Name: Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Scopri la regolazione metabolica del recettore degli estrogeni nel cancro al seno usando dati multi-omici. Questo metodo integra trascrittoma, cistroma e metaboloma per analizzare le vie metaboliche nelle cellule MCF7.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, premio ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti.

1. Preparazione di campioni di RNA-Seq <ol><li> Colture cellulari e trattamento <ol><li> Cultura le cellule MCF7 in MEM Improved (IMEM) più medium fenolo-rosso con 10% di calore inattiva FBS, 1% di penicillina / streptomicina a 37 ° C in umidificata 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. Nota: linea cellulare stesso e condizioni di coltura cellulare viene utilizzato nel corso dello studio. </li><li> Seed 100.000 cellule MCF7 per pozzetto in 6 pozzetti. Hanno triplicato per ogni trattamento. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 24 ore a 37 ° C in umidificata 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di isolamento dell&#39;RNA reattivo (acido guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio) in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Poi raccogliere il reagente lisato cellulare pipettando e deposito in provette da 1,5 ml </li></ol></li><li> Isolamento RNA <ol><li> Aggiungere 200 ml chloroform a 1 ml di lisato cellulare reattivo (1.1.3) e vortex per 10 secondi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa (superiore) in una nuova provetta senza disturbare le altre fasi. </li><li> Aggiungere 500 microlitri 100% di isopropanolo in un tubo con la fase trasferita-acquosa, e mescolare invertendo. Incubare a -20 ° C per una notte. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. Osservare una pellet sul fondo della provetta. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 750 microlitri RNasi-free 70% di etanolo da breve vortice. </li><li> Centrifugare i campioni a 6.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e centrifugare il campione a 16.000 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere tutto l&#39;etanolo residuo. Rimuovere l&#39;etanolo residuo pipettando con una punta di gel-carico e impostare i tubi fino rivolto verso il basso per asciugare per 10 minuti. Sciogliere il pellet in 20-50 acqua DEPC trattati ul Depending delle dimensioni del pellet. </li></ol></li><li> Purificare l&#39;RNA utilizzando RNA kit di pulizia seguendo il protocollo 4. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando un kit di test fluorimetria basato seguendo il protocollo 9. NOTA: OD a 260 nm è presa per determinare la concentrazione di RNA e il rapporto di OD a 260 nm e 280 nm sono utilizzati per determinare la purezza del campione. Si raccomanda il controllo della qualità RNA utilizzando test Bio-analizzatore. </li><li> Prendere circa 0,5 a 1 mg di RNA purificato per il sequenziamento. NOTA: il centro Biotech prepara le librerie di sequenziamento ed esegue abbinato-end leggere sequenziamento utilizzando metodi precedentemente descritti 2. </li></ol> 2. Preparazione del campione ChIP-Seq <ol><li> Colture cellulari e trattamento <ol><li> Seed 500.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita. NOTA: Per ogni tirare verso il basso sono stati utilizzati 16 tavole. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 a ognipiatto. Trattare le cellule per 45 min (37 ° C in umidificata 5% CO 2 atmosfera). </li></ol></li><li> Reticolazione e Cell Harvest <ol><li> Aggiungere 250 microlitri 37% di formaldeide in 5 ml di mezzo di reticolare cromatina, incubare a temperatura ambiente per 15 min. Smettere di reticolazione lavando le cellule con 5 ml di ghiaccio freddo 1x MEM. </li><li> Raccogliere le cellule in 250 microlitri cellulare Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-ossido dimethyldodecan-1-ammina) per piastra. </li></ol></li><li> La frammentazione della cromatina <ol><li> Sonicare le cellule per 30 sec x 8 a amplificatore di 30 per raggiungere dimensioni cromatina richiesti. Raffreddare ogni campione sul ghiaccio dopo una sonicazione di 30 sec. </li><li> Centrifugare a 16, 000 xg per 10 min a 4 ° C, e con attenzione a pipetta il sopranatante senza disturbare il pellet sul fondo. </li><li> Prendete una un&#39;aliquota 5 ml del surnatante, e controllare la dimensione del DNA mediante elettroforesi attraverso 1,5% gel di agarosio come descritto in precedenza 10. La dimensione idealedi DNA deve essere compreso tra 200-500 bp. </li></ol></li><li> immunoprecipitazione della cromatina <ol><li> Risparmia il 25 microlitri di lisato cellulare come input. In un tubo da 50 ml, mescolare 4 ml di lisato cellulare con 20 ml di tampone di IP (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, e 0,5% Triton X), anticorpo ERα (500 microlitri F10 e 500 microlitri HC- 20), e 500 microlitri Prota e protg proteine ​​rivestimento sfere magnetiche. Incubare la miscela per rotazione a 4 ° C durante la notte per consentire la formazione di anticorpo chromatin-. </li></ol></li><li> Lavaggi e Reverse-reticolazione <ol><li> Utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline magnetiche sul lato magnetizzato per rimuovere il tampone di lavaggio. </li><li> Lavare le perline magnetiche in 25 ml di tampone di lavaggio I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 150 mM NaCl). Per lavare accuratamente le sfere magnetiche senza disturbare complessi DNA-proteina, aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio lentamente al tubo lungo il lato poi invertire i tubi fino a quando tutte le sfere magnetiche sono misti ben with il tampone di lavaggio senza apparire come una pallina. In alternativa, utilizzare il rotatore per invertire il tubo. Non vortice dei campioni. Lavare le perline magnetiche con lo stesso metodo nelle seguenti fasi. </li><li> Lavare le perline magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 500 mM NaCl). </li><li> Lavare le sfere magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer III (1,6 mm EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate e 250 mm LiCl). </li><li> Lavare le perline magnetiche in 25 ml 1x tampone TE (1 mM EDTA e 10 mM Tris HCl) due volte. </li><li> Eluire il DNA in 500 microlitri tampone di eluizione (1% SDS, e 10 mm NaHCO 3) e poi assegnare l&#39;eluizione 500 microlitri DNA in 4 tubi. Per il DNA da ingressi, eluire il DNA in 125 microlitri tampone di eluizione. </li><li> Incubare le provette a 65 ° C durante la notte su un blocco riscaldante. Coprire le provette sul blocco di riscaldamento con un foglio di alluminio per mantenere il calore anche su tutti i tubi. Mettere un peso sui tubi per impedire loro di apertura. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Isolamento del DNA <ol><li> Raffreddare le provette a temperatura ambiente per 5 min. Isolare il DNA da campioni di tirare verso il basso utilizzando il kit di isolamento DNA chip. Seguire le istruzioni del produttore. <ol><li> Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame per ogni provetta. Se le forme precipitato, aggiungere un altro tampone di legame 250 microlitri fino a quando la soluzione è chiara. </li><li> Caricare il campione attraverso la colonna e centrifugare a 16.000 xg per 30 sec. Lavare il campione con 250 ml di tampone di lavaggio. Ricordarsi di aggiungere etanolo al tampone di lavaggio quando prima volta usarlo. Ripetere il lavaggio. </li><li> Eluire il DNA in 15 microlitri tampone di eluizione. Combina il DNA della stessa tirare giù da 4 tubi per ottenere circa 55 ml di DNA. </li></ol></li><li> Isolare il DNA ingresso utilizzando un kit di purificazione del DNA. <ol><li> Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame in ogni provetta e incubare per 10 min. Caricare il campione attraverso la colonna in 2 ml collectisul tubo. </li><li> Lavare il campione con 750 microlitri tampone di lavaggio, centrifugare a 16.000 xg per 1 min. Ripetere centrifugazione per eliminare ogni residuo di buffer. Eluire il DNA in 30 ml di EB. </li></ol></li><li> Misurare la concentrazione di DNA Utilizzando un commerciale Fluorocromo Assay con Modifica 11. <ol><li> Diluire il tampone TE 20x in 1x TE come tampone per diluire i campioni dei reagenti e del DNA. Prendere 5 ml DNA isolato e diluirlo in 50 ml di 1x TE. </li><li> Da / DNA ml di soluzione 2 mg fare uno standard di DNA che vanno dal bianco per 1, 10, 100, 1000 mg / ml. In un piatto ben 96, allocare 25 ml di ogni standard così come la diluizione del DNA in duplice copia. (Si consiglia triplicato per standard.) </li><li> Preparare il reagente di lavoro facendo una diluizione 200 volte da dsDNA reagente in tampone 1x TE in tubo di plastica. Coprire la soluzione reagente di lavoro con un foglio di alluminio per evitare la luce. Aggiungere 200 ml di reagente di lavoro in ogni campione. Incubate a temperatura ambiente per 5 min. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce. </li><li> Misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione a 480 nm, emissione 520 nm). Generare la curva standard del DNA di fluorescenza in funzione della concentrazione di DNA. Determinare le concentrazioni dei campioni in base alla curva standard generata DNA. </li></ol></li></ol></li><li> Verifica della ChIP esperimento utilizzando qPCR <ol><li> Take 2 ml isolate DNA e diluito in 20 ml di acqua. Impostare la reazione qPCR in triplice copia mescolando 2,5 ml di diluizione del DNA, 5 ml Green I PCR Master Mix, 1 ml di primer, e 1,5 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Eseguire il qPCR con il sistema rapido Real-Time PCR utilizzando il seguente programma: Fase 1: 95 ° C per 60 sec, Fase 2: 95 ° C per 10 secondi, 60 ° C per 60 secondi, ripetere il punto 2 39 volte. </li></ol></li><li> Invia campione di DNA 10 ng per il centro Biotech per il sequenziamento. NOTA: Il Biotech Centro prepara il DNA ChIP in librerie in base alle istruzioni, ed esegue la sequenza singola lettura utilizzando metodi precedentemente descritti 2. </li></ol> 3. Metabolomica Assay Preparazione del campione <ol><li> Colture cellulari e trattamento <ol><li> Seed 400.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita. Per ogni trattamento preparare tre campioni. Utilizzare due piastre in ciascun campione per ricevere abbastanza cellule per la rilevazione. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 alle cellule. Trattare le cellule per 24 ore (37 ° C in umidificata 5% CO 2 atmosfera). </li></ol></li><li> Raccolta dei campioni <ol><li> Aggiungere 5 ml ghiacciata PBS 1x alla piastra, aspirare il PBS dopo breve inclinando la piastra più volte. Ripetere due volte, e rimuovere il più PBS possibile dopo l&#39;ultimo lavaggio. </li><li> Aggiungere 750 ml di acetone pre-freddo per ciascuna piastra e raschiare le cellule. Combinare le cellule in acetone da due piastre ain una provetta 2 ml su ghiaccio. </li><li> conta delle cellule per la normalizzazione <ol><li> Per ogni trattamento, usare due piastre supplementari per la quantificazione delle cellule. Per de-fissare le cellule dalla piastra, aggiungere 2 ml di SE tampone (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO 3 e 1 mM EDTA) in ogni piatto e incubare per 5 min. </li><li> Raccogliere e mescolare bene le cellule pipettando le cellule nel buffer HE. Utilizzare totale di 20 microlitri soluzione cella per contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol></li></ol></li><li> Conservare i campioni a -80 ° C prima di inviare al centro Metabolomica di identificare e quantificare i metaboliti mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC-MS) analisi. </li></ol> 4. Analisi Integrativa <ol><li> RNA-Seq Analisi dei dati: <ol><li> Eseguire il controllo qualità dei file FASTQ utilizzando FastQC: Leggi QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Selezionare FastQC: Leggere sotto lo strumento di NGS: QC e manipolazione. Carica il file di dati grezzi da histor correntey. NOTA: Si raccomanda di dare un titolo per il file di output per ricordare ciò che il lavoro è stato per dato che ci potrebbe essere più uscite. </li></ol></li><li> Esegui e apparirà il file di output sotto la Storia. Ripetere la stessa procedura per ogni file di sequenza. adattatori trim mediante clip in NGS: FASTX Toolkit. </li><li> Allinea legge per hg19 utilizzando Tophat2 con RefSeq genoma di riferimento annotazione 12 (valori di default). <ol><li> Selezionare Tophat2 sotto strumento di NGS: analisi di RNA. Indicare libreria di tipo accoppiato (single-end vs abbinato-end). </li><li> Carica il file di input FASTQ dalla storia attuale. Selezionare il genoma di riferimento. Scegliere le impostazioni predefinite. Oppure utilizzare l&#39;elenco dei parametri completo da modificare. </li><li> Esegui e produrrà due file di output: uno è UCSC LETTO traccia di raccordi; un altro è un elenco di allineamenti di lettura in formato BAM. </li></ol></li><li> Caricare file BAM di strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Calcolare i valori di espressione utilizzando QuantStrumento ification. </li><li> Identificare geni differenzialmente up-regolati utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento&gt; 2 e p-value &lt;0.05. Allo stesso modo, identificare i geni differenzialmente down-regolato utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento &lt;0,5 e p-value &lt;0.05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Analisi dei dati: <ol><li> Allineare FASTQ Legge di hg19 utilizzando Bowtie2 13 (valori di default) in Galaxy. <ol><li> Selezionare Bowtie2 sotto lo strumento di NSC: Mapping. Verificare se la libreria è mate-abbinato (single-end vs abbinato-end). Carica il file FASTQ dalla storia attuale. </li><li> Selezionare il genoma di riferimento. Utilizzare le impostazioni dei parametri di default. Esegui e produrrà file di output con la sequenza mappata legge come file di BAM. Ripetere la procedura per ogni file di sequenza. </li></ol></li><li> Identificare i picchi che utilizzano MACS 14 un valore p di taglio del 6.0e-7 e FDR di 0,01, come descritto in precedenza 2. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomica Analisi dei dati: <ol><li> Convertire nomi chimici dei metaboliti di KEGG_IDs. </li><li> Identificare metaboliti differenziale regolamentati confrontando i livelli rilevati nel veicolo vs. E2 trattati campioni (2 volte cut-off è stato utilizzato in questo studio). </li></ol></li><li> Analisi Integrativa: <ol><li> Identificare i geni che hanno siti di legame ERα utilizzando lo strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Tradurre Regioni alla funzione geni utilizzando 20 kb come distanza di cut-off. </li><li> Identificare geni differenzialmente l&#39;alto e verso il basso-regolato dalla analisi dei dati di RNA-Seq utilizzando cambiamento fold&gt; 2 e ripiegare il cambiamento &lt;0,5, rispettivamente, con il p-value &lt;0.05 come tagliare. Confrontare l&#39;elenco dei ERα sito di legame che contengono geni che utilizzano Venn confronto diagramma. </li><li> Utilizzare questo elenco per identificare E2 vie metaboliche modulati utilizzando il modulo Metscape 15 di Cytoscape. <ol><li> Selezionando modulo Metscape da applicazioni, scegliere costruire una rete e poi pathway-basopzione ed. </li><li> Selezionare l&#39;Organismo (umano). Selezionare file di dati di E2 elenco composto non regolamentata (KEGG ID) e E2 up-regolata lista gene. </li><li> Scegli Composto -Reaction -Enzyme-Gene come tipo di rete. Scegli composti / geni come la query. </li><li> Costruire una rete. Ripetere con l&#39;E2 down-regolato composto e geni. </li></ol></li></ol></li></ol>

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University of Illinois ha ricevuto una sovvenzione di investigatore Iniziato da Pfizer Inc. ZME e YCZ ha ricevuto il sostegno di stipendio da questa concessione.

In questo articolo, abbiamo descritto la generazione e l&#39;analisi integrativo di RNA-Seq, Chip-Seq dati e metabolomica da cellule MCF-7 che sono trattati con E2. Abbiamo sviluppato una serie di protocolli strategizing di utilizzare i metodi più efficienti e user-friendly articoli molli che producono scoperta biologicamente rilevanti. A nostra conoscenza, il nostro è il primo studio a integrare omiche dati provenienti da tre diverse analisi e nuove vie metaboliche identificate che ERα regolato direttamente nelle cellu...

Gli estrogeni sono importanti regolatori di molti processi fisiologici in entrambi i maschi e femmine, tra cui tessuti riproduttivi, tessuti metabolici, cervello e ossa 1. Oltre ai benefici effetti in questi tessuti, estrogeni guidare anche i tumori che derivano da mammaria e tessuti riproduttivi. Estrogeni lavorano principalmente attraverso ER per indurre effetti specifici tipo di cellula. sequenziamento profondo delle trascrizioni regolate da ERα utilizzando RNA-Seq e genome-wide ERα DNA analisi siti di legame con ChIP-Seq ha dimostrato di essere utile per capire come funziona ERα in diversi tessuti e tumori che ne derivano. Noi e altri abbiamo pubblicato profili di espressione genica associati a recettori diversi (ERα vs ERβ) 2,3, differenti ligandi 3-5 e diverse coregulators 2,4,6,7. RNA-Seq è il metodo principale per esaminare il trascrittoma, offrendo una maggiore precisione ed efficienza rispetto a ba microarraygene sed analisi di espressione 8. RNA ottenuto da linee cellulari 2-4,7, tessuti o campioni di tumore sono in sequenza, mappato alle assemblee genomiche disponibili e geni differenzialmente regolati sono identificati. Immunoprecipitazione della cromatina (chip) è impiegato per sezionare il fattore di trascrizione e coregulator legame con noti siti di normative vincolanti cromatina. ChIP-Seq (ChIP seguita da alta sequenziamento rendimento) fornisce il rilevamento imparziale dei siti di legame a livello mondiale. Metabolomica è un altro approccio di sistema biologico sempre più utilizzato, che quantitativamente misure, risposta multiparametrica dinamica dei sistemi viventi a vari stimoli, tra cui i prodotti chimici e le perturbazioni genetiche. Eseguendo profilo metabolico globale, una lettura funzionale può essere ottenuta da cellule, tessuti, e sangue. Inoltre, le informazioni da esperimenti trascrittoma non riflettono sempre i cambiamenti reali nel livello di enzimi che contribuiscono alla vie biochimiche. Combinatoanalisi dei dati trascrittoma e metaboloma ci permette di identificare e correlare i cambiamenti nell&#39;espressione genica con i cambiamenti dei metaboliti attuali. Sfruttando le informazioni provenienti da tutti questi gruppi di dati su larga scala forniscono i dettagli meccanicistici per comprendere il ruolo dei fattori di trascrizione che regolano i sistemi biologici complessi, in particolare quelli che riguardano lo sviluppo e malattie come il cancro e il diabete umano. La natura complessa del genoma dei mammiferi rende difficile integrare e interpretare i dati ottenuti dagli esperimenti trascrittoma, cistrome e metaboloma completamente. Identificare gli eventi di legame funzionali che avrebbe portato a cambiamenti nell&#39;espressione dei geni bersaglio è importante perché una volta che i siti di legame funzionali sono identificati; conseguente analisi, tra cui vincolante di trascrizione (TF) analisi motivo, potrebbero essere eseguite con maggiore accuratezza. Questo porta alla identificazione di cascate TF biologicamente significativi e meccanismi. Comparis anche direttisu esperimenti RNA-Seq e Chip-Seq non sempre possibile in quanto i dati di ciascun esperimento sono diverse scale e rumori e in alcuni casi segnali significativi vengono oscurati dal rumore popolazione. Non siamo a conoscenza di alcun studio che integra le informazioni da questi tre approcci indipendenti ma collegati per capire la regolazione metabolica diretta da ERα nel cancro al seno. Pertanto, il nostro obiettivo generale di questo lavoro è di mettere in relazione gli eventi produttivi vincolanti alle espressione genica e le modifiche dei metaboliti. Al fine di raggiungere questo obiettivo, abbiamo integrato i dati da RNA-Seq, Chip-Seq esperimenti e metabolomica e individuato i estrogeni indotti ERα eventi che avrebbero portato a cambiamenti di espressione genica in vie metaboliche vincolante. Per la prima volta, mettiamo a disposizione un set completo di protocolli (Figura 1) per la generazione di ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolomica profiling e l&#39;esecuzione di analisi integrativa dei dati per scoprire circuiti genici romanzo che regolano il metabolismo del senolinee cellulari di cancro.

<table><tbody><tr><td>Miscela di trigliceridi</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Acido oleico-polvere solubile in acqua&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita dei reagenti TRIzol</td><td>&nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life tecnologie&nbsp;</td>Kit di purificazione <td>PCR 10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick QIAGEN</td><td></td><td>28106</td><td>Isolamento del DNA del campione in ingresso&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di isolamento ZYMO ChIP-DNA&nbsp;</td><td>Ricerca Zymo&nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA pulito & Concentratore</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf; PicoGreen&uml; Kit di analisi del dsDNA</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P7589</td><td>Set</td></tr> di <tr><td>DNasi senza RNasi</td> per quantificazione del DNA <td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Purificazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC&nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td> Dismembratore sonico modello 120 <td>senza Dnase/RNASI</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB120110</td><td>Con sonda da 1/8</td></tr><tr><td>&nbsp; Fisher Scientific Recinzione Sonora</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>Per la riduzione del suono</td></tr><tr><td>&nbsp; Eppendorf Provette 5,0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubi (2 buste da 100 cad.)</td></tr><tr><td>Miscela di primer casuale&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Trascrittasi inversa</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&nbsp;</td>BP160100 <td>gel di agarosio all'1,5%</td><td></td></tr><tr><td>Kit di saggi Qubit RNA HS</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>Q32852</td><td>Quantificazione dell'RNA (100 saggi)&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresse di Formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della Proteasi&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Ogni compressa è sufficiente per 10 ml di tampone di lisi</td></tr><tr><td>PhosSTOP Inibitore della fosfatasi Cocktail Compresse Roche</td><td></td><td>4906845001</td><td>Ogni compressa è sufficiente per 10 ml di tampone di lisi</td></tr> Kit di <tr><td>saggi Qubit Tecnologie</td><td>di vita&nbsp;</td><td>Q32850</td><td>Per 100 saggi</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tubo Rotatore&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre multiple Victor X5&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale veloce</td><td>Scienza applicata&nbsp;</td><td></td><td></td>4351405</tr></tbody></table>

systems biology di regolazione metabolica da estrogen receptor signaling nel cancro al seno

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Con l&#39;avvento dei -omica si avvicina la nostra comprensione delle malattie croniche come il cancro e la sindrome metabolica è migliorata. Tuttavia, efficace estrazione di informazioni contenute nei set di dati di grandi dimensioni che si ottengono da microarray di espressione genica, esperimenti di sequenziamento profonde o profili metabolici è essenziale per scoprire e quindi efficacemente indirizzare i regolatori critici del fenotipo delle cellule malate. Estrogen Receptor α (ERα) è uno dei fattori di trascrizione maestro che regolano i programmi genetici che sono importanti per i tumori al seno estrogeno sensibili. Al fine di comprendere il ruolo di ERα segnalazione in seno metabolismo del cancro abbiamo utilizzato i dati trascrittomica, cistromic e metabolomica da MCF-7 cellule trattate con estradiolo. In questa relazione abbiamo descritto la generazione di campioni per l&#39;RNA-Seq, Chip-Seq e gli esperimenti di metabolomica e l&#39;analisi computazionale integrativa dei dati ottenuti. Questo approccio è utile nel delineare romanzo talpameccanismi colari e circuiti gene regolatore che sono regolati da un particolare fattore di trascrizione che impatti il ​​metabolismo delle cellule normali o malati.

trascrittomica Per analizzare i geni espressi in modo differenziale di trattamento E2, abbiamo scelto di eseguire un esperimento di RNA-Seq. Oltre a fornire informazioni sui livelli di mRNA, sequenze di Rna-Seq possono anche essere utilizzati per monitorare i cambiamenti (RNA lunghi non codificanti, microRNA) non codificanti RNA e gli eventi di splicing alternativo. Noi non forniamo informazioni sull&#39;analisi dei geni non codificanti RNA o, in alternativa trascritte, in quanto ...

L'integrazione dei dati provenienti da esperimenti di sequenziamento dell'intero genoma ed esperimenti di metabolomica è una sfida. In questo articolo riportiamo, per la prima volta, la generazione, l'analisi e l'integrazione di dati di trascrittoma, cistroma e metaboloma da cellule di cancro al seno trattate con estradiolo.

Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è comprendere la regolazione metabolica diretta dell'ER Alpha nel cancro al seno, utilizzando dati trascrittomici, sistromici e metabolomici a livello genomico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dei recettori nucleari e della biologia del cancro, come il ruolo di determinati fattori di trascrizione nella regolazione del metabolismo per contribuire all'aggressività cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una visione globale delle sfumature della regolazione genica e metabolica risultante.La procedura sarà dimostrata da Yiru Chen, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Dopo aver coltivato le cellule MCF7 secondo il protocollo descritto nel testo, raccogliere le cellule aggiungendo un millilitro di reagente per l'isolamento dell'RNA in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Utilizzare una pipetta per raccogliere il lisato cellulare e trasferirlo in provette da 1,5 millilitri.Per isolare l'RNA, aggiungere 200 microlitri di cloroformio a un millilitro di lisato cellulare e vortexare per 10 secondi. Dopo un'incubazione a temperatura ambiente per cinque minuti, centrifugare i campioni a 16.000 x g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Al termine della centrifugazione, trasferire con attenzione la fase acquosa superiore in un nuovo tubo.Aggiungere 500 microlitri di isopropanolo al 100% alla fase acquosa e mescolare per inversione. Successivamente, incubare a meno 20 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, centrifugare i campioni a 1600 x g e 4 gradi Celsius per 10 minuti.Eliminare il soprannatante e aggiungere 750 microlitri di etanolo al 70% privo di RNasi; vortexare brevemente. Centrifugare i campioni a 6.000 x g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il soprannatante e centrifugare i campioni a 16.000 x g e a quattro gradi Celsius per un minuto.Utilizzando una punta per carica gel, rimuovere l'etanolo residuo mediante pipettaggio. Capovolgere le provette e lasciarle asciugare all'aria per 10 minuti. Successivamente, aggiungere da 20 a 50 microlitri di acqua DEPC per sciogliere il pellet, quindi purificare e quantificare l'RNA seguendo il protocollo descritto nel testo.Dopo aver coltivato le cellule MCF7 secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 250 microlitri di formaldeide al 16% in cinque millilitri di mezzo alle cellule per effettuare il cross-linking della cromatina e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, utilizzare cinque millilitri di soluzione 1X fredda per lavare le cellule e arrestare la reazione di cross-linking. Raccogliere le cellule in 250 microlitri di buffer per la lisi cellulare per piastra.Successivamente, per frammentare la cromatina alle dimensioni richieste, sottoporre le cellule a otto cicli di sonificazione della durata di 30 secondi ciascuno con un'ampiezza del 30. Raffreddare ogni campione sul ghiaccio dopo ogni sonificazione di 30 secondi. Successivamente, dopo aver centrifugato i campioni a 16.000 x g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti, prelevare con attenzione il sopranatante mediante pipetta, senza disturbare il pellet presente sul fondo.Applicare un'aliquote di cinque microlitri del sopranatante su un gel di agarosio all'1% ed eseguire l'elettroforesi per determinare la dimensione del DNA. La lunghezza ideale del frammento deve essere compresa tra 200 e 500 paia di basi. Per eseguire l'immunoprecipitazione della cromatina, conservare 25 microlitri del lisato cellulare come campione di input.Quindi, in un tubo da 50 millilitri, mescolare quattro millilitri del lisato cellulare con 20 millilitri di buffer IP, l'anticorpo ER Alpha e le perle magnetiche codificate con proteina A e proteina G. Incubare la miscela in rotazione a quattro gradi Celsius durante la notte, per consentire la formazione di complessi cromatina-anticorpo. Dopo aver lavato le perle con i buffer di lavaggio, secondo il protocollo indicato nel testo, aggiungere 500 microlitri di buffer di eluizione alle perle ed eluire il DNA in quattro tubi.Per i campioni di input di DNA, eluire in 125 microlitri di tampone di eluizione. Successivamente, posizionare le provette in un blocco riscaldante e coprirle con della pellicola di alluminio, ponendo un peso in cima per impedire che si aprano. Incubare le provette a 65 gradi Celsius per tutta la notte.Per isolare il DNA dai campioni di pulldown utilizzando un kit di isolamento del DNA per ChIP, raffreddare le provette a temperatura ambiente per cinque minuti. Nel frattempo, riscaldare il buffer di eluizione a 65 gradi Celsius. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame a ciascuna provetta.Se si forma un precipitato, aggiungere altri 250 microlitri di buffer di legame fino a quando la soluzione non diventa limpida. Caricare il campione sulla colonna e centrifugare a 16.000 x g per 30 secondi. Quindi utilizzare 250 microlitri di buffer di lavaggio per lavare la colonna due volte.Eluire il DNA con 15 microlitri di tampone di eluizione. Unire il DNA proveniente dalle quattro provette dello stesso pulldown per ottenere un volume totale di 55 microlitri di DNA. Misurare la concentrazione del DNA ed eseguire la QPCR seguendo il protocollo indicato nel testo.Utilizzando cellule MCF7 coltivate secondo il protocollo descritto, aggiungere cinque millilitri di PBS 1X freddo alla piastra. Inclinare quindi la piastra diverse volte prima di rimuovere il PBS. Ripetere altre due volte, rimuovendo la maggior quantità possibile di PBS dopo l'ultimo lavaggio.Aggiungere 750 microlitri di acetone preraffreddata a ogni piastra e raschiare le cellule. Successivamente, combinare le cellule di due piastre in un tubo da due millilitri posto sul ghiaccio. Per contare le cellule a fini di normalizzazione, utilizzare due piastre aggiuntive per la quantificazione cellulare per ogni trattamento.Quindi, per staccare le cellule dalle piastre, aggiungere due millilitri di tampone HE e incubare per cinque minuti. Mescolare accuratamente le cellule mediante pipettaggio nel tampone HE. Successivamente, utilizzare 20 microlitri della soluzione cellulare in un emocitometro per contare il numero di cellule al microscopio.Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius prima di utilizzare l'analisi mediante cromatografia gassosa-spettrometria di massa per identificare e quantificare i metaboliti. Eseguire l'analisi integrativa secondo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra l'integrità e la qualità complessiva dei campioni di RNA purificati per un esperimento di RNA-Seq.L'analisi mostra che tutti i campioni presentano bande nitide e ben definite di rRNA 18S e 28S, indicando l'integrità e la purezza dei campioni. Un numero di integrità dell'RNA (RIN) pari a 10 indica RNA integro. Un valore di sei rappresenta un RNA parzialmente degradato, mentre un tre indica un campione fortemente degradato.In questi esperimenti, tutti i campioni di RNA hanno ottenuto valori RIN compresi tra 9,6 e 9,9. L'esecuzione del sequenziamento ultra ad alta capacità ha prodotto circa 18 milioni di letture di sequenziamento di alta qualità per campione. Qui viene mostrato un rapporto rappresentativo di controllo qualità rapido (fast QC), che analizza la qualità complessiva dei dati grezzi.Per ogni lettura, il punteggio di qualità era compreso tra 32 e 34 per le prime cinque coppie di basi e tra 36 e 38 da sei a 100 coppie di basi. Tra le 17.990.863 letture generate da questo campione, la maggior parte presentava un punteggio di qualità superiore a 34. Questa figura mostra una panoramica di circa 100 metaboliti rappresentati da picchi che indicano variazioni nelle cellule MCF7 a seguito del trattamento con estradiolo.I 10 metaboliti principali con variazioni significative in seguito al trattamento con E2 sono presentati in questa tabella. Questa tabella elenca i percorsi metabolici che sono stati regolati positivamente e negativamente a seguito del trattamento con E2. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione alla salute delle cellule e alla qualità dei campioni che verranno analizzati. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come il sequenziamento dell'esoma o il GRO-Seq, che si basano sui dati di sequenziamento, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come l'identità di ulteriori mRNA, mRNA degli enhancer o RNA non codificanti lunghi la cui trascrizione è indotta da trattamenti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei recettori nucleari per esplorare la regolazione metabolica mediata dai recettori nucleari in sistemi di colture cellulari o nei topi.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare e integrare dati provenienti da diverse approcci Omics. Non dimenticare che lavorare con Trizol, formaldeide e metanolo può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale, ad esempio guanti e camici da laboratorio, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video descrive una tecnica di preparazione di campioni di cellule di cancro al seno per la profilazione dei metaboliti. Le cellule del cancro al seno sono trattate con estradiolo, che si lega al recettore degli estrogeni alfa e provoca un cambiamento nella composizione del metabolita.

Preparazione dei campioni per la metabolomica: un metodo per preparare campioni cellulari per la profilazione dei metaboliti

Questo video descrive un test reporter basato su cellule per determinare l'attività estrogenica di composti di origine vegetale. Un composto con attività estrogeno-simile imita il suo legame con i recettori degli estrogeni e guida a valle la trascrizione genica dell'enzima reporter. L'enzima reporter genera bioluminescenza in una reazione, indicando l'attività estrogenica del composto.

Saggio dell'attività del recettore degli estrogeni-reporter per lo screening dell'attività estrogenica dei fitoestrogeni

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l'architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

Clinicamente, carenza di estrogeni nelle donne in menopausa può aggravare l'incidenza di perturbazione dei lipidi e aterosclerosi. Abbiamo stabilito un modello di carenza di estrogeni in vivo mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale nei topi apoe-/-. Il modello murino è applicabile per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.

Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa

Abbiamo ottimizzato un recettore degli estrogeni disponibile in commercio β reporter per lo screening di alimenti primati umani e non umani per l'attività estrogenica. Abbiamo convalidato questo saggio mostrando che la soia alimentare umana estrogenica nota si registra in alto, mentre altri alimenti non mostrano alcuna attività.

Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema microfisiologico in vitro per lo studio del cancro al seno utilizzando il tessuto mammario umano primario con materiali di prima qualità.

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Il presente protocollo descrive una strategia completa per valutare l'azione farmacologica e il meccanismo del salidroside nell'inibire la proliferazione e la migrazione delle cellule MCF-7.

Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7

Nella patogenesi di metastasi ossea, l'angiogenesi è un processo fondamentale e rappresenta quindi un bersaglio per l'imaging e la terapia. Qui vi presentiamo un modello di ratto del site-specific metastasi ossee cancro al seno e strategie per descrivere in modo non invasivo l'angiogenesi...

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

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Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Scopri la regolazione metabolica del recettore degli estrogeni nel cancro al seno usando dati multi-omici. Questo metodo integra trascrittoma, cistroma e metaboloma per analizzare le vie metaboliche nelle cellule MCF7.

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