 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 671 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 680 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 690 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda di interferenza, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr>Gabbia <td></td><td></td><td>di Faraday</td><td>Funzionerà qualsiasi struttura metallica che possa essere collegata a terra e che si adatti alla configurazione sperimentale.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio, ingrandimento 6X, 12X, 25X, 50X</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Qualsiasi stereomicroscopio andrà bene</td></tr><tr><td>Supporto per microscopio con braccio oscillante e base pesante</td><td>Strumenti</td><td></td> McBain <td>Qualsiasi base pesante con braccio farà</td></tr> il <tr><td>braccio</td><td></td><td></td> cardanico <td>Costruito su misura, Vedi Figura 4</td></tr><tr><td>Illuminatore ad alta intensità Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Per l'esempio di illuminazione</td></tr><tr><td>Guida luminosa a collo d'oca in fibra ottica</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Qualsiasi guida luminosa a collo d'oca andrà bene</td></tr><tr><td>Tavolo</td><td></td><td></td><td></td>in marmo</tr><tr><td>Tavolo</td><td></td><td></td> in legno rialzato <td>Il foro deve essere tagliato attraverso questo tavolo in modo che la sabbiera possa poggiare sul tavolo in marmo sottostante</td></tr><tr><td>Scatola di legno riempita di sabbia</td><td></td><td></td><td>costruita su misura, qualsiasi scatola con sabbia</td></tr><tr><td>Manipolatore</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaelettrodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stadio</td><td></td><td></td><td></td>per campioni</tr><tr><td>Fili a coccodrillo per la messa a</td><td></td><td></td><td></td>terra</tr><tr><td>Filo</td><td></td><td></td><td></td>di rame isolato</tr><tr><td>Filo d'argento, diametro 0,125 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>cavi</td> <td>BNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplificatore con headstage</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Riduttore di rumore Humbug</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopio, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, senza sonda</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Software Labchart</td><td>Strumenti ADI</td><td>Chart 5</td><td></td>Generatore</tr> di <tr><td>impulsi da 10 MHz</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette in vetro</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosillicato con filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td><td></td><td>di plastica scanalato</td></tr><tr><td>Cera</td><td></td><td></td><td></td>a bassa temperatura di fusione</tr><tr><td>Saldatore</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma con base magnetica a sfera e presa</td><td>Hama foto e video</td><td></td><td></td></tr> in <tr><td>acciaio al carbonio a doppio taglio, lama di rasoio fragile</td><td>Scienze al microscopio elettronico</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione del fotorecettore cellulare sensibilità spettrale in un modello da insetti<em&gt; in vivo</em&gt; registrazioni intracellulari

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

registrazione intracellulare è una tecnica potente usato per determinare come una singola cellula può rispondere ad un dato stimolo. Nella ricerca visione, la registrazione intracellulare è stata storicamente una tecnica comune usata per studiare la sensibilità di cellule visive individuali a diversi stimoli luminosi che è ancora in uso oggi. Tuttavia, rimane una carenza di metodologia dettagliata nella letteratura per i ricercatori che desiderano replicare gli esperimenti di registrazione intracellulare negli occhi. Qui vi presentiamo l&#39;insetto come modello per l&#39;esame fisiologia dell&#39;occhio, più in generale. fotorecettori insetti si trovano vicino alla superficie dell&#39;occhio e sono quindi facilmente raggiungibili, e molti dei meccanismi coinvolti nella visione si conservano tutta phyla animali. Descriviamo la procedura di base per la registrazione in vivo intracellulare di cellule visive negli occhi di una farfalla, con l&#39;obiettivo di rendere questa tecnica più accessibile ai ricercatori con poca esperienza precedente in electrophysiology. Introduciamo l&#39;attrezzatura di base, come preparare una farfalla reale per la registrazione, come inserire un microelettrodo di vetro in una singola cella, e infine la procedura di registrazione stessa. Spieghiamo anche l&#39;analisi di base dei dati di risposta prime per determinare la sensibilità spettrale di tipi di cellule individuali. Sebbene il protocollo concentra sulla determinazione sensibilità spettrale, altri stimoli (ad esempio, la luce polarizzata) e variazioni del metodo sono applicabili a questa configurazione.

Per molti elementi della configurazione di registrazione, una descrizione scritta non fornisce dettagli sufficienti. Figura 1 è una schematica dei componenti coinvolti nella configurazione registrazione completa. In figura 2, spettri sono tracciate per luce bianca e ciascun filtro di interferenza a dare un senso del perché è necessario un fattore di correzione e ciò che è necessario per calcolare la correzione. La Figura 3 mostra foto e un diagramma del braccio...

La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell&#39;occhio composto di una farfalla.

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti<em&gt; In Vivo</em&gt; registrazioni intracellulari

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

L'obiettivo generale di questo metodo di registrazione intracellulare è determinare la sensibilità spettrale di singole cellule fotoricettori nell'occhio composto di un insetto in vivo. Questo metodo può indicarci se le lunghezze d'onda della luce alle quali una cellula è sensibile sono influenzate da pigmenti filtranti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, conoscendo le sensibilità spettrali dei singoli fotoricettori, possiamo prevedere quale gamma di colori un animale è in grado di vedere.Per prepararsi alla registrazione, accendere la lampada allo xenon almeno 45 minuti prima dell'esperimento e accendere il tiratore di microelettrodi almeno 30 minuti prima di tirare gli elettrodi di vetro. Successivamente, accendere tutte le apparecchiature di registrazione. Assicurarsi che lo scatto sia chiuso per impostazione predefinita, in modo che nessuna luce passi attraverso il cavo in fibra ottica.Quindi, utilizzare il tiratore di microelettrodi per ottenere fini microelettrodi in vetro borosilicato. Riempire posteriormente gli elettrodi con cloruro di potassio 3 M. Per preparare il campione, sotto il microscopio, fissare un singolo esemplare di farfalla all'interno di un piccolo tubo di plastica mediante cera calda, in modo che la testa risulti immobile e sporga da un'estremità del tubo.Quindi, fissare il proboiscide, le antenne e le ali con della cera. Successivamente, tenere premuto l'addome con un pezzo di cera asciutta. Mantenere il tubo umidificato inserendo al suo interno un fazzoletto umido, dietro l'addome del campione.Assicurarsi che il campione sia completamente immobile. Successivamente, fissare il tubo utilizzando un piccolo pezzo di cera su una piattaforma dotata di un giunto a sfera e cavità, collegata a una base magnetica. Sotto un microscopio stereoscopico, inserire un filo di argento nella testa attraverso la parte della bocca, come elettrodo di riferimento.Prima dell'esperimento, fissare in modo permanente il filo alla piattaforma. Successivamente, praticare un piccolo foro nella cornea sinistra utilizzando una lametta e sigillare il foro con vaselina per prevenire la disidratazione. Una volta effettuato il taglio sulla cornea, inserire l'elettrodo di registrazione nell'occhio il più rapidamente possibile, poiché l'emolinfa all'interno dell'occhio si indurirà rapidamente rendendo impossibile l'inserimento di un elettrodo.Se possibile, eseguire la dissezione nel sistema in cui avverrà la registrazione. Quindi, collegare il cavo di massa della testa amplificatrice all'elettrodo di riferimento sulla piattaforma del campione, utilizzando le clip a coccodrillo. Montare l'elettrodo sul supporto per elettrodi.Successivamente, inserire il filo d'argento nella soluzione di cloruro di potassio all'interno del microelettrodo. Utilizzare una sorgente luminosa dotata di braccio flessibile per illuminare il campione al microscopio stereoscopico mentre si abbassa l'elettrodo nell'occhio. Regolare il porta-elettrodo in modo che il microelettrodo si trovi esattamente sopra il foro precedentemente praticato nella cornea.Quindi, abbassare l'elettrodo microscopico nell'occhio utilizzando il micromanipolatore, fino al completamento del circuito. Una volta inserito nell'occhio, spostare lo stereomicroscopio all'esterno della gabbia di Faraday. Spegnere la sorgente luminosa che illumina il campione e lasciare l'insetto al buio per 10-20 minuti per l'adattamento al buio.Verificare la resistenza dell'elettrodo applicando una corrente di un nanoampere e osservando la variazione di tensione. La resistenza dovrebbe tipicamente trovarsi nell'intervallo compreso tra 100 e 250 megaohm. Successivamente, attivare il generatore di impulsi per erogare un lampo di luce per tutta la durata dell'esperimento e dirigere il cavo in fibra ottica verso l'occhio.Verificare sull'oscilloscopio la variazione di tensione ad ogni lampo di luce. Una variazione negativa della tensione indica che l'elettrodo non è ancora entrato nella cellula. Spostare il cavo in fibra ottica attorno al campione finché non si osserva una risposta massima di tensione.Per generare una risposta alla luce di depolarizzazione, ruotare avanti e indietro il micromanipolatore, determinando piccoli movimenti verticali dell'elettrodo, mentre si batte leggermente sulla base del supporto dell'elettrodo o si utilizza la funzione di vibrazione sul preamplificatore. Continuare ad apportare piccole regolazioni fino a quando una risposta alla luce di depolarizzazione appare sull'oscilloscopio. Successivamente, regolare il cavo in fibra ottica per individuare il segnale di depolarizzazione massimo.Eseguire piccole regolazioni con un micromanipolatore e utilizzare la funzione di vibrazione sull'amplificatore secondo necessità, per assicurarsi che l'elettrodo stia registrando in modo stabile la cellula. Una registrazione stabile dovrebbe presentare pochissime o nessuna variazione nel potenziale di riposo, un rumore di fondo basso e una risposta depolarizzante costantemente ampia. È essenziale ottenere una registrazione stabile in cui il potenziale di membrana a riposo non sia rumoroso e non cambi nel tempo.Le risposte devono essere ampie e positive, senza alcuna iperpolarizzazione. Una volta che il sistema è stabile, aprire il software e chiudere la finestra di dialogo chiamata Galleria degli esperimenti" per aprire una finestra popup con quattro canali. Regolare la scala di tensione nell'angolo in alto a destra della finestra del software a 500 millivolt.Quindi, fare clic su "Avvia" nell'angolo in basso a destra per iniziare la registrazione. Ridurre al minimo i canali tre e quattro e regolare le scale X e Y. Successivamente, lasciare che il software si esegua per tutta la durata dell'esperimento.Per la stimolazione con luce bianca, registrare fino a 10 risposte individuali, impostando la ruota del filtro ND sul valore di densità ottica (OD) più alto che produca ancora una risposta. Qui, la variazione della risposta è mostrata a 3,0 OD e 2,0 OD. Successivamente, registrare lo stesso numero di risposte da 3,5 a 0,0 OD, in ogni combinazione, al fine di ottenere una curva logaritmica dell'intensità della risposta. Prima di registrare la risposta della cellula a tutte le lunghezze d'onda utilizzando i filtri interferenziali, individuare rapidamente la lunghezza d'onda di picco.Senza alcun filtro ND nel percorso della luce, posizionare un filtro trasmettente UV e osservare brevemente l'ampiezza della risposta. Ripetere la procedura con un filtro trasmettente blu, un filtro trasmettente verde e un filtro trasmettente rosso, il che dovrebbe dare un'indicazione approssimativa della posizione della risposta massima. Registrare alla lunghezza d'onda del filtro che fornisce la risposta massima prima di passare a un altro filtro interferenziale.Dopo la registrazione con filtri successivi, consentire alla cellula di rispondere a uno o due lampi di luce bianca senza alcun filtro nel percorso della luce, al fine di monitorare se la risposta di picco si degrada nel tempo. Quindi, registrare con altri filtri a interferenza, consentendo fino a 10 risposte per ogni filtro. Questo è un esempio di un grande cambiamento di voltaggio negativo osservato poco prima di entrare nella cellula.Qui è mostrata una registrazione pulita, con poco rumore di fondo e una risposta depolarizzante ampia, tipicamente di almeno 40 millivolt. Ecco un esempio di registrazione scadente, dovuta al cambiamento di potenziale negativo dopo il picco principale. Questo è un altro esempio di registrazione non valida.Il potenziale di riposo sta subendo forti fluttuazioni, e la notevole quantità di rumore di fondo può oscurare l'ampiezza della risposta. Questo è un esempio rappresentativo della sensibilità spettrale derivata da una singola registrazione. I tipi cellulari vengono classificati in base alla sensibilità massima a una lunghezza d'onda simile e alla forma complessiva dello spettro di sensibilità.I tipi cellulari identici vengono quindi mediati, e la sensibilità media viene rappresentata con barre di errore standard per ogni lunghezza d'onda. Questo grafico mostra le sensibilità spettrali di tre tipici tipi cellulari presenti in un insetto. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire esperimenti comportamentali per determinare se tutti i tipi di cellule fotoricettori contribuiscono alla discriminazione del colore.

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Neuroscienze

Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Il video dimostra la registrazione dell'attività elettrica nei neuroni fotorecettori dell'ommatidio di Drosophila stabilendo una configurazione dell'intera cellula. Evidenzia l'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio da parte di impulsi luminosi, con conseguenti urti quantici misurabili.

Registrazioni con morsetto di tensione a cellula intera dai fotorecettori di Drosophila

Questo video dimostra la procedura per la registrazione intracellulare in vivo delle cellule fotorecettrici nell'occhio di una farfalla e la determinazione della sensibilità spettrale dei singoli tipi di cellule. Questa tecnica consente lo studio della sensibilità delle singole cellule fotorecettrici a diversi stimoli luminosi.

Registrazione intracellulare in vivo della sensibilità spettrale delle cellule fotorecettrici in una farfalla

Fonte: Wagner, K. et al., Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine marcate con eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Questo video mostra la visualizzazione del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine TRPL marcate con eGFP. Descrive in dettaglio la preparazione di mosche transgeniche per l'imaging, l'acquisizione di immagini a fluorescenza di cellule fotorecettrici e la quantificazione del...

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila

I microelettrodi affilati consentono un'accurata caratterizzazione elettrofisiologica dell'output dei fotorecettori e degli interneuroni visivi in Drosophila vivente. Qui mostriamo come utilizzare questo metodo per registrare risposte di tensione di alta qualità delle singole cellule alla stimolazione luminosa controllata. Questo metodo è ideale per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali negli occhi composti da insetti.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Viene presentato un protocollo per lo studio della desensibilizzazione e del recupero di sensibilità dei fotorecettori dei gamberi in funzione del tempo circadiano.

Desensibilizzazione e recupero dei fotorecettori dei gamberi al momento della consegna di uno stimolo leggero

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Questo video illustra un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. Dissociato neuroni commissurali sono utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e di orientamento.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Impara la registrazione intracellulare per determinare la sensibilità spettrale dei fotorecettori nell'occhio composto delle farfalle in vivo. Questo metodo elettrofisiologico permette di predire la gamma cromatica visibile dagli insetti.

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti

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