Name: Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri un microarray glicanico miniaturizzato per analizzare avidità e specificità delle emoagglutinine del virus influenzale A. Questo metodo consente di valutare simultaneamente il legame ai recettori e l'avidità, migliorando l'efficienza rispetto ai saggi tradizionali.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Fondo Scripps Microarray Core e un contratto dai Centers for Disease Control (JCP). RPdV è un destinatario di una borsa di Rubicon e VENI dall&#39;Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO). Il Consorzio per la Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org/) finanziato dalla NIGMS concessione GM62116 (JCP) ha fornito diversi glicani utilizzati in questo studio. Questa è la pubblicazione 29113 da The Scripps Research Institute.

NOTA: Tutte le fasi sono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. 1. Costruzione Array <ol><li> Glycan Preparazione e configurazione Piastra <ol><li> Preparare uno stock di buffer di stampa. Prima fare 500 ml di una soluzione 150 mM magazzino di sodio fosfato bibasico. Anche fare 50 ml di una soluzione 150 mM magazzino di soluzione di sodio fosfato monobasico. In un pallone, utilizzando una ancoretta e pHmetro magnetico, titolare lentamente la soluzione di fosfato sodico bibasico con la soluzione monobasico fino a raggiungere un pH di 8,5. Aggiungere Tween-20 0,005%. </li><li> Preparare i campioni glycan. Diluire PAA glicani coniugati, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) devono essere diluiti a 100 microgrammi / ml in stampa buffer dalla step1.1.1. glicani monovalenti,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) a 100μM in tampone di stampa dal punto 1.1.1. Infine, preparare i coloranti ammina-funzionalizzati, da utilizzare come marcatori della griglia / luci di atterraggio. macchie marcatori Dye sono stampati a 1 micron. NOTA: dye Atto488-NHS è utilizzato nelle nostre stampe. Tuttavia, il colorante ammina-funzionalizzata, leggibile da scanner diapositiva è adatta a questo scopo. </li><li> Trasferire 10 microlitri di ciascun campione glicani di micropiastre a 384 pozzetti, utilizzati per il robot stampa. Conservare glicani non utilizzate nella soluzione tampone stampa a -20 ° C in tubi sigillati. Tansfer 10 ml di marcatore colorante per la lastra da stampa. </li></ol></li><li> Stampa NOTA: Tutte steps che riguardano toccare o spostare le diapositive deve essere fatto con i guanti. <ol><li> Posizionare Arrayer perni nella testina di stampa secondo la corretta configurazione del layout. Per questo layout utilizzare uno spillo per stampare tutti i campioni e gli array. Stampa i glicani in blocchi di sei, saltando una caratteristica (una caratteristica viene definita come punto unico di un certo composto), su ciascun lato, in modo che punti dello stesso campione non vengono stampate esattamente accanto all&#39;altro. NOTA: L&#39;utente finale deve decidere la configurazione. </li><li> Estrarre i vetrini da sacchetti, scatole aperte, e rimuovere eventuali particelle di polvere o piccoli pezzi di plastica che potrebbero essere sulla loro superficie soffiando purezza del gas ad altissima azoto in ogni diapositiva. Mettere il numero desiderato di diapositive, lato rivestito verso l&#39;alto, sul palco Arrayer. </li><li> Programmare il Arrayer, utilizzare i parametri di 27 punti per ogni visita alla piastra fonte, usando 3 &quot;pre-spot&quot; su vetrini rivestiti di poli-L-lisina, per rimuovere il liquido in eccesso sulla punta dei perni di stampa <ol><li> Accendere MPU (Main Power Unit) e unità di controllo del clima. Aprire il software di analisi rivestimenti sul computer. </li><li> Selezionare il layout per la stampa. Selezionare Opzioni → Pin strumento da utilizzare per la stampa della matrice 1 x 1 strumento di stampa - 1 singolo pin. Selezionare la scheda di destinazione → Strumento Array Definizione → Motivo stampa e aggiungere il passo (spot-a-punto di distanza), il numero di righe e colonne per ospitare i campioni da stampare, e il modello di stampa dei campioni (per questo array un 8 x 8 modello di stampa viene utilizzata a 340 micron passo per 7 campioni totali). </li><li> Selezionare Destinazione → Layout diapositiva e programmare la distanza di blocco a blocco per consentire la stampa di ogni matrice replica nel modello di scorrimento 48 pozzetti (4 x 12). Selezionare Source e aggiungere il numero di pickup di origine (1 per ogni campione quando si utilizza 1 pin) (per questa stampa 7 pickup sorgente verrà utilizzato per ospitare 6 dei campioni e 1 marcatore colorante bene). NOTA: La sorgente dialogo dovrebbe diventare verde per mostrare che il numerodelle visite di origine partite i campioni da stampare nel modello di stampa. </li><li> Selezionare Destinazione → piastra di adattamento e Slide Layout e regolare il numero di diapositiva (5 vetrini vengono stampate in un momento per questa stampa con 1 scivolo pre-macchia). </li><li> Rilasciare il vassoio facendo clic sul pulsante T1 per attivare il vassoio e aggiungere il numero desiderato di diapositive al vassoio, prestando particolare attenzione alle posizioni della slitta pre-spotting (blu) e diapositive &quot;reali&quot;. </li><li> Mettere vetrini normali su tutte le porte di vuoto rimanenti per bloccare il vuoto e fare clic su OK per attivare il vuoto. Verificare che tutte le diapositive sono tenuti in posizione e fare clic su OK per tornare il vassoio alla posizione iniziale. </li><li> Caricare la lastra di stampa nel supporto targa e garantire la cremagliera sia impostata correttamente in posizione. Fare clic su Vai e consentire il processo di stampa per procedere. </li></ol></li><li> Stampare i restanti 24 punti in replicati di 6 punti per matrice (4 array / fonte visita). </li><li> Caricare le piastre da 384 pozzettinella stampante e avviare la stampa. Mantenere umidità relativa, durante la stampa, durante la stampa tra il 55 e il 65%. La stampante si arresta dopo la stampa 5 diapositive. NOTA: Durante il microarray in questo saggio viene stampato in una specifica 8 x 8 modello, diversi robot stampa microarray richiedono attrezzature programmazione specifica per ottenere il layout desiderato. Spetta all&#39;utente finale per determinare il modello più appropriato dato specifiche loro attrezzature. </li></ol></li><li> Umidificazione / immobilizzare NOTA: Una volta che le diapositive hanno terminato la stampa, subiscono un passo fermo temporaneo, chiamato anche umidificazione. Umidificazione post-stampa contribuisce a omogeneizzare il fissaggio del campione da ri-bagnare le macchie e di garantire il completo blocco. <ol><li> Mettere i vetrini in una camera umida 100% subito dopo la stampa per un periodo di 30 min. Costruire la camera collocando asciugamani di carta molto umidi piatte sul fondo di un grande piatto di vetro, ponendo i vetrinisu una sorta di cremagliera, come un rack provetta, stampa verso l&#39;alto, e sigillatura con involucro di plastica per intrappolare l&#39;umidità. </li><li> Numero scivola con un alcool / solvente pennarello resistente e conservare in una scatola di essiccazione. Desiccate durante la notte. </li></ol></li><li> Numerazione, blocco e archiviazione <ol><li> Preparare il tampone di bloccaggio - 50 mm etanolammina in 50 mm tampone borato. Innanzitutto, sciogliere l&#39;acido borico, in DDH 2 O, ad una concentrazione finale di 50 mM in un pallone contenente una ancoretta magnetica. Agitare la soluzione con forza su una piastra di agitazione fino a quando tutti i solidi si è dissolto. Mentre mescolando, aggiungere la giusta quantità di etanolammina da una soluzione di 16.54 m stock di raggiungere il desiderato 50 concentrazione mm. Aggiungere idrossido di sodio concentrato per regolare ad un pH finale di 9,2. </li><li> Immergere i vetrini stampati nella soluzione tampone bloccante per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, lavare i vetrini in DDH 2 O per rimuovere eventuali tracce in eccesso di tampone di bloccaggio.Smaltire tampone di bloccaggio in un contenitore per i rifiuti appropriato. </li><li> Trasferire i vetrini ai titolari di colorazione di vetro e spin secco. array Dry mettendoli in una centrifuga dotata portatarga oscillanti, ad una velocità di 10 xg per 5 min. </li><li> Una volta che i vetrini sono asciutti, possono essere incubate immediatamente o memorizzati. Condizioni di stoccaggio sono -20 ° C in un sacchetto di plastica sigillato. </li></ol></li></ol> 2. Analisi Glycan Binding Proteins <ol><li> Preparare una camera umidificata in cui le matrici da ibridato si adatta. Una camera semplice consiste di una pirofila, a strati sul fondo con tovaglioli di carta umida e una cremagliera, su cui scorre riposerà. </li><li> Utilizzare lectine biotinilati SNA (Sambuca nigra agglutinine) e ECA (Erythrina agglutinine cristagalli) a 10 mg / ml + 2 mg / ml di streptavidina-dye 555, a sondare tampone (PBS + 0,01% Tween-20). Per HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 e A / KY / 07 H1N1, in questo esempio), l&#39;usouna concentrazione iniziale di 20 ug / ml pre-complessato, come descritto in precedenza 34. In breve, fare una HA: Mouse-α-Strep: miscela di capra-α-Mouse-Alexa647 in tampone di bloccaggio (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20), in un rapporto di 4: molare 1: 2. NOTA: La matrice viene sondato con lectine di accertare che glicani sono immobilizzati e rilevabile (Figura 1B). </li><li> Trasferire la soluzione mix glycan legame proteina-anticorpo di 20 microlitri di una piastra a 384 pozzetti ed incubare su ghiaccio per 30 min. In serie diluire lectina e campioni HA 1: 1, nel loro tampone appropriato, 8 volte, miscelando 10 ml di campione con 10 microlitri di tampone. </li><li> Dispensare 8 ml di campione sulla superficie micro-bene e incubare nella camera di umidificazione sigillata (100% UR) per 90 min. </li><li> Lavare le diapositive uno alla volta tenendo i bordi e tuffandole quattro volte in una miscela di PBS e 0,05% Tween, poi quattro volte in PBS e infine quattro volte in H 2 O. deionizzata utilizzandolo stesso protocollo di essiccazione descritto nel passaggio di blocco, girare le matrici asciugare in una centrifuga per 5 minuti a 10 x g. </li></ol> 3. Le analisi di scansione e di dati NOTA: I microarray glycan possono essere esplorati allo impostazioni diverse, a seconda del produttore dello scanner per microarray. Variando la potenza del laser e la risoluzione, lo strumento può produrre un&#39;immagine con altrettanti segnali possibili entro la gamma dinamica (Figura 1C). <ol><li> Utilizzare uno scanner di diapositive a fluorescenza e la scansione degli array subito dopo incubazione con le proteine ​​di legame glycan. Fare attenzione al fine di garantire la slitta sia correttamente inserita nello strumento di scansione. <ol><li> Il software open scansione. Fare clic su Start per aprire il programma. Connettersi a: Scanner → Connect o il pulsante verde nel menu del pannello di navigazione dello scanner. </li><li> Aprire lo sportello del caricatore automatico dello scanner. Collocare i vetrini in fessure caricatore automatico in un ordine specifico. Chiudere la porta caricatore automatico. Click &quot;leggere loader&quot; nel pannello Strumenti di navigazione per rilevare automaticamente le diapositive nello scanner. </li><li> Parametro scansione Set: parametri Scanner → scansione appropriate per l&#39;esperimento (ad esempio 635 potenza laser alta, aumento di rilevazione 50%). Scansione di diapositive: Scanner → di scansione. Selezione del percorso per la creazione di una cartella in cui salvare le immagini di scansione e di nomi scansioni individuali. Fatelo prima della scansione vera e propria. Ripetere l&#39;operazione per ogni singola diapositiva. Fare clic su OK per avviare la scansione. </li></ol></li><li> Utilizzare il software dello scanner per impostare lo strumento e la scansione delle diapositive. Impostare lo scanner per eseguire la scansione in modo iterativo alla potenza del laser a bassa (5 mW) con l&#39;aumentare impostazioni di guadagno del 25%, 50% e 75%. NOTA: Le impostazioni possono essere testati e ottimizzati, ma tenere a mente che ogni scansione può eventualmente ridurre l&#39;output di fluorescenza dei coloranti a causa di photobleaching. <ol><li> l&#39;acquisizione dei dati aperti e software di analisi come il software MAPIX. Fare clic su Start per aprire il programma. Aperto scansione immagine: File → im apertoetà. Aprire il file GAL: Analizza → griglia aperta e selezionare il file GAL appropriato. </li><li> Entrare in modalità blocchi: Modalità immagine → blocchi per spostare la griglia. Utilizzare i marcatori della griglia per impostare la griglia nella posizione appropriata sulla diapositiva. Regolare singoli blocchi, se necessario, in modo che corrisponda la matrice stampata. </li><li> Entrare in modalità macchie: Immagine → Modalità punti per regolare la posizione e le dimensioni delle macchie individuali all&#39;interno del blocco. Una volta che tutti i blocchi e gli spot vengono regolate e al suo posto, misura intensità di segnale da analizzare → calcoli fotometrici. Salvare il file di output. </li></ol></li><li> Una volta che le diapositive hanno terminato la scansione, le immagini vengono analizzate per i segnali di legame con il programma di elaborazione delle immagini installata (Figura 1D - G). Per l&#39;analisi delle immagini, caricare un file GAL (Lista Array) l&#39;immagine TIFF digitalizzata sopra. NOTA: Il file GAL contiene sia il modello di layout posto e le identità di ciascuna posizione posto. file GAL per gli array sono created dal software della stampante utilizzando un file di testo delimitato da tabulazioni che contiene le identità dei campioni e la loro posizione nella piastra di origine 384 pozzetti. </li><li> Utilizzare le luci di marcatore / atterraggio griglia stampata sui microarray per posizionare correttamente la griglia GAL. macchie individuali possono avere bisogno di essere spostati individualmente, ma una matrice ben stampata, in genere consentono blocchi all&#39;interno della griglia da posizionare con facilità. Dopo il posizionamento della griglia, raccogliere le intensità del punto dal software e salvato come file di testo delimitato da tabulazioni (.txt). <ol><li> Utilizzando il programma foglio di calcolo, aprire il file di output dallo scanner. Aprire il file macro appropriato dalla posizione della cartella. Fare clic su Visualizza → Macro → EseguiMacro. NOTA: Il pre-scritto copierà i dati in uscita prime, rimuovere le righe e le colonne non necessarie, ordinare i dati di esempio, calcolare i valori di fondo del segnale meno medi medi e riportare i valori risultanti a un foglio di lavoro foglio elettronico contenente i grafici per ogni dei sei SAMPles testato sull&#39;array. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Valutare IAV recettore specificità è un passo importante per l&#39;analisi potenziale pandemia di virus aviari. riconoscimento acido sialico dal virus è legata a diverse proprietà biologiche quali legandosi e rilascio dalla cellula. La conoscenza di quali sono necessarie mutazioni di aminoacidi per i virus aviari per raggiungere α2-6 vincolante e attraversano la barriera di specie consente preparazione alla pandemia. Diversi test sono utilizzati per determinare la specificità del recettore; Tuttavia, tutti hanno i loro ...

uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV è in grado di attraversare la barriera di specie di pollame e mammiferi, inclusi gli esseri umani. IAV aviaria riconoscono α2-3 acidi sialico legati (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani si legano α2-6 acidi sialico legati (di tipo umano recettori). Per essere in grado di replicare in modo efficiente e trasmettere tra gli esseri umani un IAV aviaria ha bisogno di legarsi ai recettori di tipo umano 1. IAV sono divisi sulla base di sierologia che caratterizza l&#39;antigenicità della loro emoagglutinina (HA) e glicoproteine ​​busta neuraminidasi (NA). HA si lega agli acidi sialici, considerando NA è l&#39;enzima recettore distruggendo all&#39;altra estremità del ciclo di vita virale e si unirà acido sialico 2. Tutti i virus che infettano umani, tra cui H1N1, H2N2 e H3N2, hanno un origine avicola 3. Negli ultimi due decenni molti aviaria ai crossover umani si sono verificati, con il virus H5N1, H7N7, e H7N9 è il più noto; However, altri sottotipi hanno infettato gli esseri umani più sporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Fortunatamente, sembra che nessuno di questi virus sono stati in grado di adattarsi perfettamente al tipo umano α2-6-linked recettori per l&#39;acido sialico 5-8. Adattamento del virus zoonotici aviaria o di altri per ospitare la replicazione e la trasmissione in ospiti umani potrebbe avere un effetto devastante sulla salute umana. Pertanto, prima la conoscenza di come questi virus si stanno evolvendo di legare i recettori di tipo umano aiuterà sorveglianza in tutto il mondo dei virus influenzali emergenti. Determinazione della preferenza del recettore è stato chiarito con eritrociti di specie diverse e rimane un test favorito tra i ricercatori di influenza 9-12. La dimostrazione che i virus aviari riconoscono acido sialico α2-3 e virus umani α2-6 collegati acido sialico è stato originariamente basato su un test utilizzando emoagglutinazione di eritrociti enzimaticamente ingegnerizzate per contenere ciascuno dei Linkages 13,14. Anche se la lettura è emoagglutinazione, un test standard per virologi, le strutture glycan sottostanti non sono definite, soltanto il collegamento del terminale. Inoltre, la limitata disponibilità dei sialyltransferases, utilizzati per ri-sialylate cellule, hanno limitato l&#39;uso di questo dosaggio 15-18. Successivamente, sono stati introdotti altri metodi per determinare le preferenze del recettore vincolante utilizzando strutture glycan sialylated legati alla poli-acrilamide (PAA) o strutture poli-glutammato (PGA) in saggi piatto a base di 19,20. Diverse varianti sono possibili rivestimento sia i glicani o virus di micropiastre, ciascuna delle quali si traduce in un robusto, affidabile e molto sensibile ELISA-tipo di saggio 21-23. In alternativa, glicani biotina-linked possono sostituire PAA / PGA e può essere coniugato con piastre rivestite di streptavidina 2,24. Anche se alcuni sieri specifici può essere richiesto, ELISA sono glicani standard e diversi legati alla PAA sono prontamente commerciallY e non disponibile in commercio (Consorzio per Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org)). Tecnologie di microarray glycan sono emersi come uno strumento prezioso per determinare recettore specificità, come più glicani differenti sono macchiati, e vincolante per una vasta gamma di strutture diverse può essere valutata all&#39;interno di un singolo test 25-29. Il legame di IAV a queste strutture fornisce una migliore comprensione delle strutture glicani che IAV riconosce preferenzialmente 30-33. microarrays glycan richiedono piccole quantità di volume di campione per eseguire un esame di legame e utilizza solo piccole quantità di glicani per spot (2 NL). Tuttavia, queste matrici sono tipicamente utilizzati solo per valutare la specificità di glicani recettori. Analisi del virus multipli, o proteine ​​emoagglutinina, in più intervalli di concentrazione può essere proibitivo a causa del numero di vetrini necessari. Inoltre, ad oggi, nessun test di avidità parente è stato sviluppato utilizzando ar glycantecniche di Ray. Per combinare il requisito del campione basso offerto dalle tecniche di microarray glycan e la sensibilità dei glicani PAA-linked in saggi ELISA-based, abbiamo cercato di sviluppare una serie glycan multi-bene che consentirebbe per l&#39;analisi high-throughput con una risoluzione simile o migliore rispetto al tradizionale test ELISA basato. Allo stesso tempo, abbiamo voluto ridurre al minimo la quantità di prodotti biologici e prodotti chimici giornalista consumati. Il risultato finale è un test di avidità miniaturizzato, appositamente sviluppato per il monitoraggio IAV specificità ed è ugualmente applicabile per valutare altre proteine ​​di legame glycan. Usando un vetrino separato in 48 micro-pozzi da una maschera di teflon, 6 glicani diversi sono macchiati in 6 replicati per bene. La piattaforma microarray offre le stesse tendenze di legame al recettore visti in formato macro ELISA con diversi vantaggi. Questi includono (I) stampa di composto in 6 replicati, utilizzando campione minimo, contro il rivestimento di più righe ina piatto, con 100 ul per pozzetto; (II) più diversi composti analizzati simultaneamente in un unico bene, compresi i controlli; (III) una massiccia diminuzione del volume di incubazione e; (IV) una gamma dinamica più grande con una lettura fluorescente. Una singola diapositiva può essere calcolato come equivalente a 18x piastre a 96 pozzetti. Con il seguente protocollo, qualsiasi laboratorio capace di fabbricare e analizzare macchiato microarray dovrebbero essere in grado di produrre questo formato ELISA miniaturizzato.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&reg; Guida H MPX-48&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>Vetrini per micropozzetti</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>ha interrotto la produzione</td><td>dello scanner confocale per microarray</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL Scanner/software Mapix</td><td>Innopsys-scanner</td><td></td> <td>per microarray confocale</td></tr><tr><td>MicroGrid II&nbsp;</td><td>Stampante</td> <td>Digilab-microaray</td><td></td></tr> <tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp;</td><td>Lectina vegetale</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&nbsp;</td><td>Lectina vegetale</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-streptococco</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp;</td><td>Anitbody per il binding HA</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody per rilegatura HA</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp;</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>di-basico Sodio Fosfato</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>stampa componente</td></tr><tr><td>mono-basico Sodio fosfato</td><td>Sigma</td><td>229903&nbsp;</td><td>Componente buffer di stampa</td></tr><tr><td>soluzione di poli-l-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920&nbsp;</td><td>componente della slitta di pre-smacchiatura</td></tr><tr><td>idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>componente del vetrino pre-spotting</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>componente del vetrino pre-spotting</td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>tampone di incubazione/lavaggio</td></tr><tr><td>Perni SMP4B</td><td>Telechem</td><td>Spillo di stampa</td><td>SMP4B</td></tr><tr><td>Azoto compresso (Grado 5)</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>strumento generale per spolverare/essiccare</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Reagente bloccante vetrini</td></tr><tr><td>etanolammina</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Reagente bloccante vetrini</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Gridmarker su array</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>Consorzio per glicomica funzionale</td><td>PA368</td><td>Glicani maculati</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>Consorzio per Glicomi Funzionali</td><td>PA362</td><td>Glicani Maculati</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consorzio per Glicomici Funzionali</td><td>PA343</td><td>Glicani Macculati</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>Consorzio per Glicomici Funzionali</td><td>Te98</td><td>Glicani Maculati</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consorzio per Glicomici Funzionali</td><td>Te175</td><td>Glicani Maculati</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consorzio per Glicomica Funzionale</td><td>Te176</td><td>Glicani maculati</td></tr><tr><td>Piastra per microtitolazione a 384 pozzetti</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Piastra di stampa</td></tr><tr><td>Marcatore da laboratorio VWR</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>Numerazione dei vetrini</td></tr><tr><td>Piatto di colorazione per vetrini</td><td>Wheaton Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Blocco e asciugatura</td></tr></tbody></table>

un miniaturizzato glycan microarray test per la valutazione avidità e specificità del virus influenzale a emoagglutinine

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Virus influenzale A (IAV) emoagglutinine riconoscono acidi sialico sulla superficie delle cellule, come i recettori funzionali per ottenere l&#39;ingresso nelle cellule. uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV può attraversare la barriera di specie di pollame, suini, cavalli e gli esseri umani. virus aviari riconoscono acido sialico attaccato ad un galattosio penultima da un legame α2-3 (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani preferenzialmente riconoscono acido sialico con un α2-6 linkage (recettori di tipo umano). Per monitorare se i virus aviari si stanno adattando ai recettori di tipo umano, possono essere utilizzati diversi metodi. microarray glycan con diverse librerie di sialosides sintetici sono sempre più utilizzati per valutare recettore specificità. Tuttavia, questa tecnica non è utilizzata per misurare avidità. Misurazione della avidità è solitamente ottenuto valutando il legame di emoagglutinina o virus diluiti serialmente per glycans adsorbita convenzionali polipropilene piastre a 96 pozzetti. In questo saggio, glicani con α2-3 o α2-6 acidi sialici sono accoppiati alla biotina e streptavidina adsorbite piastre, o sono accoppiati poliacrilammide (PAA) che adsorbe direttamente alla plastica. Abbiamo notevolmente miniaturizzato questo test stampando direttamente sialosides PAA-linked e le loro controparti non PAA-linked su vetrini micro-bene. Questo set-up, con 48 matrici su una singola diapositiva, permette analisi simultanee di 6 glycan proteine ​​leganti a 8 diluizioni, interrogando 6 glicani diversi, tra cui due controlli non sialylated. Ciò equivale a 18x piastre a 96 pozzetti nel test tradizionale piatto. Il formato di matrice glycan riduce il consumo di sostanze e prodotti biologici e, quindi, migliora notevolmente l&#39;efficienza.

Stampa, scansione e analisi dei dati Per garantire una stampa corretta, è fondamentale avere il corretto allineamento della griglia macchiato all&#39;interno della maschera teflon, che delinea ogni matrice sul vetrino. Durante la stampa, a causa della natura del rivestimento in teflon, macchie non sono visibili ad occhio nudo sulle slitte MPX. L&#39;attenzione è rivolta quindi alla comparsa dei pre-macchie sui vetrini poli-L-l...

Utilizzando una strategia di microarray di glicani stampati, è stato miniaturizzato un test convenzionale su piastra a 96 pozzetti per l'analisi dell'avidità e della specificità dell'emoagglutinina del virus dell'influenza A per i recettori contenenti acido sialico.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

L'obiettivo generale di questa matrice glicanica miniaturizzata è analizzare la specificità e l'avidità degli emagglutinini del virus dell'influenza A. Questo saggio può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardanti il legame recettoriale e l'avidità del virus dell'influenza A. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, in un singolo saggio, è possibile valutare sia la specificità che l'avidità relativa del legame, aspetti normalmente non ottenibili con saggi basati su matrici glicaniche o su piastre. Questo protocollo inizia con la preparazione dei campioni di glicani. La soluzione base per i glicani è un tampone di stampa stock che, una volta preparato, deve essere titolato lentamente fino a un pH di 8,5 e poi addizionato con un tensioattivo. Utilizzando il tampone di stampa preparato, diluire i glicani coniugati con PAA a 100 microgrammi per millilitro.Quindi, diluire i glicani monovalenti a 100 micromolar anche nel buffer di stampa. Infine, preparare stock di lavoro dei coloranti funzionalizzati con ammina a un micromolare. Ora caricare dieci microlitri di ogni campione di glicano in una pozzetta di una piastra microtitolatrice a 384 pozzette.Questa quantità di soluzione è sufficiente per stampare cinque vetrini. Trasferire anche dieci microlitri del marcatore colorante in un pozzetto della piastra di stampa. Prepararsi a stampare gli array posizionando innanzitutto i perni dell'arrayer e la testina di stampa secondo il layout previsto.In questo caso, un singolo pin può stampare tutti i campioni. Le matrici di glicani vengono stampate in blocchi di sei, circondati da uno spazio vuoto su tutti i lati. Indossare guanti per maneggiare le lamelle.Disimballarli e rimuovere eventuali detriti dalle loro superfici con gas azoto ad altissima purezza. Successivamente, posizionare i vetrini con il lato rivestito rivolto verso l'alto sullo stage dell'arrayer. Quindi, programmare l'arrayer.In questo caso, programmare 27 punti per visita alla piastra sorgente. Tre punti preliminari posizionati sull'area non compresa nell'array di un vetrino rivestito con poli-L-lisina vengono utilizzati per rimuovere il liquido in eccesso dalla punta del perno. Gli altri 24 punti per ogni visita del perno vengono utilizzati per posizionare sei punti in quattro array replicati.Nei dettagli descritti nel protocollo testuale. Ora, caricare le piastre a multi-pozzetti nella stampante e avviare la stampa degli array. Durante la stampa, assicurarsi che l'umidità rimanga compresa tra il 55 e il 65%. Prestare attenzione all'aspetto dei pre-spot sui vetrini rivestiti con poli-L-lisina.Dopo la stampa, ispezionare visivamente ogni vetrino. Verificare l'allineamento corretto dei punti all'interno dei bordi in teflon, aspetto fondamentale, e controllare il numero corretto di elementi stampati. Per favorire l'omogeneità dell'adesione dei puntini, collocare immediatamente i vetrini stampati in una camera ad umidità al 100% con il lato stampato rivolto verso l'alto.Utilizzare tovaglioli di carta bagnati per foderare un contenitore e un supporto improvvisato. Avvolgere la camera nella plastica per trattenere l'umidità. Dopo mezz'ora, rimuovere i vetrini.Quindi, numerare i vetrini con un pennarello resistente ai solventi e conservarli in una scatola disidratante durante la notte. Il giorno successivo, preparare una soluzione fresca di buffer bloccante con un'energica agitazione. Regolare il pH a 9,2 utilizzando idrossido di sodio concentrato.Quindi, incubare i vetrini nel buffer per un'ora. Per rimuovere il blocco, sciacquare i vetrini con acqua doppio distillata. Successivamente, trasferire i vetrini in portavetrini di vetro per colorazione e posizionare i portavetrini in un supporto a piatto oscillante per centrifugare i vetrini fino a completa asciugatura a 10 G per cinque minuti.Una volta asciutte, se necessario, conservare le vetrini a meno 20 gradi Celsius in sacchetti di plastica sigillati. In preparazione, preparare un'altra camera di umidificazione come in precedenza. Per rilevare i glicani immobilizzati, preparare lectine biotinilate SNA e ECA a 10 microgrammi per millilitro in tampone di sonda, e aggiungere due microgrammi per millilitro di streptavidina 555 a ciascuna diluizione.Per la colorazione con le emagglutinine, preparare una soluzione di anticorpo pre-complesso a 20 microgrammi per millilitro nel buffer di blocco in un rapporto molare di quattro a due a uno, come descritto nel protocollo testuale. Trasferire 20 microlitri delle soluzioni preparate in pozzetti di una piastra a 384 pozzetti. Successivamente, diluire in modo seriale i lectini e le emagglutinine uno a uno nei rispettivi buffer.Preparare otto diluizioni, aggiungendo 10 microlitri di campione e 10 microlitri di tampone in ciascun pozzetto. Incubare quindi la piastra sul ghiaccio per 30 minuti. Aggiungere poi otto microlitri di ciascuna diluizione a uno dei 48 micropozzetti su un vetrino stampato.Quindi, incubare il vetrino preparato nella camera umidificata per 90 minuti. Trascorsi 90 minuti, lavare il vetrino tenendolo dal bordo; immergerlo nel PBS-T quattro volte, quindi immergerlo nel PBS quattro volte e infine immergerlo nell'acqua deionizzata quattro volte. A questo punto, centrifugare il vetrino per asciugarlo come in precedenza.Dopo l'essiccazione a centrifuga, scansionare immediatamente il vetrino. Assicurarsi di caricare con attenzione il vetrino nello scanner nella corretta orientazione. Scansionare i vetrini in modo iterativo utilizzando una bassa potenza laser di cinque milliwatt, aumentando gradualmente il guadagno dal 25 al 75%. Durante l'ottimizzazione delle impostazioni di scansione, tenere presente che i fluorocromi si sbiancheranno con scansioni ripetute.Analizzare l'immagine salvata per i segnali di legame utilizzando il software associato. È possibile caricare un elenco di array che contiene il pattern di spotting. Sovrapporlo alla scansione per facilitare la navigazione del posizionamento dei marcatori della griglia.Quindi, utilizzare il software per analizzare le intensità dei punti e salvare i risultati come file di testo separato da tabulazioni da esportare in un foglio di calcolo o in un altro pacchetto statistico. Analizzare i dati calcolando l'intensità media del segnale sottratta al fondo. Calcolare la media di quattro dei sei punti replicati per ogni campione, escludendo il segnale più alto e quello più basso.Quindi, produrre un grafico a linee della media del segnale meno il fondo rispetto alle otto concentrazioni proteiche. Applicare una regressione non lineare per rendere più regolare la linea risultante. L'array PAA è stato utilizzato per valutare la specificità di legame dei recettori delle emoagglutinine del virus dell'influenza A.L'array includeva controlli non sialilati negli stessi micropozzetti. Lectine vegetali con specificità note per i composti stampati sono state utilizzate come controlli positivi. La lectina ECA si legava al galattosio terminale beta 1-4 legato all'N-acetilglucosamina e non si legava allo stesso composto se il galattosio terminale era cappato con acido sialico.Per verificare l'acido sialico legato in posizione alfa 2-6, è stata utilizzata la lectina SNA. Come previsto, SNA si è legata esclusivamente agli acidi sialici legati in posizione alfa 2-6, ma con differenze notevoli nell'affinità per i ripetuti lacNAc marcati con colorante legati a PAA rispetto a quelli non legati a PAA. Successivamente, è stato testato un'emagglutinina H5 derivata da un virus Vietnam/1203/04, che riconosce esclusivamente gli acidi sialici legati in posizione alfa 2-3.Il profilo di legame dell'emagglutinina H5 ha mostrato la specificità prevista, con un'affinità maggiore per le strutture legate al PAA. Infine, è stata testata l'emagglutinina H1 proveniente da un ceppo stagionale umano H1N1. Come previsto, questa emagglutinina si è legata esclusivamente a strutture contenenti acido sialico alfa 2-6 legato.Una volta padroneggiata, questa tecnica può rivelare le specificità di legame e le avidità relative dei virus dell'influenza all'interno di un singolo saggio. Questa tecnica migliorerà notevolmente l'efficienza dei saggi di legame dell'influenza, riducendo al contempo il consumo di reagenti biologici preziosi.

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Descriviamo il test della lectina enzimatica (ELLA) per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza (NA) nei sieri. Il test utilizza l'agglutinina di arachidi per quantificare i residui di galattosio che diventano accessibili quando NA rimuove l'acido sialico da piastre a 96 pozzetti rivestite di fetuina.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

I protocolli presentati viene descritto come eseguire un'analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza di inibizione di emagglutinazione.

Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.

Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

Scopri un microarray glicanico miniaturizzato per analizzare avidità e specificità delle emoagglutinine del virus influenzale A. Questo metodo consente di valutare simultaneamente il legame ai recettori e l'avidità, migliorando l'efficienza rispetto ai saggi tradizionali.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

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