Name: In Vivo alcalina Comet Assay e lenzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri l'assay cometa alcalino in vivo e la versione enzimatica modificata per misurare rotture del DNA e danno ossidativo nel fegato di ratto. Questo metodo sensibile e versatile è utile per valutazioni di sicurezza e ricerca sul cancro.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Prendiamo atto della pubblicazione originale dello studio CPA di Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Analisi dose-risposta sesso-specifica della genotossicità nei ratti F344 trattati con ciproterone acetato. Ricerca sulle mutazioni 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Etica dichiarazione: Le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la FDA degli Stati Uniti / Centro Nazionale per la ricerca tossicologica. NOTA: Il disegno dello studio qui descritto si basa sul protocollo sviluppato dal Centro giapponese per la convalida dei metodi alternativi (JACVAM) per la loro validazione del test in vivo roditore alcalina cometa 18, e ulteriormente modificata in base alle raccomandazioni in linea guida OECD TG489 19 . 1. Preparazione <ol><li> preparazione del vetrino <ol><li> Sciogliere regolare agarosio fusione a 1% (w / v) in tampone fosfato (Ca 2+, Mg 2+ libero e rosso fenolo libero) mediante riscaldamento in un forno a microonde. </li><li> Posizionare il 1% soluzione di agarosio standard di fuso a bagnomaria C 55 ° ed equilibrare la temperatura con il bagno. microscopio in vetro tuffo scivola nella soluzione di agarosio, defluire eventuali excess agarosio e pulire la parte posteriore dei vetrini puliti. Porre i vetrini in posizione verticale su una superficie piana e consentire le diapositive ad asciugare a temperatura ambiente; memorizzare le diapositive in luogo asciutto. </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni Comet assay <ol><li> Preparare 0,5% soluzione di agarosio a basso punto di fusione. Sciogliere bassofondente agarosio in tampone fosfato (Ca 2+, Mg 2+, e rosso fenolo libero) mediante riscaldamento in un forno a microonde. Mantenere la soluzione a 37-45 ° C durante la preparazione del vetrino cometa; scartare qualsiasi soluzione di agarosio rimanente dopo. </li><li> Preparare Lysis buffer. Fare una soluzione 100 mM di disodio acido etilendiamminotetraacetico (EDTA disodico, il sig 372,24 g / mol), 2,5 M di cloruro di sodio (NaCl, il sig 58.44 g / mol), e 10 mm Tris idrossimetil aminomethane (Tris Base, il sig 121.14 g / mol) in acqua purificata, e regolare a pH 10 con 10 N soluzione di idrossido di sodio (NaOH, Mr 40 g / mol). Il giorno di utilizzo, aggiungere Triton X100 e dimetil solfossido (DMSO, Mr 78.13 g / mol) alla soluzione per realizzare concentrat finaleioni di 1% e 10%, rispettivamente, e mescolare a 4-10 ° C per almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Fare tampone enzima fresco il giorno di utilizzo. Preparare una soluzione contenente 40 mM 2- [4- (2-idrossietil) piperazin-1-il] etansolfonico acido (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM di cloruro di potassio (KCl, Mr 74.55 g / mol), 0,5 mM disodio EDTA e 0,2% di siero albumina bovina (BSA, Mr 66.463 g / mol) in acqua purificata. Regolare il pH a 8.0 con 10 soluzione N idrossido di potassio (KOH, 56,1 g / mol). Mescolare a RT e verifica completa dissoluzione prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione tampone alcalina contenente 300 mM NaOH e 1 mM EDTA bisodico in acqua purificata. Mescolare a 4-10 ° C per almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. Misurare il pH della soluzione prima dell&#39;uso e assicurarsi che il pH è&gt; 13. </li><li> Preparare una soluzione di 0,4 M Tris base in acqua purificata, e regolare a pH 7,5 con acido cloridrico (HCl, il sig 36.46). Conservare la soluzione a 4-10 ° C. Questa è la neutralizzazione del buffer. </li><li> Fare fResh tritare tampone il giorno di utilizzo. Preparare una soluzione contenente 20 mM di disodio EDTA e il 10% di DMSO in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, e rosso fenolo libero). Conservare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per preparare soluzione colorante, diluire fluorescente acido soluzione macchia magazzino nucleico con Tris-borato-EDTA (TBE buffer) a 1: 10.000 (v / v). Proteggere la soluzione dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Conservare a 2-8 ° C e utilizzare con 24 hr. </li></ol></li></ol> 2. preparazione di sospensioni singola cellula da fegato di ratto <ol><li> Euthanize ratti con gas CO 2 seguenti metodi consigliati nelle linee guida mediche americana veterinari per l&#39;eutanasia degli animali: Edizione 20 del 2013. <ol><li> Impostare la velocità di flusso di CO 2 a 2.75. Mettere il topo nella camera di eutanasia (per esempio, vaso essiccatore, gabbia ratto con coperchio ventilato) e accendere la CO 2 aprendo la valvola del serbatoio. Attendere 1,5 a 2,5 minuti fino a quando latopo diventa incosciente. Aumentare il flusso di CO 2 sul valore massimo. Dopo la cessazione della respirazione, lasciare il topo nella camera per circa 1 min per assicurare eutanasia. Verificare l&#39;eutanasia palpando per confermare che il topo non ha battito cardiaco, e pizzicare le dita dei piedi per determinare che il topo non ritira la sua arto. </li></ol></li><li> Disinfettare la capelli-pelle con il 70% di etanolo. Aprire la cavità addominale e rimuovere il fegato intatto con forbici chirurgiche. Dopo aver rimosso il fegato, rimuovere il lobo laterale sinistra dal fegato rimanendo con forbici chirurgiche. Posizionare il lobo laterale sinistro su un tagliere e tagliare due 3-4 mm di spessore sezioni trasversali adiacenti con una lama usa e getta singolo taglio di rasoio. </li><li> Inserire una sezione trasversale su carta da filtro (per evitare la deformazione della sezione), e posizionare la sezione in formalina 10% neutra tamponata (NBF). Assicurarsi che il rapporto del 10% NBF al tessuto è di 10: 1 o superiore. Dopo un tempo di fissazione di almeno 72 ore, procESS fegato per istopatologia (vedi sezione 7, di seguito). </li><li> Posizionare la seconda sezione trasversale di fegato in 5 ml ghiacciata buffer di macinazione (sezione 1.2.6) in una capsula di Petri 6 centimetri e risciacquare 3 volte per rimuovere residui di sangue. </li><li> Trasferire la sezione di fegato di un nuovo 2 ml provetta da centrifuga contenente 1 ml di tampone macinazione ghiacciata. Macinare sezione fegato ben risciacquato, con un paio di forbici sottili per liberare le cellule. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron per rimuovere eventuali grumi di tessuto. </li><li> Posizionare la sospensione singola cella in ghiaccio e utilizzare per rendere le diapositive entro 1 ora. Controllare la concentrazione di cellule contando (ad esempio, con un emocitometro o contatore di cellule elettronico) per assicurare che la sua concentrazione di circa 2 x10 6 cellule / ml. </li></ol> 3. Preparazione del Comet diapositive <ol><li> Mescolare un volume della sospensione cellulare singola con 10 volumi di fuso, 37 ° C, la soluzione di agarosio bassofondente 0,5% (sezione 1.2.1).pipetta Immediatamente 100 microlitri su un vetrino rivestito con regolare agarosio punto di fusione (punto 1.1). Porre immediatamente un vetrino sopra il composto di cellule-agarosio. Fare almeno 8 scivoli per ogni campione. NOTA: Tutte le diapositive devono essere identificati da un codice numerico o simili e la loro identità registrati, in modo che le diapositive possono essere segnati in cieco (vedi 6.2.2, di seguito). </li><li> Posare le diapositive piatta e fredda a 4 ° C per 30 min. </li><li> Dopo che il gel si è solidificato, rimuovere delicatamente il coprioggetto e immergere i vetrini in tampone di lisi pre-raffreddata (punto 1.2.2). Proteggere le diapositive dalla luce e mantenere le diapositive nel tampone di lisi a 4 ° C da 1 ora (minimo) a O / N (massimo). </li></ol> 4. trattamento enzimatico di Comet diapositive <ol><li> Rimuovere 6 degli 8 vetrini preparati da ciascun campione di tessuto dal tampone di lisi e risciacquarli 3x per 5 minuti ciascuno con tampone di enzima (punto 1.2.3) a temperatura ambiente. Utilizzare i rimanenti due scivoli per il test della cometa alcalino wenza enzima-trattamento (v 5.1, qui di seguito). Dopo il risciacquo, rimuovere il liquido in eccesso drenando e tamponando le diapositive con i tessuti. </li><li> Diluire scorte enzimi hOGG1 e Endo III con tampone enzimatica a 1: 1.000 (v / v). Mettere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Applicare 200 ml di seguenti soluzioni ai vetrini preparati da ciascun gruppo di trattamento: 200 ml di tampone enzima da solo (2 scivoli usati come diapositive di riferimento), 200 soluzione ul hOGG1 (2 scivoli) o 200 ml soluzione Endo III (2 scivoli). </li><li> Mettere i vetrini in piastre di Petri piene di asciugamani di carta inumidite, coprire i vetrini con Parafilm e incubare a 37 ° C per 45 minuti per Endo III-trattata e diapositive di riferimento e di 30 minuti per diapositive hOGG1-trattati. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare i vetrini con acqua distillata e proseguire l&#39;elaborazione come descritto in 5.2, di seguito. </li></ol> 5. svolgimento e elettroforesi <ol><li> Per diapositive non trattati con enzimi, rimuovere i vetrini dal tampone di lisi, Scolate le diapositive e risciacquare una volta con tampone di neutralizzazione fredda (sezione 1.2.5) per 5 minuti per rimuovere il detersivo residuo e sali. </li><li> Collocare i vetrini da Piazza di 4.5 e 5.1 in modo casuale in un serbatoio di elettroforesi su gel orizzontale, evitando eventuali spazi. Riempire il serbatoio con pH&gt; 13 buffer per elettroforesi appena fatto (punto 1.2.4) fino a quando il livello del liquido copre solo gli scivoli (evitare bolle sopra l&#39;agarosio e assicurarsi che il serbatoio è di livello). Registrare il pH tampone e temperatura all&#39;inizio di svolgimento DNA. </li><li> Che i vetrini rimangono nel buffer alcalina per 20 minuti per consentire lo svolgimento del DNA ed espressione di danni alcalino-responsabile. </li><li> Durante lo svolgimento, il programma di alimentazione per produrre 0,7 V / cm nel serbatoio elettroforesi (V / cm = Volt diviso per la distanza in cm tra gli elettrodi positivi e negativi). </li><li> Dopo lo svolgimento, premere il pulsante di esecuzione sulla rete di alimentazione. Se necessario, regolare la corrente a 300 mA alzando o abbassando il livello del buffer. mantenere °livello di buffer e appena sopra la superficie delle diapositive. Eseguire elettroforesi a 4 ° C per 20 min. Registrare il posizionamento scorrevole, la temperatura del tampone e la corrente (ampere) all&#39;inizio e alla fine di elettroforesi. NOTA: Troppo tampone provocherà tensioni inferiori che possono interferire con la migrazione DNA. </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, neutralizzare l&#39;alcali in eccesso sollevando delicatamente i vetrini dalla vaschetta e immergendo in tampone di neutralizzazione (sezione 1.2.5) per 5 min. Scolate le diapositive e ripetere altre due volte. </li><li> Fissare i vetrini immergendoli in acqua fredda 100% di etanolo per 5 min. Lasciare i vetrini si asciughino all&#39;aria e posto in un luogo asciutto per la conservazione. </li></ol> 6. DNA di colorazione, Comet visualizzazione e analisi <ol><li> colorazione del DNA <ol><li> Porre i vetrini su un vassoio di cartone o di metallo e aggiungere 200 ml di soluzione colorante fluorescente di lavoro degli acidi nucleici (sezione 1.2.7) per ogni diapositiva e coprire con un vetrino di vetro. Proteggere le diapositive dallaluce consentire i vetrini di rimanere in contatto con la soluzione colorante per almeno 30 minuti prima competenza. Stain i vetrini in lotti di 20 alla volta. </li><li> Prima di leggere ogni diapositiva, delicatamente macchia lontano soluzione colorante in eccesso, facendo attenzione a non disturbare il vetro di copertura. </li></ol></li><li> Visualizzazione Comet e punteggio <ol><li> Utilizzare una videocamera collegata ad un microscopio a fluorescenza per visualizzare le immagini in diretta della diapositiva cometa sul monitor del computer. </li><li> Casualmente scegliere un microscopio a campo contenente cellule. Utilizzando un mouse, selezionare una cella. Fare clic sul centro della &quot;testa della cometa&quot; con click sinistro del mouse. NOTA: Il software calcola tutti i parametri di misura per la cella e aggiunge i dati in un file di dati. </li><li> Punteggio tutte le cellule nel campo corrente (vedere il punto 6.2.4), e quindi utilizzare i controlli di scena del microscopio e il video sullo schermo per trovare un altro gruppo di cellule. Punteggio queste cellule come descritto al punto 6.2.2. </li><li> Nota la slitta From destra a sinistra e in basso a alto. Scegliere circa 10 campi in modo casuale. Durante questo processo, qualsiasi cella cometa adatto che compare nel campo Vista risposta deve essere senza pregiudizi. NOTA: non segna una cometa se una delle seguenti condizioni: 1) che si trova su uno dei bordi della slitta; 2) due o più comete si sovrappongono; 3) c&#39;è detriti nella coda; 4) il software non può distinguere tra la testa e la coda; o 5) la colorazione del nucleo e / o di coda differisce notevolmente da altre comete nella diapositiva. NOTA: Le comete con quasi tutta la loro fluorescenza del DNA nella coda sono spesso indicati come le comete &#39;riccio&#39;. comete Hedgehog non devono essere lanciati, ma il numero di ricci rilevati durante le marcature di scorrimento devono essere registrati e riportati come percentuale di comete totali. </li><li> Analizzare almeno 75 comete per vetrino, la lettura di due scivoli per organo / tessuto per ottenere almeno 150 cellule / cometa campione in totale. Dopo il numero di cellule richiesto da una diapositiva hanno essereit ha segnato, il risultato viene salvato come file di foglio di calcolo per l&#39;analisi dei dati in seguito. </li></ol></li></ol> 7. Analisi istopatologia <ol><li> Dopo un minimo di fissaggio 72 hr a 10% NBF, seguita da tessuto rifilatura 21, ordinariamente elaborare e incorporare il lobo epatico laterale sinistro dei campioni in paraffina basata media 22. Sezione campioni a circa 5 micron e raccogliere su vetrini. </li><li> Macchiare le sezioni con ematossilina e eosina (H &amp; E): <ol><li> Riscaldare i vetrini con le sezioni di tessuto di paraffina in forno a 60 ° per 2 ore prima della procedura di colorazione. </li><li> Utilizzare xilene a Deparaffinare lati. Reidratare i vetrini con etanolo graduato (EtOH) per una esecuzione risciacquo con acqua di rubinetto. </li><li> Porre i vetrini in 450 ml di ematossilina per 2 min e 40 sec. Sciacquare i vetrini con acido (acido acetico glaciale 2 ml a 450 ml di acqua deionizzata) per 4 sec seguito da 5 minuti eseguendo risciacquo con acqua di rubinetto. </li><li> Posizionare il fatto scorrerees in 450 ml 70% EtOH contenente 1 ml di idrossido di ammonio per 2 minuti, seguita da risciacquo correndo acqua corrente per 2 min e 30 sec, e il 70% EtOH risciacquo per 1 min. </li><li> Incubare i vetrini con 450 ml di soluzione eosina Y contenente acido acetico glaciale 4 ml per 3 min. </li><li> Disidratare i vetrini con classificato EtOH. Cancellare i vetrini con xilene (tre volte 1 min ciascuna), e tenere le diapositive in xilene fino vetrini sono collocati sugli scivoli. </li></ol></li><li> Esaminare i vetrini al microscopio ottico, i risultati record, e grado lesioni non neoplastiche per la gravità come 1 (minimo), 2 (lieve), 3 (moderato) o 4 (marcato). NOTA: Il grado di gravità applicata per una lesione specifica si basa sulla proporzione relativa del fegato con la lesione (= minimal &lt;1-15%; lieve = 16-35%; moderato = 36-60%, e ha segnato = 61- 100%). </li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> L&#39;animale è considerato l&#39;unità sperimentale per valutazioni statistiche. danno al DNA è espressa in% DNUn in coda. </li><li> danno ossidativo al DNA è calcolato come segue: le diapositive di riferimento (senza trattamento enzimatico) forniscono una stima delle rotture dei filamenti di DNA di sfondo (SB). NOTA: Le diapositive enzimi trattati forniscono una misura di rotture dei filamenti e basi ossidate (SB + OX). Assumendo una dose-risposta lineare per% DNA in coda in funzione del danno al DNA, sottrazione di SB da SB + OX fornisce una stima di rotture del DNA da pirimidine / purine alterati ossidati 23. </li><li> Analizzare% DNA in coda come funzione della dose da ANOVA, seguita da test di Dunnett per confronti a coppie delle risposte in animali trattati al controllo del veicolo. NOTA: Tutte le prove sono a una coda e un valore p inferiore a 0,05 è impostato come criterio di significatività statistica. </li></ol>

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<li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li>
<li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases%3A+characteristics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha interessi in competizione o in conflitto. Le informazioni contenute in questi materiali non costituiscono una diffusione formale di informazioni da parte della FDA e non rappresentano la posizione o la politica dell'agenzia.

Questo protocollo descrive la misurazione simultanea di entrambi danno al DNA diretti e ossidativo nel fegato di ratto a livello di singola cellula. Il protocollo generale è applicabile a qualsiasi tessuto da cui singole cellule o nuclei possono essere isolati con il minimo danno al DNA trasformazione indotta (cioè, danno al DNA indotto non dal agente di test, ma dalla manipolazione e la lavorazione dei tessuti animali). Nella nostra ricerca, abbiamo condotto test della cometa alcaline su cellule dal midollo os...

Il test della cometa misura rotture del DNA a livello di singola cellula. Sospensioni di cellule singole sono incorporati in agarosio su un vetrino da microscopio e le cellule lisate per formare nucleoidi, che contengono loop supercoiled di DNA. Elettroforesi a pH&gt; 13 risultati in perdita di superavvolgimento nei cicli di DNA contenenti rotture dei filamenti, con i filamenti di DNA liberati migrano verso l&#39;anodo, la creazione di strutture cometa simili che possono essere osservati al microscopio a fluorescenza. DNA frammentato migra dalla &quot;testa&quot; della cometa nella &quot;coda&quot; in base alle dimensioni del frammento, e la relativa fluorescenza della coda della cometa rispetto all&#39;intensità totale (testa e coda) può essere utilizzato per quantificare DNA rotture 1 , 2. Il test è semplice, sensibile, versatile, rapida e relativamente poco costoso 1. La rilevazione del DNA frammentato causate da agenti che danneggiano il DNA viene utilizzato un test per quantificare il danno al DNA nelle cellule o nuclei isolati da INDIVIdoppi tessuti degli animali trattati con materiale potenzialmente genotossico (s). Grazie ai suoi vantaggi, il test della cometa in vivo è raccomandato come una seconda vivo test in genotossicità (in coppia con il test del micronucleo in vivo) per effettuare valutazioni di sicurezza dei prodotti in corrente Conferenza internazionale sull&#39;armonizzazione (ICH) 3 e dell&#39;Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA ) 4 linee guida di legge. Nel nostro laboratorio, abbiamo impiegato il test di valutazione dei danni al DNA vivo indotto da ingredienti alimentari, prodotti farmaceutici e nanomateriali 5-10. fegato di ratto sarà utilizzato come esempio in questo protocollo, ma il comet assay può essere eseguita con altri tessuti / organi di animali da esperimento, purché singole cellule intatte possono essere isolate dal tessuto. Alcuni tipi di danni al DNA sono difficili da rilevare come rotture del DNA senza modificare il test della cometa di base. In caso di danno ossidativo al DNA, sezione Breaks possono essere creati in lesioni ossidative nel DNA da digerire con gli enzimi di riparazione, come umano 8-oxoguanine-DNA-N-glicosilasi 1 (hOGG1, che crea pause a 8-oxoguanine (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. Inoltre, endonucleasi III (Endo III) crea pause principalmente alle pirimidine ossidate 1. Così, l&#39;aggiunta di una fase enzima digestione rende il test un metodo specifico e sensibile per misurare il danno ossidativo del DNA in vivo 12. Utilizzando questi saggi, abbiamo dimostrato danno ossidativo causata da agenti tossici nel fegato di ratti e topi 6-8 e nel cuore di ratto 10. Il test della cometa ha molte applicazioni in tossicologia genetica e il biomonitoraggio umano: 1) come un follow-up di test in vivo per genotossine individuate dal sensibile test in vitro 3,13, 2) per valutare i meccanismi di danno al DNA xenobiotici indotto in diversi tessuti 14, 3) per verificare se unacancerogeno funziona utilizzando un una modalità non-genotossico di azione (MOA) 7 genotossico o, 4) per valutare il DNA riparazione dei danni 15, 5) per studiare le malattie umane e esposizioni professionali 16, e 6) come un potenziale test di screening high-throughput per organo-specifica genotossicità 17.

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti (n. 1, 24 x 50 mm)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodico</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) (Ca2+, Mg2+ libero)</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione ( LMP)</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG Agarosio</td></tr><tr><td>a Fusione Normale (NMA)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Strisce di carta per il test del pH (pH 7,5-14)</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>etichette per vetrini (0,94 x 0,5 pollici)</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&commercio; Oro&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 2,0 ml</td><td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (40 & micro; m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasi III (Nth)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0241S</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr></tbody></table>

in vivo alcalina comet assay e l&#39;enzima modificato alcalina comet assay per la misurazione rotture del dna strand e danno ossidativo del dna in fegato di ratto

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Il danno al DNA non riparato può portare a instabilità genetica, che a sua volta può migliorare lo sviluppo del cancro. Pertanto, l'identificazione di potenziali agenti dannosi per il DNA è importante per proteggere la salute pubblica. Il saggio della cometa alcalina in vivo, che rileva il danno al DNA quando si rompe il filamento, è particolarmente rilevante per valutare i rischi genotossici degli xenobiotici, poiché le sue risposte riflettono l'assorbimento, la distribuzione tissutale, il metabolismo e l'escrezione (ADME) in vivo delle sostanze chimiche, nonché il processo di riparazione del DNA. Rispetto ad altri saggi di danno al DNA in vivo, il test è rapido, sensibile, visivo e poco costoso e, convertendo il danno ossidativo al DNA in rotture di filamento utilizzando specifici enzimi di riparazione, il test può misurare il danno ossidativo al DNA in modo efficiente e relativamente privo di artefatti. La misurazione del danno al DNA con il test della cometa può essere eseguita utilizzando disegni di studio di tossicologia sia acuta che subcronica e, integrando il test della cometa con altre valutazioni tossicologiche, il test soddisfa i requisiti di benessere degli animali facendo il massimo uso delle risorse animali. Un altro grande vantaggio dei saggi è che richiedono solo una piccola quantità di cellule e le cellule non devono essere derivate da popolazioni cellulari proliferanti. I saggi possono anche essere eseguiti con una varietà di campioni umani ottenuti da individui clinicamente o professionalmente esposti.

Il test della cometa in vivo è stata eseguita in concomitanza con il saggio comet enzima modificato per misurare sia diretta e danno ossidativo del DNA nel fegato di ratti trattati con ciproterone acetato (CPA) 5. CPA è un farmaco ormonale sintetica che induce i tumori di fegato di ratto in maniera specifica per il sesso, con cinque volte dosi più elevate necessarie per indurre tumori al fegato nei ratti maschi rispetto alle femmine 24. Abbiamo trovato che ...

Il test della cometa alcalina misura le rotture del filamento di DNA nelle cellule eucariotiche. Aggiungendo una fase di digestione dell'endonucleasi III o dell'8-ossoguanina-DNA-N-glicosilasi umana, il test è in grado di rilevare in modo efficiente il danno ossidativo al DNA. Descriviamo i metodi per utilizzare questi saggi per rilevare il danno al DNA nel fegato di ratto.

In Vivo alcalina Comet Assay e l&#39;enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

L'obiettivo generale del saggio della cometa alcalino in vivo e del saggio della cometa alcalino modificato con enzimi è misurare contemporaneamente i danni diretti e ossidativi al DNA a livello di singola cellula. Questo metodo è stato inizialmente proposto come strumento regolatorio per l'analisi della sicurezza di prodotti soggetti a regolamentazione da parte della FDA. Può contribuire a rispondere a domande fondamentali in campi che vanno dalla valutazione della sicurezza regolatoria all'epidemiologia molecolare, fino alla ricerca oncologica di base.Questa tecnica è sensibile e versatile, ed è anche relativamente economica. È in grado di rilevare danni al DNA praticamente in qualsiasi tessuto animale. In generale, si sapeva che questo metodo avrebbe avuto difficoltà a preparare rapidamente sospensioni di singole cellule da diversi tessuti, e ciò può rappresentare una sfida.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché richiede una certa dose di abilità, oltre che di scienza. Dopo aver eutanasizzato i ratti con gas anidride carbonica, secondo il protocollo descritto nel testo, palpare per confermare l'assenza di battito cardiaco e pizzicare le dita dei piedi per verificare che il ratto non ritragga l'arto. Utilizzare etanolo per disinfettare la cute, quindi usare forbici chirurgiche per aprire la cavità addominale, prima di rimuovere il fegato integro.Con delle forbici, separare il lobo laterale sinistro dal resto dell'organo e posizionarlo su un tagliere. Successivamente, utilizzando una lametta monouso a bordo singolo, tagliare due sezioni trasversali adiacenti dello spessore di 3-4 millimetri. Posizionare una sezione trasversale su carta filtrante, quindi in formalina neutra tamponata al 10%, o NBF.Posizionare la seconda sezione di fegato in cinque millilitri di buffer per trinciatura ghiacciato in una piastra di Petri da sei centimetri e risciacquare tre volte per rimuovere il sangue residuo. Successivamente, trasferire la sezione di fegato in un nuovo tubo da centrifuga da due millilitri contenente un millilitro di buffer per trinciatura ghiacciato. Con forbici fini, trinciare la sezione per liberare le cellule, quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per rimuovere eventuali grumi di tessuto.Posizionare la sospensione cellulare monocellulare sul ghiaccio e, utilizzando un emocitometro, verificare che la concentrazione sia di circa due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Per preparare le diapositive per il saggio del cometa, mescolare un volume della sospensione cellulare monocellulare con 10 volumi di soluzione di agarosio a basso punto di fusione allo 0,5% fusa a 37 gradi Celsius. Pipettare immediatamente 100 microlitri su un vetrino precedentemente rivestito con agarosio e coprire il miscuglio di agarosio e cellule con un coprioggetto.Posizionare i vetrini in piano e raffreddare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo che il gel si è solidificato, rimuovere delicatamente le lamelle e immergere i vetrini in un buffer di lisi pre-raffreddato. Incubare al buio a quattro gradi Celsius per un'ora fino a tutta la notte.Dopo l'incubazione, rimuovere sei dei otto vetrini preparati per ciascun campione di tessuto dal buffer di lisi e lavarli tre volte con buffer enzimatico a temperatura ambiente, per cinque minuti ciascuna. Successivamente, asciugare delicatamente i vetrini usando dei tamponi di tessuto per eliminare l'eccesso di soluzione. Poi, diluire i stock enzimatici di hOGG1 e Endo III nel buffer enzimatico, nel rapporto uno a mille, e collocarli sul ghiaccio.Posizionare i vetrini in piastre di Petri foderate con tovaglioli di carta inumiditi, quindi applicare 200 microlitri delle seguenti soluzioni sui vetrini di ciascun gruppo sperimentale. Applicare il solo tampone enzimatico su due vetrini, la soluzione hOGG1 su due vetrini e la soluzione Endo III su due vetrini, quindi coprire i vetrini con Parafilm. Successivamente, posizionare i vetrini a 37 gradi Celsius, incubando i vetrini trattati con Endo III e i vetrini di riferimento per 45 minuti e i vetrini trattati con hOGG1 per 30 minuti.Dopo l'incubazione, svuotare le lamelle e, per le lamelle di riferimento, utilizzare il tampone di neutralizzazione freddo per rimuovere il detergente residuo e i sali. Successivamente, risciacquare le lamelle trattate con enzima utilizzando acqua distillata. Posizionare le lamelle in modo casuale in un serbatoio orizzontale per elettroforesi su gel, evitando spazi vuoti.Quindi aggiungere nel serbatoio il tampone elettroforesi appena preparato, evitando bolle d'aria, fino a ricoprire appena i vetrini. Impostare l'alimentatore a 0,7 volt per centimetro ed incubare i vetrini nel tampone alcalino per 20 minuti, in modo da permettere lo srotolamento del DNA e l'espressione dei danni alcali-labili. Registrare la posizione dei vetrini, la temperatura del tampone e l'intensità di corrente.Dopo l'incubazione per la denaturazione, posizionare il serbatoio dell'elettroforesi a quattro gradi Celsius. Quindi premere il pulsante Esegui sull'alimentatore e, se necessario, regolare la corrente a 300 milliampere aumentando o abbassando il livello del buffer, mantenendolo appena al di sopra dei vetrini. Far correre i campioni per 20 minuti, quindi registrare nuovamente la posizione dei vetrini, la temperatura del buffer e la corrente.Dopo l'elettroforesi, sollevare delicatamente i vetrini dal serbatoio e immergerli in un buffer di neutralizzazione per neutralizzare l'eccesso di alcali. Quindi scolare i vetrini e ripetere la neutralizzazione altre due volte. Fissare i vetrini con etanolo al 100% freddo per cinque minuti.Lasciare asciugare le lamelle all'aria e conservarle in un ambiente asciutto. Per colorare il DNA, posizionare le lamelle su un vassoio di cartone o metallo e aggiungere 200 microlitri di soluzione di lavoro del colorante fluorescente per acidi nucleici su ciascuna lamella, prima di coprire con un coprioggetto. Proteggere le lamelle dalla luce e incubare per almeno 30 minuti.Quindi, per leggere i vetrini, asciugare delicatamente il colorante in eccesso, avendo cura di non disturbare il coprioggetto. Successivamente, posizionare il vetrino con i cometa sul portacampioni di un microscopio a fluorescenza dotato di videocamera e selezionare casualmente un campo contenente cellule. Dopo aver aperto il software per il saggio del cometa, utilizzando il mouse, selezionare una cellula e quindi fare clic con il tasto sinistro sul centro della testa del cometa della cellula.Il software calcolerà i parametri per la cellula e li aggiungerà a un file di dati. Una volta valutate tutte le cellule nel campo corrente, passare a un altro campo e ripetere la valutazione di qualsiasi cellula cometa adatta che appare, senza operare alcuna selezione. Valutare 10 campi scelti casualmente e almeno 75 comete per ogni vetrino.Infine, salvare i dati in un foglio elettronico per un'analisi successiva. Come riportato in precedenza, l'CPA è un farmaco ormonale sintetico che induce tumori epatici nel ratto in maniera specifica per sesso, richiedendo dosaggi cinque volte maggiori per indurre tumori epatici nei ratti maschi rispetto alle femmine. Come mostrato qui, il saggio comet alcalino in vivo e il saggio comet modificato con enzimi hanno dimostrato che era necessaria una dose di CPA cinque volte maggiore per indurre un aumento significativo del danno al DNA nei fegati maschili rispetto a quelli femminili.La idrossisteroid sulfotransferasi, o HST, è espressa a livelli 15 volte superiori nei ratti adulti di sesso femminile rispetto ai maschi adulti. Il metabolismo dell'HST rappresenta una fase limitante nell'attivazione del CPA in metaboliti leganti il DNA. Come mostrato qui, il danno ossidativo al DNA indotto dal CPA è stato generalmente maggiore nel fegato dei ratti maschi rispetto a quello dei ratti femmine, e pertanto risulta meno probabile che sia una fase limitante nella formazione di tumori nei ratti maschi.Come riportato in queste tabelle, la valutazione istopatologica dei fegati di ratti trattati con CPA non ha evidenziato segni di apoptosi o necrosi indotte dall'agente, confermando conclusioni precedenti secondo cui i risultati positivi del saggio del cometa non erano un effetto secondario della citotossicità. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante raccogliere una sospensione cellulare singola e preparare i vetrini per il saggio del cometa il più rapidamente possibile. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della tossicologia genetica per esplorare in modo quantitativo i danni al DNA e la loro riparazione in praticamente qualsiasi tessuto animale e anche in campioni umani.Dopo aver visionato questo video, speriamo che siate in grado di comprendere meglio come utilizzare il test della cometa alcalino in vivo insieme al test della cometa modificato con enzimi, per misurare contemporaneamente i livelli di danno al DNA da alchilazione e da ossidazione, a livello di singola cellula nei tessuti animali. Ricordate che lavorare con reagenti che causano danni al DNA può essere estremamente pericoloso. Indossate sempre dispositivi di protezione individuale quando eseguite queste procedure.

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In questo video, dimostriamo un saggio di elettroforesi alcalina a singola cellula per quantificare le rotture del DNA a singolo e doppio filamento nelle cellule trattate con doxorubicina. Le condizioni alcaline interrompono i legami idrogeno tra le coppie di basi del DNA, con conseguente completo svolgimento e separazione dei filamenti di DNA. Ciò consente la migrazione differenziale di frammenti di DNA integri e danneggiati in gel di agarosio dopo elettroforesi, rivelando una struttura a...

Elettroforesi su gel alcalino a cellula singola: una tecnica sensibile per la stima quantitativa del danno al DNA in singole cellule tumorali dopo la chemioterapia

Il video mostra il test della cometa per rilevare danni al DNA in seguito all'esposizione ad agenti nocivi. In condizioni alcaline, il DNA si srotola e si denatura, e dopo l'elettroforesi, il DNA integro e danneggiato migra in modo diverso nel gel di agarosio, formando una struttura a forma di cometa. Il DNA intatto che migra lentamente forma la testa circolare della cometa, mentre i frammenti di DNA danneggiati che migrano rapidamente formano la coda allungata della cometa.

Saggio della cometa per il rilevamento del danno al DNA nelle cellule

Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell'ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

Comet assay misura rotture del DNA, indotte da fattori diversi. Se tutti i fattori (ad eccezione di stress ossidativo) che causano danni al DNA sono mantenute costanti, la quantità di danni al DNA è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare comet assay per la misura indiretta di stress ossidativo.

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Viene presentato un protocollo per valutare i cambiamenti nei livelli di danno al DNA e nella capacità di riparazione del DNA che possono essere indotti dall'irradiazione cronica in vivo a basse dosi nei linfociti della milza di topo, misurando l'istone fosforilato H2AX, un marcatore di rotture del doppio filamento del DNA, utilizzando la citometria a flusso.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.

Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Qui descriviamo due modifiche del test della fibra di DNA per studiare le lacune del DNA a singolo filamento nella replicazione del DNA dopo l'induzione della lesione. Il test della fibra S1 consente il rilevamento di lacune post-replicative utilizzando l'endonucleasi S1 specifica per ssDNA, mentre il test di riempimento delle lacune consente la visualizzazione e la quantificazione della riparazione del gap.

Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA

Il saggio della cometa è un mezzo popolare per rilevare danni al DNA. Questo studio descrive un approccio per eseguire diapositive in varianti rappresentative del saggio della cometa. Questo approccio ha aumentato significativamente il numero di campioni diminuendo il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni dei vetrini e il rischio di danni ai gel.

Un approccio di analisi delle comete ad alto rendimento per la valutazione del danno al DNA cellulare

Scopri l'assay cometa alcalino in vivo e la versione enzimatica modificata per misurare rotture del DNA e danno ossidativo nel fegato di ratto. Questo metodo sensibile e versatile è utile per valutazioni di sicurezza e ricerca sul cancro.

In Vivo alcalina Comet Assay e lenzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto (Video) | JoVE Journal

In Vivo alcalina Comet Assay e l'enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

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