Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

L'obiettivo generale di queste procedure è isolare rapidamente neutrofili altamente purificati da campioni di sangue umano mediante centrifugazione in gradiente di densità per studiare il loro ruolo nella sensibilità delle cellule di linfoma alla terapia del cancro utilizzando modelli di coltura cellulare a due D e tre D. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave sulle interazioni tra il sistema immunitario innato e il cancro, ad esempio quale ruolo svolgono le risposte delle cellule tumorali mediate dai neutrofili nella terapia del cancro. Il vantaggio principale della separazione in gradiente di densità è la capacità di isolare popolazioni di cellule immunitarie pure in un breve periodo di tempo senza esporre le cellule a stimoli che alterano la funzione.

Per isolare le cellule leucemiche primarie e i neutrofili, iniziare aggiungendo 15 millilitri di sangue trattato con EDTA da campioni di pazienti affetti da leucemia linfatica cronica in provette individuali sterili da 50 millilitri. Diluire il sangue con 15 millilitri di RPMI. Quindi aggiungere con attenzione e lentamente 15 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente sotto il sangue, facendo attenzione a non mescolare gli strati.

Dopo aver separato le celle mediante centrifugazione, saranno visibili quattro fasi distinte. Le piastrine e il plasma nella parte superiore, un anello bianco di cellule mononucleate, la soluzione a gradiente di densità e i granulociti e gli eritrociti nella parte inferiore. Utilizzando una pipetta di plastica per pascoli, trasferire prima l'anello bianco delle cellule leucemiche primarie in una nuova provetta da 50 millilitri.

Lavare le cellule con un massimo di 50 millilitri di PBS con calcio e magnesio. E ri-sospendere il palato in cinque millilitri di PBS fresco. Quindi, aggiungi altri 45 millilitri di PBS alle cellule e fai girare nuovamente le cellule.

Dopo il secondo lavaggio, rimettere in sospensione il palato in completo RPMI medium. E contare il numero di cellule leucemiche primarie vitali. Quindi, rimuovere il plasma piastrinico e gli strati del gradiente di densità e aggiungere 25 millilitri di PBS e 25 millilitri di destrina in cloruro di sodio alla fase eritrocitaria dei granulociti.

Mescolare i tubi dieci volte per inversione. Quindi, lasciare riposare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'equilibrio, trasferire lo strato di neutrofili poveri di globuli rossi superiori in una provetta sterile da 50 millilitri e far girare le cellule.

Risospendere il palato in cinque millilitri di PBS e lisare i globuli rossi con 45 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi. Dopo 15 minuti al buio a temperatura ambiente, centrifugare nuovamente le cellule e lavare il palato in 50 millilitri di PBS. Al termine del lavaggio, risospendere le cellule nel mezzo RPMI completo e contare il numero di neutrofili vitali.

Diluire entrambi i gruppi di cellule a 300.000 cellule per 50 microlitri di concentrazione di RPMI e dividere i campioni tra il numero appropriato di provette fax da cinque millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet in 50 microlitri di PBS integrato con FBS. Per determinare la purezza dei sottogruppi di cellule isolate, etichettare l'aliquant delle cellule leucemiche primarie con l'anticorpo anti CD19 umano coniugato all'APC e l'aliquant dei neutrofili purificati con una miscela di anticorpi anti umani come elencato nella tabella per 30 minuti al buio a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 500 microlitri di PBS integrato con FBS e risospendere i palati in 200 microlitri di PBS FBS fresco. Quindi, analizzare la purezza delle popolazioni cellulari mediante citometria a flusso, avendo cura di compensare il colore dei campioni. Per co-coltivare le cellule leucemiche primarie con i neutrofili dell'autologo, vedere 200.000 cellule per millilitro di cellule leucemiche da sole o con neutrofili autologi in una piastra a 24 pozzetti in terreno RPMI completo.

Mescola accuratamente le cellule. Quindi trattare le cellule con l'inibitore della tirosin-chinasi di Brutton per 24 ore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. Il giorno successivo, raccogli un aliquant delle cellule in un tubo fax di plastica da cinque millilitri.

Quindi, centrifugare le celle e lavare i pellet in un millilitro di FBS PBS. Dopo la seconda centrifugazione, etichettare le cellule aninexina cinque e ioduro di propidio secondo le istruzioni del produttore per dieci minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, analizzare i neutrofili e le cellule leucemiche primarie mediante citometria a flusso utilizzando la strategia di gating illustrata.

Per impostare una co-coltura a tre D, aggiungere 50.000 cellule B di linfoma RL da sole o mescolare con cellule differenziate HL60 in provette sterili da 15 millilitri. Centrifugare i campioni e risospendere i pellet in 300 microlitri di matrice a membrana basamentale, utilizzando una punta per pipetta da un millimetro con l'apertura tagliata a due o tre millimetri. Successivamente, incubare 300 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per 30 minuti a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2.

Al termine dell'incubazione, aggiungere un millilitro di terreno RPMI completo a ciascun pozzetto e rimettere le colture threeD nell'incubatore per altri sette giorni con cambi di terreno ogni due giorni. Il quinto giorno, aggiungi dieci nanomolari di increstina alle colture. Dopo una settimana di coltura, aspirare il terreno e lavare ogni pozzetto due volte con un millilitro di PBS ghiacciato.

Quindi, aggiungere tre millilitri di PBS ghiacciato con EDTA a ciascun pozzetto e raschiare il fondo dei pozzetti con una punta di pipetta da 200 microlitri per staccare i gel. Agitare delicatamente la piastra con ghiaccio per 30 minuti. Quindi, trasferire le sospensioni cellulari in singole provette sterili da 15 millilitri per agitarle delicatamente con ghiaccio per altri 30 minuti.

Confermare l'aspetto di una sospensione cellulare omogenea. Quindi, centrifugare le celle seguite da un lavaggio PBS e risospendere i pellet in PBS fresco con FBS. Infine, etichettare le cellule con gli anticorpi appropriati e i coloranti vitali come appena dimostrato e analizzare le cellule differenziate RL e HL60 mediante citometria a flusso utilizzando la strategia di gating illustrata.

L'analisi di tutti gli eventi delle popolazioni cellulari isolate mediante citometria a flusso dimostra che questo metodo di separazione si traduce in una popolazione di cellule leucemiche primarie altamente pure che esprimono CD19 a picco singolo. E una popolazione di neutrofili puri superiore al 90% positiva per gli antigeni comuni leucocitari CD45 e gli antigeni CD15 e CD16 espressi dai neutrofili maturi. L'andatura sulle cellule leucemiche primarie provenienti da colture di neutrofili dimostra che i neutrofili esercitano un effetto protettivo sulla sopravvivenza cellulare contro l'inibitore della tirosina ibrutinib con un numero significativamente più elevato di cellule leucemiche primarie vitali rispetto alla coltura delle sole cellule leucemiche primarie.

Le cellule HL60 differenziate sono più stabili nelle colture a tre D rispetto ai neutrofili. Dopo l'induzione del loro sviluppo granulocitario, queste cellule sono più piccole delle cellule HL60 indifferenziate ed esprimono livelli più elevati di CD11B e CD38. Le cellule HL60 differenziate mostrano anche nuclei multilobati.

Queste cellule mostrano un effetto protettivo sulle cellule RL con un numero significativamente più elevato di cellule RL vitali in tre cocolture D dopo il trattamento con vincrostina rispetto alle cellule di linfoma trattate con vincrostina coltivate da sole. Una volta padroneggiato, il metodo di centrifugazione in gradiente di densità può essere completato in 90 minuti. Dopo il loro sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare l'impatto di vari globuli bianchi sulla malignità del tumore in modelli preclinici e campioni di pazienti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare in modo rapido e affidabile le cellule mononucleate e i neutrofili, analizzare l'effetto dei neutrofili sulla mediazione delle risposte delle cellule tumorali agli agenti antitumorali e impostare una coltura a tre D.