Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount In Situ Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in Drosophila Embrioni
31 gennaio 2016
Descriviamo una procedura multi-target cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) in embrioni di Drosophila intatte che permettono il rilevamento simultaneo e specifico di tre diversi modelli di distribuzione mRNA da contrastanti precipitati di colore.
L'obiettivo generale di Chromogenic Multi-target WISH è quello di facilitare la mappatura dei modelli di distribuzione dell'mRNA all'interno di embrioni di Drosophila intatti. Con questo metodo, le localizzazioni dell'mRNA di tre diversi geni possono essere confrontate direttamente all'interno dello stesso embrione. Multi-color WISH può essere utilizzato per generare mappe di espressione genica negli organismi in via di sviluppo in modo rapido e affidabile. Questo può fornire importanti indizi sulle interazioni regolatorie geniche, sullo sviluppo attivo ed embrionale o sull'organogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i modelli di espressione dell'mRNA di diversi geni sono visualizzati in colori distintivi e contrastanti. In questo modo, i siti di espressione unici e sovrapposti possono essere evidenziati con elevata precisione. Utilizzando le procedure standard, raccogliere, dechorionare, fissare e devitellinizzare gli embrioni richiesti. Conservali nel metanolo nel congelatore fino al momento del bisogno. Ora, inizia con gli embrioni a temperatura ambiente. Inserire un inserto nel primo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e aggiungere due millilitri di metanolo. Trasferisci la quantità desiderata di embrioni nell'inserto che viene utilizzato per trasportare gli embrioni durante la procedura. Ora, reidrata gli embrioni usando incubazioni di tre minuti in una serie decrescente di metanolo. Inizia con il 75% di metanolo in PBS. Seguire con il 50% di metanolo in PBS-T. Quindi, utilizzare il 25% di metanolo in PBS-T e terminare con due incubazioni in PBS-T puro. Successivamente, anteporre gli embrioni in paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il fissativo utilizzando quattro lavaggi in PBS-T. Durante le fasi di lavaggio, scongelare e preparare le soluzioni di lavoro per la proteinasi K e la glicina. Dopo i lavaggi, permeabilizzare gli embrioni nella proteinasi K appena preparata per tre minuti a temperatura ambiente. Arrestare la reazione con due lavaggi di un minuto nella glicina appena preparata. Quindi, postfissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% prodotta in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare via la paraformaldeide con quattro lavaggi in PBS-T tre minuti al pezzo. Quindi, trasferire gli embrioni nel tampone di preibridazione. Possono essere conservati nel congelatore fino al momento del bisogno. Iniziare con la distribuzione degli embrioni in tampone prehy in provette da due millilitri. Aliquotare circa 15 microlitri di embrioni depositati in ogni provetta. Ora, incubare gli embrioni in un 65
Panoramica
Questo articolo presenta una procedura di ibridazione in situ su preparato intero cromogenica multietichetta (MC-WISH) per embrioni di Drosophila. Il metodo consente la rilevazione simultanea di tre diversi pattern di distribuzione di mRNA mediante precipitati colorati contrastanti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Analisi dell'espressione genica
Sfondo
- La mappatura dei modelli di distribuzione dell'mRNA è fondamentale per comprendere le interazioni regolatorie dei geni.
- MC-WISH consente il confronto dell'espressione genica all'interno dello stesso embrione.
- Questa tecnica evidenzia siti di espressione unici e sovrapposti con elevata accuratezza.
- È applicabile nello studio dello sviluppo embrionale e dell'organogenesi.
Scopo dello studio
- Per facilitare la mappatura dei modelli di distribuzione dell'mRNA in embrioni di Drosophila integri.
- Per fornire un metodo rapido e affidabile per generare mappe di espressione genica.
- Per migliorare la comprensione delle interazioni geniche durante lo sviluppo.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento e fissazione di embrioni di Drosophila.
- Reidratazione mediante una serie decrescente di metanolo.
- Permeabilizzazione con Proteinasi K.
- Postfissazione e ibridazione nel buffer di preibridazione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei modelli di espressione dell'mRNA in colori distinti.
- Capacità di confrontare simultaneamente l'espressione di tre geni diversi.
- Elevata accuratezza nell'identificare siti di espressione sovrapposti.
- Applicazioni potenziali nello studio dei meccanismi regolatori genici.
Conclusioni
- MC-WISH è un metodo efficace per analizzare la distribuzione dell'mRNA negli embrioni.
- La tecnica fornisce informazioni sulla dinamica dell'espressione genica durante lo sviluppo.
- Può rappresentare uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'ibridazione in situ su preparato intero cromogenica multiplo (MC-WISH) consente il confronto spaziale diretto di più pattern di espressione genica all'interno di embrioni integri, facilitando la riduzione dei rischi meccanicistici nella validazione degli obiettivi chiarificando le relazioni di co-espressione e regolatorie. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale di scoperta, fornendo letture ad alta risoluzione e riproducibili dell'attività trascrizionale in sistemi di sviluppo rilevanti per le malattie. L'applicabilità del metodo a embrioni di Drosophila e di zebrafish ne fa uno strumento scalabile per l'analisi dei percorsi molecolari e lo screening fenotipico in sistemi modello preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando le relazioni spaziali tra domini di espressione genica per chiarire le interazioni tra percorsi molecolari.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target attraverso la visualizzazione diretta di siti unici e sovrapposti di mRNA con elevata accuratezza.
- Valore predittivo: Migliora la selezione dei progetti riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle reti di regolazione genica durante lo sviluppo embrionale e l'organogenesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi generando mappe affidabili di espressione genica multiplex.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso la rilevazione simultanea di tre specie di mRNA in colori contrastanti.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma e la valutazione affidabile di composti fornendo letture quantitative spaziali in campioni integri.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica mantenendo il contesto spaziale dell'espressione genica attraverso le diverse fasi di sviluppo.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione definendo siti precisi di espressione che guidano l'allineamento dei biomarcatori e la rilevanza per la malattia.
- Riduzione del Rischio Meccanicistica: Si concentra sul valore predittivo consentendo il confronto diretto della dinamica trascrizionale in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
MC-WISH si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo dati trascrizionali con risoluzione spaziale che contribuiscono a una comprensione meccanicistica precoce e alla preparazione dei saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo il confronto diretto dei modelli di distribuzione dell'mRNA in embrioni integri.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso output colorimetrici riproducibili e multiplex che permettono il confronto affiancato dell'espressione genica.
- Analisi: Genera misurazioni spaziali quantitative mediante precipitazione cromogenica, facilitando il confronto tra condizioni e l'analisi di co-espressione.
- Ricerca traslazionale: Mantiene il contesto dello sviluppo dalle fasi di scoperta fino a quelle precliniche, supportando l'allineamento dei biomarcatori nei modelli di organogenesi.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile in diversi progetti grazie alla sua applicabilità a diversi sistemi modello (Drosophila, pesce zebra) e alla sua adattabilità a vari pannelli genici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'incertezza nelle interazioni di co-espressione genica e regolatorie.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e scalabilità grazie a rilevamenti cromogenici standardizzati e flussi di lavoro con embrioni conservabili in congelatore.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi sugli obiettivi mediante mappatura spaziale ad alta accuratezza.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione corretta per il rischio fornendo dati visivi chiari sul sovraimpegno e l'unicità dell'espressione per decisioni di prosecuzione o interruzione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in embriologia, ibridazione degli acidi nucleici e tecniche di rilevamento cromogenico.
- È dipendente da strumentazione colorimetrica basata sulla fosfatasi alcalina e da infrastrutture standard di biologia molecolare.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la progettazione delle sonde, la marcatura con apteni e i protocolli di sviluppo del colore.
- Richiede considerazioni adattative nel passaggio da embrioni di Drosophila a quelli di pesce zebra, a causa delle differenze di permeabilità e fissazione.
- I limiti pratici includono la profondità di penetrazione delle sonde negli embrioni in stadi avanzati e la multiplexazione del segnale limitata dalle tonalità cromogeniche disponibili.
