Name: Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Impara a isolare neutrofili purificati da sangue umano mediante centrifugazione a gradiente di densità per studiare il loro ruolo nella sensibilità delle cellule di linfoma ai farmaci antitumorali.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

1. neutrofili Isolamento e co-coltura con cellule leucemiche primarie NOTA: Le procedure sono state condotte sotto l&#39;approvazione del comitato etico dell&#39;ospedale di Lione, con tutti i pazienti che firmano un consenso informato. <ol><li> Isolamento di cellule leucemiche primarie e neutrofili <ol><li> Raccogliere tubi di sangue periferico in EDTA (1,8 mg EDTA per millilitro di sangue) da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC). </li><li> Aggiungere ogni 15 ml di sangue in una provetta sterile 50 ml e diluire con 15 ml di RPMI (diluizione 1: 1), poi accuratamente e aggiungere lentamente 15 ml di soluzione di gradiente di densità al fondo del tubo senza mescolare le fasi. Assicurarsi che la soluzione gradiente di densità è a RT per la preparazione. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 35 minuti a temperatura ambiente e senza freno. Il sangue deve separare in quattro fasi distinte, come mostrato in figura 1A, dall&#39;alto verso il basso: piastrine e plasma, cellule mononucleate (wanello Hite), soluzione gradiente di densità, i granulociti ed eritrociti. </li><li> Raccogliere l&#39;anello bianco che rappresenta le cellule leucemiche primarie con una pipetta di plastica Pasteur e trasferire in una nuova provetta da 50 ml. <ol><li> Riempire il tubo con PBS (contiene calcio e magnesio) fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 min a RT. </li><li> Risospendere il pellet con 5 ml di PBS quindi aggiungere PBS fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 minuti a RT. </li><li> Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI (RPMI 1640 addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), 2 mM glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina) per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. </li></ol></li><li> Aspirare le fasi superiori lasciando la fase di granulociti e eritrociti e aggiungere PBS fino a 25 ml quindi aggiungere 3% di destrano a 0,9% NaClup a 50 ml in totale. Miscelare le provette 10 volte e tenerli per 30 min a temperatura ambiente senza mescolare. </li><li> Raccogliere il superiore RBC-poveri uno strato neutrofilid metterli in una sterile tubo da 50 ml pulita e centrifugare le provette a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet con 5 ml di PBS poi aggiungere rosso tampone di lisi delle cellule fino a 50 ml in totale. </li><li> Conservare le provette al buio per 15 minuti a RT quindi si centrifuga a 500 g per 10 minuti a RT. Lavare il pellet con PBS (PBS aggiungere fino a 50 ml in totale) centrifugare a 500 g per 10 minuti a RT. </li><li> Risospendere il pellet con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. Mantenere 3 x 10 5 di ogni tipo di cellula in 50 microlitri di PBS-FBS (4%) in 5 ml tubi di plastica per determinare la purezza del loro isolamento mediante citometria a flusso. </li></ol></li><li> Analizzare Aspetti morfologici delle isolate popolazioni di cellule <ol><li> Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 4 neutrofili e 3 x 10 4 cellule mononucleari in 150 ml completo RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che tegli centrifugare è ben equilibrato. </li><li> Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 750 xg per 10 min a RT Rimuovere i vetrini, schede filtro e camere per campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione. </li><li> Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X. </li></ol></li><li> Verificare la purezza di cellule isolate da FACS <ol><li> Etichettare le isolate cellule leucemiche primarie con anticorpi CD19 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Etichetta i neutrofili purificati con una miscela di anticorpi anti-umani elencati nella Tabella 1 (5 microlitri / 10 6 cellule). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) la centrifuga le provette a 300 g per 5 minuti a RT. </li><li>Risospendere ogni pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%). </li><li> Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore. </li></ol></li><li> Coculture di cellule leucemiche primari con autologo neutrofili <ol><li> Seed 2 x 10 5 cellule / ml di solo o con neutrofili autologhe al rapporto 1:10 in mezzo completo RPMI cellule leucemiche primarie. Per fare ciò, regolare il numero di cellule diluendo sospensioni cellulari e aggiungere 2 x 10 5 cellule / ml di cellule leucemiche primarie a 2 x 10 6 cellule / ml neutrofili. Mescolare con cura. </li><li> Aggiungere 25 micron di tirosina chinasi (Btk) inibitore di Bruton (Ibrutinib) alle cellule. Incubare per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Cellulare Raccolta e analisi FACS <ol><li> Collect le cellule in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. Lavare il pellet con 1 ml di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> pellet Risospendere in annessina V e PI utilizzando kit commerciale e incubare le cellule nel buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la strategia di controllo dell&#39;immagine figura 2A e la seguente configurazione ottica: laser a 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore. </li></ol></li></ol> 2. differenziazione delle cellule HL60 lungo la granulocitica Pathway e la loro co-coltura con cellule RL linfoma B in 3D del modello <ol><li> Differenziazione delle promielocitica umana (HL60), le cellule in cellule simil-neutrofili <ol><li> Regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml quindi aggiungere 1 mM acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO per indurre la loro differenziazione. Seed ogni 3 x 10 5 </sup&gt; cellule HL60 per pozzetto in lamiera 48-bene poi incubare per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Successivamente, raccogliere le cellule e centrifugare a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. </li><li> Poi diluire sospensione di cellule in mezzo completo RPMI per regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml e indurre nuovamente la loro differenziazione aggiungendo 1 mM di acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO. Seme ogni 3 x 10 5 HL60 cellule per pozzetto nella piastra a 48 pozzetti e incubare per altri 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Analisi di differenziazione HL60 (HL60 diff) <ol><li> Raccogliere le cellule e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. </li><li> Per analizzare i cambiamenti nell&#39;espressione marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso. Posizionare ogni 3 x 10 5 </sup&gt; cellule indifferenziate HL60 (da colture cellulari) e 3 x 10 5 cellule HL60 diff in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. </li><li> Risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS-FBS (4%). Etichettare le cellule con CD11b anti-umano coniugati con AF700 o CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%). </li><li> Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 3A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP). </li><li> Per testare i cambiamenti morfologici a HL60 diff, immobilizzare le cellule su vetrini per l&#39;esame microscopico. <ol><li> Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 <sup&gt; 4 cellule indifferenziate HL60 (da colture cellulari) e 3 x 10 4 HL60 diff in 150 ml completa medie RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che la centrifuga è equilibrata. </li><li> Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 1500 rpm per 10 minuti a RT. Rimuovere le diapositive, le carte di filtro, e le camere di campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione. </li><li> Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X. </li></ol></li></ol></li><li> 3 dimensioni (3D) Cultura NOTA: Assicurarsi che i materiali utilizzati in questo esperimento sono freddi e l&#39;esperimento sta prendendo posto sul ghiaccio. <ol><li> Risospendere ogni 5 x 10 4 cellule RL, da solo o in miscela con HL60 diff </em&gt; Al rapporto RL: HL60 diff 01:10, con matrice di membrana basale di 300 ml con 1 ml di punta della pipetta tagliata con una forbice sterile, al fine di ampliare l&#39;apertura di circa 2 a 3 mm. Evitare le bolle durante questa fase. </li><li> Seed ogni 300 ml di sospensione cellulare / bene in 24-pozzetti. Evitare le bolle durante questa fase. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2 si aggiunge 1 ml completare terreno RPMI per ciascun pozzetto ed incubare per 7 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. Cambiare la media ogni due giorni. Aggiungere 10 nM vincristina al giorno 5. </li></ol></li><li> Analisi FACS <ol><li> Dopo 7 giorni di coltura, aspirare il terreno e lavare i pozzetti con 1 ml di PBS ghiacciata due volte. Aggiungere 3 ml / pozzetto di PBS ghiacciato-EDTA (5 mm). Rimuovere il gel dal fondo del pozzo raschiando utilizzando il fondo di 200 microlitri punta della pipetta. Agitare delicatamente la piastra in ghiaccio per 30 min. </li><li> Trasferire sospensione cellulare in sterile tubo da 15 ml e agitare i tubi delicatamente ice per altri 30 min. Controllare l&#39;aspetto di sospensione omogenea. (Se non è il caso, quindi agitare le cellule per un tempo più lungo o aggiungere più PBS-EDTA). </li><li> Centrifugare le provette a 300 xg per 10 min a RT. Lavare il pellet con PBS poi centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Risospendere con PBS-FBS (4%) e l&#39;etichetta con l&#39;anticorpo CD19 anti-umano coniugato con PE-Cy7 e anticorpi CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) poi provette per centrifuga a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule con annessina V e PI utilizzando il kit commerciale. </li><li> Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 4A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore. </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descritto qui, un protocollo efficace, semplice, veloce ed economico per l&#39;isolamento dei neutrofili dal sangue umano con elevata purezza mediante centrifugazione in gradiente di densità approccio ed entro le stesse cellule mononucleate passo vengono separati e recuperati. Le popolazioni di cellule isolate sono puri ≥90%. Sono disponibili diversi metodi per l&#39;isolamento dei neutrofili dal sangue umano. Questi includono metodi simili utilizzando gradienti discontinui 11,12,...

Cellule immunitarie innate costituiscono una quota essenziale delle cellule all&#39;interno del microambiente tumorale e sono stati associati con la malignità del tumore nei pazienti e modelli animali di cancro 1. Recentemente, è diventato più ampiamente apprezzati che le risposte immunitarie croniche giocano ruoli critici nella promozione progressione tumorale, metastasi e resistenza alle chemioterapie 2. I macrofagi sono importanti cellule immunitarie innate che hanno dimostrato di regolare direttamente la risposta delle cellule tumorali alla chemioterapia 3,4. Tuttavia, il ruolo dei neutrofili, i principali attori del sistema immunitario innato, nella regolazione della risposta del tumore alla terapia anti-cancro non è noto. Gli obiettivi di questi protocolli sono di utilizzare un metodo veloce e credibile per separare neutrofili da campioni di sangue CLL del paziente e di differenziare le cellule HL60 lungo il percorso granulocitica al fine di studiare il loro ruolo nel regolare la sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma. 5 e ad agire come una prima linea di difesa contro i microrganismi invasori 6. I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella nascente efficaci risposte immunitarie innate, oltre alle funzioni effettrici variabili in diverse condizioni patologiche 7. Pertanto, un metodo veloce e credibile isolare neutrofili dalle altre cellule del sangue, come metodo di separazione gradiente di densità, è necessaria per gli studi in vitro. Usando questo metodo per l&#39;isolamento dei neutrofili faciliterà ulteriori ricerche sulle funzioni immunologiche neutrofilo-mediata in vivo ed ex vivo. La possibilità di ottenere popolazioni pure di neutrofili è un primo passo importante per lo studio di pazienti con malattie immunologiche 8. Densità metodo di separazione gradiente è una tecnica ideale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule. il method comporta l&#39;aggiunta di soluzione gradiente di densità nella parte inferiore di un tubo contenente sangue umano diluito seguita da centrifugazione a 300 g per 35 min senza interruzione. L&#39;anello delle cellule mononucleari appare a livello di interfaccia e neutrofili risiedere al di sotto del primo. Questo metodo ha vantaggi significativi rispetto ad altri metodi disponibili come kit di isolamento dei neutrofili che sono molto più costosi 9. Inoltre, isolando neutrofili dal sangue umano da kit commerciali utilizzando anticorpi diretti ad un marcatore di superficie specifico per neutrofili umani, aumentare il rischio di attivazione delle cellule o la differenziazione. Densità metodo di separazione gradiente consente l&#39;isolamento dei neutrofili entro un breve periodo di tempo. Entro lo stesso passo, cellule mononucleari vengono separati e recuperati. E &#39;una tecnica fondamentale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule puri per conseguire integrità funzionale. Al fine di simulare il microenv tumoreironment, sono stati effettuati esperimenti di 3D. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, gli esperimenti 3D con neutrofili umani freschi non sono conclusivi. Per questo motivo, promielocitica cellule (HL60) vengono indotte a differenziarsi in cellule neutrofili simili che utilizzano gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e l&#39;acido retinoico (RA). Utilizzando cellule HL60 differenziate (HL60 diff) impedirà avere diverse risposte dei neutrofili a causa di isolamento da diversi donatori. In 3D vitro modelli di coltura rappresentano una fase intermedia tra i modelli in 2D in vitro e in modelli in vivo. Nella cultura 2D, le cellule sparse sulla superficie di plastica formando allegati cellulari innaturali alle proteine ​​depositati che sono denaturate su questa superficie sintetica. Viceversa, le cellule allegati cellula-cellula naturale forma coltura 3D poiché le cellule e la matrice extracellulare sintetizzano sono il materiale naturale a cui sono attaccati.Per questo motivo, i modelli co-coltura 3D, in particolare tra le cellule tumorali e di altri tipi di cellule, sono stati molto utili per indicare il loro contributo alla crescita del tumore, l&#39;angiogenesi, e le metastasi. Come risultato, culture 3D rendono la coltura cellulare mimare le condizioni fisiologiche che esistono in vivo 10.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS contiene calcio e magnesio)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-alanil-L-glutammina (L-Glutammina)</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina streptomicina (Pen Strep)</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tirosin-chinasi di Bruton (Btk) (Ibrutinib)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristina&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matrice della membrana basale</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Messo a 4 oC durante la notte (O/N) prima del giorno dell'esperimento</td></tr><tr><td>Tampone di lisi dei globuli rossi&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione V-FLOUS di annessione&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp; 988&nbsp; 549&nbsp; 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit RAL 555 Kit di colorazione Giemsa modificata</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>Citometria a flusso LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citocentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica DMR-XA</td> Cellometro <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Auto T4 Cell Viability Counter</td><td>Nexcelom&nbsp; Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrofili isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

I neutrofili sono il tipo di globuli bianchi più abbondante (dal 40% al 75%) e tra le prime cellule infiammatorie a migrare verso il sito di infiammazione. Sono attori chiave nel sistema immunitario innato e svolgono un ruolo importante nella biologia del cancro. I neutrofili sono stati proposti come mediatori chiave della trasformazione maligna, della progressione tumorale, dell'angiogenesi e nella modulazione dell'immunità antitumorale; attraverso il loro rilascio di fattori solubili o la loro interazione con le cellule tumorali. Per caratterizzare le funzioni specifiche dei neutrofili, è necessario un metodo rapido e affidabile per l'isolamento in vitro dei neutrofili dal sangue umano. Qui, è stato dimostrato che un metodo di separazione a gradiente di densità isola i neutrofili e le cellule mononucleate dal sangue. La procedura consiste nella stratificazione della soluzione a gradiente di densità come Ficoll accuratamente sopra il sangue diluito ottenuto da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC), seguita da centrifugazione, isolamento dello strato mononucleato, separazione dei neutrofili dai globuli rossi mediante destrano e lisi degli eritrociti residui. È stato dimostrato che questo metodo isola i neutrofili ≥ di essere puri al 90 %. Per imitare il microambiente tumorale, sono stati eseguiti esperimenti tridimensionali (3D) utilizzando una matrice di membrana basale come Matrigel. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, non è possibile eseguire esperimenti 3D con neutrofili umani freschi. Per questo motivo, le cellule promielocitiche HL60 vengono differenziate lungo la via granulocitaria utilizzando gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e acido retinoico (RA). Lo scopo dei nostri esperimenti è quello di studiare il ruolo dei neutrofili sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma. Tuttavia, questi metodi possono essere generalizzati per studiare le interazioni dei neutrofili o delle cellule simili ai neutrofili con una vasta gamma di tipi di cellule in diverse situazioni.

Densità metodo di separazione gradiente qui descritto fornisce cellule leucemiche primarie e neutrofili non stimolate isolate dal sangue di pazienti affetti da LLC figura 1A rappresenta i diversi livelli di sangue ottenuti dopo gradiente di densità centrifugazione (dall&#39;alto verso il basso:. Piastrine e plasma, anello bianco rappresenta le cellule mononucleate, gradiente di densità soluzione, granulociti e eritrociti). Figura 1B e 1C mostrano le diff...

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. L'isolamento dei neutrofili dal sangue umano mediante il metodo di separazione del gradiente di densità e la differenziazione delle cellule promielocitiche umane (HL60) lungo la via granulocitaria sono descritti qui; testare il loro ruolo sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

L'obiettivo generale di queste procedure è isolare rapidamente neutrofili altamente purificati da campioni di sangue umano mediante centrifugazione su gradiente di densità, al fine di studiarne il ruolo nella sensibilità delle cellule linfomatose alla terapia antitumorale, utilizzando modelli di coltura cellulare in due dimensioni e in tre dimensioni. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le interazioni tra il sistema immunitario innato e il cancro, ad esempio quale ruolo svolgono le risposte delle cellule tumorali mediate dai neutrofili nella terapia del cancro. Il principale vantaggio della separazione su gradiente di densità è la capacità di isolare popolazioni cellulari immunitarie pure in breve tempo, senza esporre le cellule a stimoli che potrebbero alterarne la funzione.Per isolare le cellule leucemiche primarie e i neutrofili, iniziare aggiungendo 15 millilitri di sangue trattato con EDTA proveniente da campioni di pazienti affetti da leucemia linfocitica cronica in singole provette sterili da 50 millilitri. Diluire il sangue con 15 millilitri di RPMI. Quindi aggiungere con attenzione e lentamente 15 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente sotto il sangue, avendo cura di non mescolare gli strati.Dopo la separazione delle cellule mediante centrifugazione, saranno visibili quattro fasi distinte. Le piastrine e il plasma nella parte superiore, un anello bianco di cellule mononucleate, la soluzione del gradiente di densità e i granulociti e gli eritrociti nella parte inferiore. Utilizzando una pipetta Pasteur di plastica, trasferire innanzitutto l'anello bianco di cellule leucemiche primarie in un nuovo tubo da 50 millilitri.Lavare le cellule con fino a 50 millilitri di PBS con calcio e magnesio. E ri-sospendere il pellet in cinque millilitri di PBS fresco. Quindi, aggiungere altri 45 millilitri di PBS alle cellule e centrifugare nuovamente le cellule.Dopo il secondo lavaggio, risospendere il campione nel mezzo RPMI completo e contare il numero di cellule leucemiche primarie vitali. Successivamente, rimuovere il plasma piastrinico e gli strati del gradiente di densità, quindi aggiungere 25 millilitri di PBS e 25 millilitri di destrina in cloruro di sodio alla fase granulocitaria eritrocitaria.Mescolare i tubi dieci volte capovolgendoli. Successivamente, lasciare sedimentare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'equilibrazione, trasferire lo strato superiore di neutrofili povero di globuli rossi in un tubo sterile da 50 millilitri e centrifugare le cellule.Risospendere il palato in cinque millilitri di PBS e lisare i globuli rossi con 45 millilitri di tampone per la lisi delle cellule rosse. Dopo 15 minuti al buio a temperatura ambiente, centrifugare nuovamente le cellule e lavare il palato in 50 millilitri di PBS. Al termine del lavaggio, risospendere le cellule nel mezzo RPMI completo e contare il numero di neutrofili vitali.Diluire entrambi i gruppi di cellule a una concentrazione di 300.000 cellule per 50 microlitri di RPMI e dividere i campioni nel numero appropriato di provette da cinque millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet in 50 microlitri di PBS integrato con FBS. Per determinare la purezza dei sottoinsiemi cellulari isolati, etichettare l’aliquota di cellule leucemiche primarie con l’anticorpo anti-CD19 umano coniugato con APC e l’aliquota di neutrofili purificati con una miscela di anticorpi anti-umani elencati nella tabella, per 30 minuti al buio a quattro gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 500 microlitri di PBS integrato con FBS e risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS fresco con FBS. Successivamente, analizzare la purezza delle popolazioni cellulari mediante citometria a flusso, avendo cura di effettuare la compensazione del colore sui campioni. Per effettuare la co-coltura delle cellule leucemiche primarie con i neutrofili autologhi, si consiglia di seminare 200.000 cellule per millilitro di cellule leucemiche, da sole o in presenza di neutrofili autologhi, in una piastra a 24 pozzetti contenente mezzo RPMI completo.Mescolare attentamente le cellule. Successivamente, trattare le cellule con l'inibitore della tirosina chinasi Brutton per 24 ore a 37 gradi Celsius e al 5 percento di CO2. Il giorno successivo, raccogliere un'aliquote delle cellule in un tubo di plastica da cinque millilitri.Quindi, centrifugare le cellule e lavare i pellet in un millilitro di PBS con FBS. Dopo la seconda centrifugazione, etichettare le cellule con annessina V e ioduro di propidio seguendo le istruzioni del produttore per dieci minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, analizzare i neutrofili e le cellule leucemiche primarie mediante citometria a flusso utilizzando la strategia di gating illustrata.Per impostare una coltura co-coltura tridimensionale, aggiungere 50.000 cellule linfoma B di RL da sole o in miscela con cellule HL60 differenziate in provette sterili da 15 millilitri. Centrifugare i campioni e risospendere i pellet in 300 microlitri di matrice della membrana basale, utilizzando una punta di pipetta da un millimetro con l'apertura tagliata da due a tre millimetri. Successivamente, incubare 300 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per 30 minuti a 37 gradi Celsius e cinque percento di CO2.Al termine dell'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzo RPMI completo in ogni pozzetto e reinserire le colture tridimensionali nell'incubatore per altri sette giorni, sostituendo il mezzo ogni due giorni. Al quinto giorno, aggiungere dieci nanomolar di incristina alle colture. Dopo una settimana di coltura, aspirare il mezzo e lavare ogni pozzetto due volte con un millilitro di PBS freddo di ghiaccio.Quindi, aggiungere tre millilitri di PBS freddo con EDTA in ciascun pozzetto e staccare i gel raschiando il fondo dei pozzetti con una punta da pipetta da 200 microlitri. Agitare delicatamente la piastra sul ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, trasferire le sospensioni cellulari in singole provette sterili da 15 millilitri per un'ulteriore agitazione delicata sul ghiaccio per altri 30 minuti.Verificare l'aspetto di una sospensione cellulare omogenea. Successivamente, centrifugare le cellule, eseguire un lavaggio con PBS e risospendere i pellet in PBS fresco con FBS. Infine, marcare le cellule con gli anticorpi specifici e con coloranti per la vitalità come appena illustrato e analizzare le cellule RL e HL60 differenziate mediante citometria a flusso utilizzando la strategia di gating illustrata.L'analisi di tutti gli eventi delle popolazioni cellulari isolate mediante citometria a flusso dimostra che questo metodo di separazione consente di ottenere una popolazione altamente pura di cellule leucemiche primarie con un singolo picco che esprime CD19. E una popolazione di neutrofili con purezza superiore al 90%, positiva per gli antigeni comuni dei leucociti CD45 e per gli antigeni CD15 e CD16 espressi dai neutrofili maturi. L'analisi delle cellule leucemiche primarie provenienti da colture co-coltivate con neutrofili mostra che i neutrofili esercitano un effetto protettivo sulla sopravvivenza cellulare contro l'inibitore della tirosina chinasi ibrutinib, con un numero significativamente maggiore di cellule leucemiche primarie vitali rispetto alla coltura di sole cellule leucemiche primarie.Le cellule HL60 differenziate sono più stabili nelle colture tridimensionali rispetto ai neutrofili. Dopo l'induzione del loro sviluppo granulocitico, queste cellule sono più piccole rispetto alle cellule HL60 indifferenziate ed esprimono livelli più elevati di CD11B e CD38. Le cellule HL60 differenziate mostrano inoltre nuclei multilobati.Queste cellule esercitano un effetto protettivo sulle cellule RL, con un numero significativamente maggiore di cellule RL vitali in colture tridimensionali dopo il trattamento con vincristina, rispetto alle cellule linfomatose trattate con vincristina e coltivate in monocultura. Una volta acquisita padronanza, il metodo di centrifugazione su gradiente di densità può essere completato in 90 minuti. Dopo il loro sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare l'impatto di diversi tipi di globuli bianchi sulla malignità tumorale in modelli preclinici e campioni di pazienti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare rapidamente e in modo affidabile le cellule mononucleate e i neutrofili, analizzare l'effetto dei neutrofili sulla modulazione delle risposte delle cellule tumorali agli agenti antitumorali e allestire una coltura co-colturale tridimensionale.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo l'isolamento di neutrofili citotossici ad alta densità e neutrofili a bassa densità dal sangue di un topo portatore di tumore mediante centrifugazione discontinua in gradiente di saccarosio.

Isolamento di neutrofili citotossici dal sangue di topo portatore di tumore

Questo video mostra un test che indaga il ruolo delle cellule simili ai neutrofili nella salvaguardia delle cellule di linfoma contro la citotossicità degli agenti chemioterapici. Una co-coltura 3D, costituita da linfoma e cellule simili ai neutrofili, viene stabilita ed esposta alla vincristina, un farmaco chemioterapico. Il contatto diretto con le cellule simili ai neutrofili induce una sovraregolazione delle proteine anti-apoptotiche nelle cellule del linfoma, favorendo così la loro...

Determinazione del ruolo delle cellule simili ai neutrofili nella sensibilità delle cellule di linfoma a un farmaco in esame

Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l'identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice e riproducibile che impiega la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo delle purine su cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) coltivate in diverse condizioni.

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è la leucemia più comune nel mondo occidentale. Fattori di trascrizione NFAT sono importanti regolatori dello sviluppo e attivazione in numerosi tipi cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per l'uso di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule CLL umane per identificare geni di nuovi target di NFAT2.

Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero, dai cappotti buffy o dalle membrane di leucaferesi, ottenendo una buona resa, un'elevata purezza e un'attivazione cellulare minima. Utilizziamo la purificazione a gradiente, la sedimentazione dei globuli rossi (RBC) e la lisi dei globuli rossi per ottenere una preparazione neutrofila di alta qualità / purezza.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

In questo caso, forniamo un approccio affidabile per isolare neutrofili a bassa e normale densità dal sangue intero utilizzando l'isolamento magnetico (selezione negativa) e il mezzo a gradiente di densità discontinuo. Garantisce l'isolamento intatto di cellule ad alta purezza (≥93%), facilitando un'analisi accurata a valle delle sottopopolazioni di neutrofili, fondamentale per comprendere il loro ruolo nella salute e nella malattia.

L'isolamento e la caratterizzazione di neutrofili a bassa e normale densità da sangue intero

I neutrofili a bassa densità (LDN) aumentano significativamente in diverse malattie. Le LDN sono solitamente isolate attraverso la selezione cellulare. Presentiamo un metodo pratico per ottenere LDN puro e vitale. Dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico, le cellule vengono incubate con microsfere magnetiche e quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche.

Metodo rapido con microsfere magnetiche per la purificazione efficiente dei neutrofili a bassa densità

Impara a isolare neutrofili purificati da sangue umano mediante centrifugazione a gradiente di densità per studiare il loro ruolo nella sensibilità delle cellule di linfoma ai farmaci antitumorali.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

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