Name: Glaucoma inducono Procedura in un In Vivo Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara a indurre glaucoma nel ratto mediante iniezione ipertonica nella vena episclerale per studiare la perdita di cellule gangliari retiniche. Questa tecnica consente analisi di neuroprotezione in 30 minuti.

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Tutte le procedure che utilizzano soggetti animali sono stati in conformità con gli standard dell&#39;Istituto di cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) alla Western Michigan University. 1. Gli animali <ol><li> Utilizzare i ratti maschi e femmine 3 mesi di età in questo studio. </li><li> Mantenere gli animali in un ciclo di 12 ore luce / buio con libero accesso a cibo e acqua. </li></ol> 2. Preparazione di KAX Cocktail per anestesia degli animali <ol><li> Sciogliere 50 mg di xilazina (20 mg / ml) in 5 ml di ketamina (100 mg / ml) con 1 ml acepromazine (10 mg / ml) e 3 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente. </li><li> Sterilizzazione con un filtro a siringa e conservare questa soluzione in un flacone di siero 10 ml. </li></ol> 3. KAX Iniezione <ol><li> Pesare animale (g) e ritornare alla gabbia fino pronta per l&#39;iniezione. </li><li> Iniettare 0,1 ml KAX / 100 g di peso corporeo degli animali per via intraperitoneale, utilizzando una siringa da insulina da 1 ml con un ago 28 G. </li><li> consentireper animali a perdere conoscenza. Controllare riflessi pizzicare i piedi e la coda. </li><li> Mantenere tutti gli animali in modo sicuro in laboratorio per la durata dell&#39;intervento. </li><li> Post-operatorio, sostituire gli animali nelle loro gabbie e mantenere confortevole a RT finché non viene ripreso conoscenza. Solo tornare animali per l&#39;impianto degli animali quando gli animali si svegliano e riprendere un comportamento normale. </li></ol> 4. preparazione per la chirurgia e montaggio Microneedle <ol><li> Fare uno sterile 2 soluzione M NaCl. </li><li> Utilizzare un estrattore microelettrodo (Figura 1C) per tirare uno 0,86 millimetri di diametro interno pesante standard di lucido e tubo borosilicato a parete sottile in due microaghi di vetro finemente conici (Figura 1D, 1E Figura). </li><li> Backfill un microago dal passaggio precedente con 2 M soluzione salina con un ago riempimento siringa e una siringa da 1 ml (Figura 1B). Toccare le bolle d&#39;aria dalla punta dell&#39;elettrodo. </li><li> Riempire una seconda siringa da 1 ml con 2 MNaCl. Collegare un ago G 18 e quindi collegare una lunghezza (circa 10 pollici) di tubo in polietilene (Figura 1A). Utilizzare lo stantuffo della siringa per riempire il tubo di polietilene con soluzione fisiologica attraverso l&#39;ago. </li><li> Quando sia il microago e tubetti sono riempite con soluzione salina, collegare accuratamente i due. Eliminare eventuale aria nella connessione tra loro (figura 2). </li><li> Finemente smussare la punta del microago raschiandola molto leggermente contro il grano di un tovagliolo di carta corso. </li><li> Controllare la resistenza del microago spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando un bel flusso di liquido può essere visto sul tovagliolo di carta. Il flusso di liquido deve essere più largo 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparazione di Animal <ol><li> Applicare 1 - 2 gocce di anestetico topico per cornea (proparacaina cloridrato soluzione oftalmica, USP, 0,5%). Attendere fino a quando non si verifica alcun riflesso oculare. </li><li> Trim baffi con le forbici. </li><li> Saturate un cotton-fioc con la soluzione betadine e zona tampone intorno all&#39;occhio sperimentale. </li><li> Utilizzando un microscopio, allegare un emostatico per bloccare la palpebra inferiore a gonfiarsi l&#39;occhio, esporre la vena episclerale e limitare il movimento degli occhi. (Figura 3, punta di freccia) </li></ol> 6. Saline iniezione glaucoma che inducono <ol><li> Quando l&#39;assemblea microneedle e l&#39;animale sono preparati, iniziare le iniezioni. </li><li> Quando l&#39;animale si conferma essere insensibile a piedi / coda pizzico, perforare con attenzione la vena episclerale con il microago, venendo ad un angolo basso tra i 10 ei 20 gradi alla vena (Figura 3, freccia bianca). Una puntura successo nella vena è evidente quando il sangue entra nella punta del microago (Figura 3, freccia nera). </li><li> Lentamente e manualmente iniettare circa 50 microlitri di soluzione salina nella vena. Questo dovrebbe prendere circa 10 sec. Le vene saranno sbollentare bianca come il sale circola through del sistema vascolare (figura 4, punta di freccia). Alcune regioni possono mantenere un aspetto rosso sangue (figura 4, freccia). <ol><li> Eseguire una seconda iniezione nella vena, opposto al sito del primo, per garantire completa danno retinico allo strato completo di cellule gangliari retiniche. Nota: In pochi minuti, si dovrebbe vedere un aspetto torbido distinta attraverso l&#39;iride dell&#39;occhio come sali circola attraverso il sistema vascolare. </li></ol></li><li> Lasciare l&#39;occhio opposto greggia per uso come controllo interno. </li></ol> 7. il recupero degli animali <ol><li> Rimuovere la pinza emostatica. </li><li> Utilizzare un applicatore di cotone per applicare tripla pomata antibiotica (Bacitracin di zinco, solfato di neomicina, polymysin B solfato) al sito bloccato dalla pinza emostatica e ai siti di iniezione. Il danno tissutale intorno all&#39;occhio non si verifica utilizzando la pinza emostatica. </li><li> &gt; Luogo anestetizzato animali nelle loro gabbie su un circolante coperta di acqua calda per previpotermia ent. Mantenere gli animali sotto osservazione fino a quando la coscienza e il comportamento normale sono riacquistato. Trasportare animali svegli di nuovo alla colonia degli animali. Animali rimangono nella colonia fino al momento del sacrificio. </li></ol> 8. sacrificio animale e rimozione Retina <ol><li> Un mese dopo la procedura per indurre il glaucoma, gli animali sono eutanasia da CO 2 asfissia e la puntura toracica secondaria. <ol><li> Posto l&#39;animale nella camera e mettere il coperchio saldamente. </li><li> Aprire le valvole di CO 2 e regolatore del gas per permettere al 20% del volume / min CO 2 spostamento ossigeno nella camera. </li><li> Lasciare quattro a 5 minuti per l&#39;animale a scadenza. </li><li> Spegnere entrambe le valvole. </li><li> Rimuovere animale dalla camera ed eseguire una puntura toracico secondario con un bisturi sterile. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;eutanasia, usare un bisturi per tagliare il tessuto connettivo nella cavità orbitale che circonda l&#39;occhio, being attenzione a non tagliare nel bulbo oculare stesso. </li><li> usare cautela forbici bordo curvo per tagliare il nervo ottico e qualsiasi tessuto rimanente per estrarre il bulbo oculare intatta. Mettere bulbo oculare estratto in una sterile 60 millimetri x 15 mm piastra di Petri monouso contenente PBS fresco. </li><li> Fare un oculare dal bulbo oculare. Per fare questo, fare una piccola incisione con il bisturi appena posteriore al confine tra l&#39;iride e la sclera. Seguire questa incisione intorno alla circonferenza dell&#39;occhio con piccole forbici a molla per rimuovere dell&#39;emisfero corneale dal bulbo oculare. L&#39;emisfero collegato al nervo ottico rimane. </li><li> Trova la retina molto sottile di colore rosa / beige all&#39;interno della conchiglia oculare dall&#39;animale eutanasia. Tenere lo strato pigmentato della retina con una pinza smussati per stabilizzare il paraocchi. Utilizzare un altro paio di pinze chiuse per prendere in giro molto delicatamente tutta la retina intatto al largo della parte posteriore dell&#39;occhio. Evitare di pizzicare, tirare, o tirando direttamente la retina. </li><li> Utilizzare piccole forbici per tagliare la primaveraarea in cui il nervo ottico è ancora attaccato alla retina. </li><li> Assicuratevi di tagliare via ogni residuo di epitelio pigmentato o tessuto sclerale dalla retina. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, trasferire molto delicatamente la retina isolata ad un Sylgard pulito rivestito 35 millimetri x 10 mm piastra di Petri contenente PBS fresco. </li></ol> 9. tutto il montaggio Retina Preparazione <ol><li> Una volta nel piatto Sylgard, usare una pinza e un ago cactus al pin della retina in posizione. Mantenere lo strato di cellule gangliari della retina rivolto verso l&#39;alto e verso il basso del nervo ottico. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell&#39;orientamento desiderato. </li><li> Utilizzare piccole forbici per tagliare la retina in quattro quadranti, rendendo la forma di un quadrifoglio irradia dalla testa del nervo ottico. </li><li> Pin i quadranti della retina con aghi di cactus aggiuntive per rendere la retina più piatta possibile without allungamento (Figura 5). </li><li> Fissare le retine riposte nel piatto Sylgard con 3 ml di paraformaldeide al 4% O / N a temperatura ambiente. </li></ol> 10. Anticorpo colorazione di Retina Nota: retine Stain fissi con anticorpi primari e secondari per la visualizzazione neuroni della retina (Figura 6). <ol><li> Risciacquare, retine piatto montato fisso tre volte per 2 minuti ciascuno in PBS. </li><li> Permeabilize le retine con 1% Triton X-100 con 1% di siero fetale bovino in PBS per 60 min. </li><li> Sciacquare retine per tre volte, 2 min ciascuna, in PBS. </li><li> Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare con 1% Triton X-100 e 1% di siero bovino fetale in PBS a temperatura ambiente per 45 min. </li><li> Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare ciascuna retina in 3 ml 1% di siero fetale bovino in PBScon il mouse purificato anti-topo CD90 / mouse CD90.1 (1: 300 diluizione) O / N a RT. </li><li> Risciacquare retine volta con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare ciascuna retina in 3 ml di PBS (senza FBS) con secondario Alexa Fluor 594 capra anti-IgG di topo (1: 300) O / N a RT. </li><li> Lavare retine con PBS liberamente. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione gli aghi di cactus dalla retina. </li><li> trasferire delicatamente retine su vetrini da microscopio con una pipetta di trasferimento. Assicurarsi di mantenere l&#39;orientamento con strato di cellule gangliari della retina di fronte al soffitto. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell&#39;orientamento desiderato. </li><li> Assorbire ogni eccesso di PBS con KimWipe o altro materiale assorbente. Fare attenzione a non assorbire la retina. </li><li> Aggiungere 5 gocce di ½ glicerolo e ½ PBS in peso per la mattinamezzi ontaggio. </li><li> Coprire retina con vetrino, evitando bolle d&#39;aria. </li><li> coprioggetto protetta tramite smalto trasparente, colla o altro adesivo. </li></ol>

Gli autori non hanno interessi in conflitto o in competizione da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo per indurre condizioni glaucoma simile in un modello in vivo di ratto in. Questa procedura utilizza una iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre cicatrici nel trabecolato 29, 32. Sviluppare tessuto cicatriziale occlude il deflusso dell&#39;umore acqueo che aumenta la pressione nella camera anteriore. Con diminuito deflusso e la pressione si accumulano, la lente sospesa da legamenti elastici spinge indietro nella camera vitrea. vitreo poi appli...

Il glaucoma è un gruppo di malattie oculari che colpiscono i neuroni nella retina, in particolare, le cellule gangliari retiniche 1-2. Gli assoni di queste cellule convergono per diventare il nervo ottico che trasportano informazioni visive al cervello in cui viene percepita la visione. Danni alle RGCs e le loro assoni provoca quindi difetti visivi. Le caratteristiche principali associati a disturbi glaucoma sono RGC degenerazione e la morte, aumento della pressione intraoculare (IOP), e coppettazione disco ottico e atrofia. Queste caratteristiche portano alla perdita del campo visivo o totale, la cecità irreversibile. Attualmente, il glaucoma ha causato la cecità in 70 milioni di persone in tutto il mondo 3. Come tale, essa è la terza causa mondiale di cecità 4. Il meccanismo esatto della morte RGC nel glaucoma rimane sconosciuto. Gran parte della ricerca è stato fatto per svelare il mistero. È noto, tuttavia, che il principale fattore di rischio di glaucoma è un aumento in pressione intraoculare dovuta alla circolazione irregolare di umore acqueo (AH) nella camera anteriore dell&#39;occhio. AH agisce come alternativa trasparente e incolore di sangue nella camera anteriore dell&#39;occhio avascolare. Si nutre le cellule circostanti, rimuove i residui secreti dai processi metabolici, trasporti neurotrasmettitori, e permette la circolazione di farmaci e cellule infiammatorie all&#39;interno dell&#39;occhio durante gli stati patologici 1. Il mantenimento della circolazione di umore acqueo coinvolge il corpo ciliare e trabecolato. umor acqueo è prodotto dal corpo ciliare. Esso fluisce poi nella camera anteriore per mantenere la salute generale del tessuto oculare. 75 - 80% del deflusso dell&#39;umor acqueo viene secreto attivamente attraverso la non-pigmentazione dell&#39;epitelio ciliare quando il fluido viene filtrato attraverso tre strati di tessuto spugnoso nel muscolo ciliare. Le uscite fluido attraverso il trabecolato e attraverso canale di Schlemm che empti nel sistema sanguigno 5 .Il restante 20 - 25% del deflusso bypassa trabecolare che è passivamente secreti da ultrafiltrazione e diffusione attraverso la via uveo-sclerale. Questo percorso sembra essere relativamente indipendente dalla pressione intraoculare 1. Quando la produzione umore acqueo e deflusso sono in equilibrio, la pressione aumenta all&#39;interno dell&#39;occhio. Come detto, questo aumento della pressione intraoculare è il principale fattore di rischio per lo sviluppo di glaucoma. Tale pressione provoca danni agli strati intricate neuroni della retina nella parte posteriore dell&#39;occhio. Danni ai assoni delle cellule gangliari della retina del nervo ottico fa sì che il cervello a non ricevere più accurate informazioni visive. Come risultato, la percezione di visione è persa e può verificarsi completa cecità. Fino ad oggi, non esiste una cura per il glaucoma. Diversi metodi di trattamento esistenti che in primo luogo lo scopo di ridurre la pressione intraoculare. Questi includono attualitàclassi di farmaci come i bloccanti dei recettori beta1-adrenergici, o analoghi delle prostaglandine per uso topico. I beta-bloccanti riducono la pressione intraoculare riducendo la produzione di umore acqueo 7. Le prostaglandine funzione per ridurre la PIO aumentando il deflusso dell&#39;umore acqueo 8-14. Alfa agonisti adrenergici e inibitori dell&#39;anidrasi carbonica sono utilizzati anche come metodi secondari di trattamento. Alpha agonisti adrenergici aumentano deflusso attraverso la via uveosclerale 15-17. Inibitori dell&#39;anidrasi carbonica riducono la produzione di AH per inibizione enzimatica 18. Molto procedure più invasive vengono utilizzati anche per il trattamento del glaucoma. Trabeculoplastica laser è usato per aumentare il deflusso dell&#39;umore acqueo 19. Un&#39;altra terapia chirurgica, chiamata trabeculectomia, crea un sito di drenaggio alternativo per filtrare AH quando il percorso trabecolare tradizionale è bloccato 20-21. Queste opzioni di trattamento sono stati conosciuti per effettivamente ridurre la IOP. Tuttavia, fino al 40% dei pazienti affetti da glaucoma mostrano normali livelli di IOP suggerendo la necessità di metodi terapeutici più completi. 22,23 Inoltre, la morte delle cellule gangliari della retina visto nel glaucoma è irreversibile, una volta che inizia e trattamenti attuali non si fermano la progressione della malattia 24-28. Ciò ha evidenziato la necessità di efficaci terapie neuroprotettive che colpiscono la sopravvivenza dei neuroni stessi. Sviluppo di modelli glaucoma è fondamentale per questo sviluppo. In questo studio stiamo dimostrando un metodo di indurre effetti glaucoma simili nei ratti adulti lungo Evans utilizzando una procedura modificata originariamente delineato da Morrison 29. In questa procedura, iniezioni di 2 M soluzione salina ipertonica nel plesso venoso episclerale induce condizioni di glaucoma, come da cicatrici di tessuto per ridurre deflusso dell&#39;umore acqueo nel trabecolato che porta a un aumento della pressione intraoculare e una significativa perdita di RGCs wntro un mese dalla procedura di 30-31. procedure di glaucoma che inducono, come quella descritta qui, può essere la chiave per sbloccare nuovi sviluppi nel trattamento del glaucoma.

<table><tbody><tr><td>Xilazina cloridrato, minimo 99%</td> <td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato iniezione, USP, 100 mg/ml</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>Flacone da 10 ml</td></tr><tr><td>Acepromazina Maleato, 10 mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>Flacone da 50 ml</td></tr><tr><td>Flacone di siero, VWR da 10 ml</td><td></td><td>16171319</td><td>Vetro borosilicato</td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 1 ml.</td><td>Ago VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Soluzione 2 M&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per microelettrodi&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in borosilicato standard e a parete sottile lucidati pesante&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td> senza filamento, ago per siringa Microfil <td>da 0,86 mm</td></tr><tr><td>per il riempimento di micropipette</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>Ago Luer-Lock calibro 18</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Ago per siringa</td></tr> Tubo flessibile in <tr><td>polietilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0,034 pollici di diametro, circa 10 pollici...</td></tr><tr><td>Soluzione oftalmica di proparacaina cloridrato, USP, 0,5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; flacone sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici curve</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td>Morsetto emostatico <td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>bordo curvo</td></tr><tr><td>Triplo unguento antibiotico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Strumenti per la scienza&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi #11</td><td>Strumenti per la scienza fine&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri monouso 60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato 10x Concentrato</td><td>Sigma, Life Science&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x diluizione&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Strumenti di scienza fine&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinze (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento da 3 ml, polietilene, non sterili</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 o 52947-948</td><td>Graduazioni da 1 e 2 ml</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Piastra di Petri Easy Grip...</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr>Aghi <td></td><td></td><td></td>di<td>cactus</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 o 818715.0100</td><td>Trasformato in una soluzione al 4%&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100 ml</td><td>Trasformato in una soluzione all'1% e allo 0,1%&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Topo Purificato Anti-Rat CD90/topo CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>diluizione 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-topo&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>A11005</td><td>Diluizione 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G5516-100 ml</td><td>50% di glicerolo al 50% di PBS, in peso&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetro di copertura&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Spessore 1 22 x 50 mm</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma inducono procedura in un<em&gt; in vivo</em&gt; modello di ratto e tutto il montaggio retina preparazione

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Il glaucoma è una malattia del sistema nervoso centrale che colpisce le cellule gangliari retiniche (RGC). assoni RGC che costituiscono il nervo ottico portano input visivo al cervello per la percezione visiva. Danni alle RGCs e ai loro assoni porta alla perdita della vista e / o cecità. Anche se la causa specifica del glaucoma è sconosciuto, il fattore di rischio per la malattia è una pressione intraoculare. procedure di glaucoma che inducono in modelli animali sono uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano il meccanismo della morte RGC. Tali informazioni possono portare allo sviluppo di trattamenti neuroprotettivi efficaci che potrebbero essere di aiuto nella prevenzione della perdita della vista. Il protocollo in questo documento descrive un metodo per indurre glaucoma - come condizioni in un modello di ratto in vivo dove 50 ml di 2 M salina ipertonica viene iniettato nel plesso venoso episclerale. Sbiancamento dei vasi indica iniezione di successo. Questa procedura provoca la perdita di RGCs per simulare il glaucoma. Un mese dopoiniezione, animali vengono sacrificati e gli occhi vengono rimossi. Successivamente, la cornea, lenti, e vitreo vengono rimossi per fare un oculare. La retina è poi sfogliato dalla parte posteriore dell&#39;occhio e appuntato su piatti Sylgard utilizzando aghi di cactus. A questo punto, i neuroni della retina possono essere colorati per l&#39;analisi. I risultati di questo laboratorio mostrano che circa il 25% dei RGCs sono persi entro un mese della procedura rispetto ai controlli interni. Questa procedura consente di analisi quantitativa di morte delle cellule gangliari della retina in un modello di topo di glaucoma in vivo.

Questa sezione illustra i componenti apparecchiature e procedure utilizzate per indurre condizioni di glaucoma, come in un topo modello di glaucoma in vivo. Mostriamo i singoli strumenti e delle attrezzature utilizzate per eseguire una iniezione salina ipertonica che provoca un aumento della pressione intraoculare. Mostriamo l&#39;iniezione nel plesso venoso episclerale con il suo effetto scottatura caratteristico e l&#39;aspetto torbido della camera anteriore risultante. Abbiam...

Il glaucoma è caratterizzato da danni alle cellule gangliari retiniche. L'induzione del glaucoma in modelli animali può fornire informazioni sullo studio di questa malattia. Qui, descriviamo una procedura che induce la perdita di RGC in un modello di ratto in vivo e dimostra la preparazione di retine a montaggio intero per l'analisi.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre una significativa perdita di cellule gangliari retiniche nella retina del ratto creando condizioni simili al glaucoma. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi del glaucoma e della protezione neuronale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che provoca una perdita graduale delle cellule gangliari retiniche, simile a quella osservata nel glaucoma umano.Per iniziare questa procedura, tirare due micropunture di vetro finemente affusolate da un tubo standard in borosilicato con pareti sottili e lucidato, utilizzando un estrattore di microelettrodi. Successivamente, riempire retrogradamente una micropuntura con soluzione salina due molare, usando una siringa da un millilitro. Rimuovere le bolle d'aria dalla punta dell'elettrodo picchiettando.Successivamente, riempire una seconda siringa da un millilitro con NaCl due molare. Collegarla a un ago da 18 gauge e quindi attaccare l'ago a un tubo in polietilene lungo 25 cm. Utilizzare lo stantuffo della siringa per riempire il tubo in polietilene con soluzione salina attraverso l'ago.Quando sia il microago che il tubo sono riempiti con soluzione fisiologica, collegarli con attenzione. Eliminare qualsiasi bolla d'aria nel collegamento, picchiettando per far uscire le bolle d'aria. Successivamente, passare leggermente la punta del microago su un tovagliolo di carta per affilarla con precisione.Verificare la resistenza del microneedlo spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa finché non si osserva un sottile getto di liquido sul tovagliolo di carta. Il getto di liquido non deve essere più largo di 0,5 millimetri per garantire l'integrità adeguata della punta dell'ago. In questa procedura, dopo aver anestetizzato l'animale con il cocktail KAX, verificare i riflessi pizzicando i piedi o la coda per assicurarsi che l'animale sia incosciente.Quindi, tagliare i baffi con le forbici. Successivamente, imbibire un applicatore di cotone con soluzione di betadina e detergere l'area intorno all'occhio sperimentale. Sotto il microscopio, utilizzare un emostatico per clampare la palpebra inferiore, in modo da far sporgere l'occhio, esporre la vena epischlerale e limitare i movimenti oculari.Successivamente, perforare con attenzione la vena episclerale con l'ago microscopico a un angolo compreso tra 10 e 20 gradi rispetto alla vena. Una puntura nella vena ha successo quando si osserva il sangue entrare nella punta dell'ago microscopico. Iniettare lentamente 50 microlitri di soluzione salina nella vena.Le vene diventano pallide mentre il sale circola attraverso il sistema vascolare, ma alcune aree potrebbero mantenere un aspetto rosso sangue. Il passaggio singolarmente più critico di questa procedura avviene durante l'iniezione del sale fisiologico due molare. È fondamentale che avvenga la decolorazione del sistema vascolare per garantire un esito positivo.Mantenere un'ago stabile e un angolo di 20 gradi è fondamentale per questa procedura. Successivamente, eseguire una seconda iniezione nella vena per garantire un danno completo dello strato delle cellule gangliari retiniche. Entro pochi minuti, si dovrebbe osservare un aspetto torbido distinto attraverso l'iride dell'occhio, mentre il sale circola attraverso il sistema vascolare.Ora, utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto connettivo nella cavità orbitaria che circonda l'occhio, facendo attenzione a non incidere il bulbo oculare stesso. Successivamente, tagliare con cura il nervo ottico e qualsiasi altro tessuto residuo per estrarre il bulbo oculare integro utilizzando le forbici con bordo curvo. Posizionare il bulbo oculare estratto in una piastra di Petri sterile contenente PBS fresco.Successivamente, crea una coppetta oculare dal bulbo oculare praticando una piccola incisione con il bisturi appena posteriormente al confine tra iride e sclera. Continua l'incisione lungo la circonferenza dell'occhio per rimuovere l'emisfero corneale dal bulbo oculare. Tenendo ferma con una pinzetta il foglietto pigmentato della retina per stabilizzare la coppetta oculare, utilizza un'altra pinzetta per staccare delicatamente la retina intera di colore rosa-beige dalla parte posteriore dell'occhio.Successivamente, tagliare o staccare delicatamente la zona in cui il nervo ottico è attaccato alla retina. Assicurarsi di rimuovere qualsiasi residuo di epitelio pigmentato o tessuto sclerale dalla retina. Quindi, trasferire delicatamente la retina isolata in una nuova piastra di Petri rivestita con Sylgard e contenente PBS fresco.Una volta nella piastra di Sylgard, fissare la retina in posizione. Mantenere il livello delle cellule gangliari retiniche rivolto verso l'alto e il nervo ottico verso il basso. Successivamente, tagliare la retina in quattro quadranti, formando la forma di un quadrifoglio, irradiandosi dalla testa del nervo ottico.Quindi, fissare i quadranti della retina con ulteriori aghi di cactus per rendere la retina il più piatta possibile senza stirarla. Successivamente, fissare la retina puntinata nella piastra di Sylgard con tre millilitri di paraformaldeide al 4% durante la notte a temperatura ambiente prima di eseguire le procedure standard di colorazione. Di seguito è riportato un confronto tra l'occhio di controllo non trattato e l'occhio sperimentale, un mese dopo l'iniezione di soluzione salina induttrice di glaucoma.I neuroni gangliari retinici sono marcati con un anticorpo contro Thy 1.1. La procedura determina una riduzione del numero di RGC, una defascicolazione degli assoni dai principali fasci assonali e una distorsione della circolarità dei RGC rimanenti. Questi sono gli assoni caratteristici in fase di defascicolazione risultanti dall'iniezione di soluzione salina.Un vaso sanguigno è mostrato all'interno della retina, e questi sono i fasci di assoni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare sempre un'ago micrometrico fresco, affilato e bisellato.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come immunocitochimica, Western blot, ibridazione in situ, sequenziamento dell'mRNA o analisi comportamentali, al fine di rispondere a ulteriori domande associate al glaucoma, ad esempio in che modo la perdita delle cellule gangliari retiniche influisce sull'acuit&agrave; visiva degli animali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del glaucoma per esplorare strategie neuroprotettive nei ratti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre una significativa perdita di cellule gangliari retiniche nel ratto, utilizzando un'iniezione di soluzione salina ipertonica nella vena epischlerale.

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Medicine

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Source: Bosco, A., et al. Dinamiche in vivo dell'attivazione microgliale retinica durante la neurodegenerazione: imaging oftalmoscopico confocale e morfometria cellulare nel glaucoma di topo. J. Vis. Exp. (2015) Questo video dimostra l'imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma. Un topo transgenico con microglia retinica fluorescente che esprime proteine è posizionato sotto un oftalmoscopio. L'illuminazione a infrarossi viene utilizzata per localizzare la testa...

Imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare nell'occhio murino che provoca la perdita di cellule gangliari retiniche come osservato nel glaucoma. microsfere magnetiche vengono iniettati nella camera anteriore e attratti l'angolo iridocorneale utilizzando un magnete per bloccare il deflusso dell'umore acqueo.

Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi

Il seguente rapporto descrive come replicare il modello di roditore di neuropatia ottica ischemica anteriore non arteritica (rNAION), utilizzando i parametri appropriati di colorante, lenti a contatto e laser. Riveliamo anche i passaggi appropriati per valutare la lesione rNAION in vivo.

Il modello di roditore di nonarteritic Neuropatia ottica ischemica anteriore (rNAION)

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per lo studio di una forma di neurostimolazione chimica del wholemount ratto retine in vitro con il glutammato, un neurotrasmettitore. Neurostimolazione chimica è un'alternativa promettente per la neurostimolazione elettrica convenzionale dei neuroni retinici per il trattamento di cecità irreversibile causata da malattie degenerative dei fotorecettori.

Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro

Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare

Ipertensione oculare cronica è indotta applicando una sutura circumlimbal in ratti e topi, che conduce al deterioramento strutturale e funzionale delle cellule ganglionari retiniche coerente con il glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

La retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR) può essere utilizzata per modellare malattie retiniche ischemiche come la retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica proliferativa e per servire da modello per studi proof-of-concept nella valutazione dei farmaci antiangiogenetici per le malattie neovascolari. OIR induce una neovascolarizzazione robusta e riproducibile nella retina quantificabile.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L'istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l'angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l'efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.

Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare un nuovo modello di neurodegenerazione glaucomatosa basato sulla cauterizzazione termica a 360° del plesso vascolare limbare, inducendo ipertensione oculare subacuta.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Questo protocollo descrive la procedura per isolare la retina di topo a montaggio intero ed eseguire l'immunocolorazione per marcare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC). Il processo è seguito dall'imaging e dal conteggio automatico delle RGC utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale, fornendo un metodo semplice, veloce e accurato per quantificare le RGC nell'intera retina del topo.

Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

Impara a indurre glaucoma nel ratto mediante iniezione ipertonica nella vena episclerale per studiare la perdita di cellule gangliari retiniche. Questa tecnica consente analisi di neuroprotezione in 30 minuti.

Glaucoma inducono Procedura in un

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