Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti In Vivo registrazioni intracellulari

L'obiettivo generale di questo metodo di registrazione intracellulare è determinare la sensibilità spettrale delle singole cellule fotorecettrici in un occhio composto da insetti in vivo. Questo metodo può dirci se le lunghezze d'onda della luce a cui una cellula è sensibile sono influenzate dai pigmenti filtranti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che conoscendo le sensibilità spettrali dei singoli fotorecettori, possiamo prevedere quale gamma di colori un animale può vedere.

Per prepararsi alla registrazione, accendere la lampada allo xeno almeno 45 minuti prima dell'esperimento e accendere l'estrattore di microelettrodi almeno 30 minuti prima di estrarre gli elettrodi di vetro. Quindi, accendi tutte le apparecchiature di registrazione. Assicurati che l'otturatore sia chiuso per impostazione predefinita, in modo che la luce non passi attraverso il cavo in fibra ottica.

Quindi, estrarre i microelettrodi in vetro borosilicato fine utilizzando l'estrattore per microelettrodi. Riempire gli elettrodi con cloruro di potassio a tre molari. Per preparare il campione, al microscopio, fissare una singola farfalla all'interno di un piccolo tubo di plastica con cera calda, in modo che la testa sia immobile e sporgente da un'estremità del tubo.

Quindi, fissare la proboscide, le antenne e le ali con la cera. Dopodiché, tieni premuto l'addome con un pezzo di cera asciutto. Mantenere la provetta umidificata posizionando un fazzoletto umido al suo interno, dietro l'addome del campione.

Assicurarsi che il campione sia completamente immobile. Quindi, monta il tubo utilizzando un piccolo pezzo di cera su una piccola piattaforma con un giunto sferico fissato a una base magnetica. Sotto un microscopio da dissezione, inserire un filo d'argento nella testa attraverso la parte della bocca, come elettrodo di riferimento.

Prima dell'esperimento, fissare in modo permanente il filo alla piattaforma. Quindi, taglia un piccolo foro nella cornea sinistra usando una lama di rasoio e sigilla il foro con vaselina per evitare l'essiccazione. Una volta tagliata la cornea, inserire l'elettrodo di registrazione nell'occhio il più rapidamente possibile, perché l'emolinfa nell'occhio si indurirà rapidamente e renderà impossibile l'inserimento di un elettrodo.

Se possibile, eseguire la dissezione nel rig dove avverrà la registrazione. Quindi, collegare il filo di terra dello stadio della testa all'elettrodo di riferimento sulla piattaforma del campione, utilizzando le clip a coccodrillo. Montare l'elettrodo sul portaelettrodo.

Successivamente, inserire il filo d'argento nella soluzione di cloruro di potassio nel microelettrodo. Utilizzare una fonte di luce con attacchi a collo d'oca per illuminare il campione sotto uno stereoscopio mentre si abbassa l'elettrodo nell'occhio. Regolare il portaelettrodo in modo che il microelettrodo si trovi direttamente sopra il foro precedentemente praticato nella cornea.

Quindi, abbassare il microelettrodo nell'occhio utilizzando il micromanipolatore, fino al completamento di un circuito. Una volta nell'occhio, fai oscillare lo stereoscopio fuori dalla gabbia di Faraday. Spegni la fonte di luce che illumina l'esemplare e lascia l'insetto al buio per 10-20 minuti per l'adattamento al buio.

Controllare la resistenza dell'elettrodo applicando una corrente di un nanoampere e annotando la variazione di tensione. La resistenza dovrebbe essere in genere compresa tra 100 e 250 megaohm. Quindi, attiva il generatore di impulsi per fornire un lampo di luce per tutta la durata dell'esperimento e dirigi il cavo in fibra ottica verso l'occhio.

Controllare l'oscilloscopio per voltage variazione ad ogni lampeggio della luce. Una variazione negativa della tensione significa che l'elettrodo non è ancora entrato nella cella. Spostare il cavo in fibra ottica attorno al campione fino a quando non si osserva una risposta di tensione massima.

Per generare una risposta alla luce depolarizzante, ruotare il micromanipolatore avanti e indietro, in modo da ottenere piccoli movimenti verticali dell'elettrodo, mentre si picchietta leggermente la base del portaelettrodo o si utilizza la funzione buzz sul preamplificatore. Continuare ad effettuare piccole regolazioni fino a quando sull'oscilloscopio non appare una risposta alla luce depolarizzante. Quindi, regolare il cavo in fibra ottica per trovare il segnale depolarizzante più grande.

Effettuare piccole regolazioni con un micromanipolatore e utilizzare la funzione buzz sull'amplificatore secondo necessità, per assicurarsi che l'elettrodo registri stabilmente la cella. Una registrazione stabile dovrebbe avere un cambiamento minimo o nullo nel potenziale di riposo, un basso rumore di fondo e una risposta depolarizzante costantemente ampia. È essenziale avere una registrazione stabile in cui il potenziale di membrana a riposo non sia rumoroso e non cambi nel tempo.

Le risposte dovrebbero essere ampie e positive senza iperpolarizzazione. Una volta che la configurazione è stabile, apri il software e chiudi la finestra di dialogo chiamata Galleria esperimenti"per aprire una finestra popup con quattro canali. Regolare la scala di tensione nell'angolo in alto a destra della finestra del software a 500 millivolt.

Quindi, fai clic su Avvia nell'angolo in basso a destra per iniziare la registrazione. Ridurre a icona i canali tre e quattro e regolare la scala X e Y. Quindi lasciare che il software venga eseguito per tutta la durata dell'esperimento.

Per la stimolazione con luce bianca, registrare fino a 10 risposte individuali, con la rotella del filtro ND impostata sul diametro esterno più alto che suscita comunque una risposta. In questo caso, la variazione della risposta viene mostrata a 3,0 OD e 2,0 OD. Successivamente, registrare lo stesso numero di risposte da 3,5 a 0,0 OD, in ogni combinazione, al fine di fornire una curva di intensità del log delle risposte. Prima di registrare la risposta della cella a tutte le lunghezze d'onda utilizzando i filtri di interferenza, trovare rapidamente la lunghezza d'onda di picco.

Senza alcun filtro ND nel percorso della luce, posizionare un filtro di trasmissione UV e osservare brevemente l'ampiezza della risposta. Ripetere la procedura con un filtro di trasmissione blu, un filtro di trasmissione verde e un filtro di trasmissione rosso, che dovrebbero dare un'idea di dove sarà la risposta di picco. Registrare sotto la lunghezza d'onda del filtro che fornisce la risposta massima prima di passare a un altro filtro di interferenza.

Tra una registrazione e l'altra con i filtri successivi, consentire alla cella di rispondere a uno o due lampi di luce bianca senza alcun filtro nel percorso della luce, al fine di monitorare se la risposta di picco si sta degradando nel tempo. Quindi, registra con altri filtri di interferenza e consenti fino a 10 risposte per filtro. Questo è un esempio di una grande variazione di tensione negativa che si osserva appena prima di entrare in una cella.

Qui viene mostrata una registrazione pulita, che ha poco rumore di fondo e una grande risposta depolarizzante, in genere di almeno 40 millivolt. Ed ecco un esempio di registrazione scadente, a causa della variazione di potenziale negativa dopo il picco principale. Questo è un altro esempio di cattiva registrazione.

Il potenziale di riposo sta subendo grandi fluttuazioni e la grande quantità di rumore di fondo può oscurare l'ampiezza della risposta. Questo è un esempio rappresentativo di sensibilità spettrale derivata da una singola registrazione. I tipi di cellule sono classificati in base alla sensibilità di picco a una lunghezza d'onda simile e alla forma complessiva dello spettro di sensibilità.

Gli stessi tipi di celle vengono quindi mediati e la sensibilità media viene tracciata con barre di errore standard a ciascuna lunghezza d'onda. Questo grafico mostra la sensibilità spettrale di tre tipi di cellule tipici presenti in un insetto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire esperimenti comportamentali per determinare se tutti i tipi di cellule fotorecettrici contribuiscono o meno alla discriminazione del colore.