Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount In Situ Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in Drosophila Embrioni

L'obiettivo generale di Chromogenic Multi-target WISH è quello di facilitare la mappatura dei modelli di distribuzione dell'mRNA all'interno di embrioni di Drosophila intatti. Con questo metodo, le localizzazioni dell'mRNA di tre diversi geni possono essere confrontate direttamente all'interno dello stesso embrione. Multi-color WISH può essere utilizzato per generare mappe di espressione genica negli organismi in via di sviluppo in modo rapido e affidabile. Questo può fornire importanti indizi sulle interazioni regolatorie geniche, sullo sviluppo attivo ed embrionale o sull'organogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i modelli di espressione dell'mRNA di diversi geni sono visualizzati in colori distintivi e contrastanti. In questo modo, i siti di espressione unici e sovrapposti possono essere evidenziati con elevata precisione. Utilizzando le procedure standard, raccogliere, dechorionare, fissare e devitellinizzare gli embrioni richiesti. Conservali nel metanolo nel congelatore fino al momento del bisogno. Ora, inizia con gli embrioni a temperatura ambiente. Inserire un inserto nel primo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e aggiungere due millilitri di metanolo. Trasferisci la quantità desiderata di embrioni nell'inserto che viene utilizzato per trasportare gli embrioni durante la procedura. Ora, reidrata gli embrioni usando incubazioni di tre minuti in una serie decrescente di metanolo. Inizia con il 75% di metanolo in PBS. Seguire con il 50% di metanolo in PBS-T. Quindi, utilizzare il 25% di metanolo in PBS-T e terminare con due incubazioni in PBS-T puro. Successivamente, anteporre gli embrioni in paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il fissativo utilizzando quattro lavaggi in PBS-T. Durante le fasi di lavaggio, scongelare e preparare le soluzioni di lavoro per la proteinasi K e la glicina. Dopo i lavaggi, permeabilizzare gli embrioni nella proteinasi K appena preparata per tre minuti a temperatura ambiente. Arrestare la reazione con due lavaggi di un minuto nella glicina appena preparata. Quindi, postfissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% prodotta in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare via la paraformaldeide con quattro lavaggi in PBS-T tre minuti al pezzo. Quindi, trasferire gli embrioni nel tampone di preibridazione. Possono essere conservati nel congelatore fino al momento del bisogno. Iniziare con la distribuzione degli embrioni in tampone prehy in provette da due millilitri. Aliquotare circa 15 microlitri di embrioni depositati in ogni provetta. Ora, incubare gli embrioni in un 65