Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

L'obiettivo generale di questo array di glicani miniaturizzato è analizzare la specificità e l'avidità delle emoagglutinine del virus dell'influenza A. Questo test può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il legame e l'avidità del recettore del virus dell'influenza A. Il vantaggio principale di questa tecnica è che all'interno di un singolo test possiamo affrontare la specificità e l'avidità di legame relativa, normalmente non raggiunte nei tipici saggi di array di glicani e basati su piastra.

Questo protocollo inizia con la preparazione dei campioni di glicani. La soluzione di base per i glicani è un tampone di stampa stock che, una volta prodotto, deve essere titolato lentamente a un pH di 8,5 e quindi aggiunto di tensioattivo. Utilizzando il tampone di stampa preparato, diluire i glicani coniugati con PAA a 100 microgrammi per millilitro.

Quindi, diluire i glicani monovalenti a 100 micromolari anche nel tampone di stampa. Infine, creare scorte di lavoro dei coloranti funzionalizzati con ammina a un micromolare. Caricare ora dieci microlitri di ciascun campione di glicano in un pozzetto di una piastra per microtitolazione a 384 pozzetti.

Questa è una soluzione sufficiente per stampare cinque diapositive. Trasferire anche dieci microlitri di marcatore colorante in un pozzetto della lastra di stampa. Prepararsi a stampare gli array posizionando prima i pin dell'arrayer e la testina di stampa in base al layout.

In questo caso, un perno può stampare tutti i campioni. Le schiere di glicani sono stampate in blocchi di sei circondati da uno spazio vuoto su tutti i lati. Indossa i guanti per maneggiare le diapositive.

Disimballali e soffia via eventuali detriti dalle loro superfici con azoto gassoso ad altissima purezza. Quindi, posizionare i vetrini con il lato rivestito rivolto verso l'alto sul tavolino dell'arrayer. Quindi, programmare l'arrayer.

In questo caso, programmare 27 punti per visita alla targa di origine. Tre punti di pre-posizionamento sull'area non array di un vetrino rivestito in poli-L-lisina vengono utilizzati per rimuovere il liquido in eccesso sulla punta del perno. Gli altri 24 punti per visita del pin vengono utilizzati per posizionare sei punti in quattro array di replica.

I dettagli sono forniti nel protocollo di testo. A questo punto, caricare le piastre multipozzetto nella stampante e iniziare a stampare gli array. Durante la stampa, assicurarsi che l'umidità rimanga tra il 55 e il 65%Prestare attenzione all'aspetto delle pre macchie sui vetrini rivestiti in poli-L-lisina.

Dopo la stampa, ispezionare visivamente ogni diapositiva. Verificare il corretto allineamento delle macchie all'interno dei bordi in teflon, che è fondamentale, e verificare il numero corretto di caratteristiche maculate. Per omogeneizzare l'attaccamento dei punti, mettere i vetrini stampati in una camera di umidità al 100% con il lato stampato rivolto verso l'alto subito dopo che sono stati realizzati.

Usa salviette di carta bagnate per rivestire un contenitore e una rastrelliera improvvisata. Avvolgere la camera nella plastica per intrappolare l'umidità. Dopo mezz'ora, rimuovere i vetrini.

Quindi, numerare i vetrini con un pennarello resistente ai solventi e conservarli in una scatola di essiccazione per una notte. Il giorno successivo, preparare un brodo fresco di tampone bloccante mescolando energicamente. Regolare il pH di 9,2 utilizzando idrossido di sodio concentrato.

Quindi, incubare i vetrini nel tampone per un'ora. Per rimuovere il blocco, sciacquare i vetrini in acqua bidistillata. Quindi, trasferire i vetrini nei supporti per la colorazione del vetro e caricare i supporti in un supporto per piastra oscillante per far girare i vetrini a secco a 10 G per cinque minuti.

Una volta asciutti, se necessario conservare i vetrini a meno 20 gradi centigradi in sacchetti di plastica sigillati. In preparazione, realizzare un'altra camera di umidificazione come prima. Per rilevare i glicani immobilizzati, preparare lectine biotinilate SNA ed ECA a 10 microgrammi per millilitro in tampone di sondaggio e aggiungere due microgrammi per millilitro di streptavidina 555 a ciascuna diluizione.

Per colorare con le emoagglutinine, preparare una soluzione di 20 microgrammi per millilitro di anticorpo pre-complesso in tampone bloccante con un rapporto molare di quattro a due a uno come descritto nel protocollo di testo. Trasferire 20 microlitri delle soluzioni preparate nei pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Successivamente, diluire in serie le lectine e le emoagglutinine uno a uno nei loro tamponi appropriati.

Effettuare otto diluizioni, riempiendo ogni pozzetto con 10 microlitri di campione e 10 microlitri di tampone. Ora, incubare la piastra con ghiaccio per 30 minuti. Ora aggiungere otto microlitri di ciascuna diluizione a uno dei 48 micropozzetti su un vetrino stampato.

Quindi, incubare il vetrino preparato nella camera di umidificazione per 90 minuti. Dopo 90 minuti, lavare il vetrino tenendolo dal bordo; immergerlo nel PBS-T quattro volte, quindi immergerlo nel PBS quattro volte e infine immergerlo in acqua deionizzata quattro volte. Ora, centrifuga il vetrino come prima.

Dopo la centrifuga, scansionare immediatamente il vetrino. Assicurarsi di caricare con cura la diapositiva nello scanner con l'orientamento corretto. Utilizzando una bassa potenza laser di cinque milliwatt, è possibile eseguire la scansione iterativa dei vetrini, aumentando gradualmente il guadagno dal 25 al 75%Durante l'ottimizzazione delle impostazioni di scansione, tenere presente che i fluorofori sbiadiranno con scansioni ripetute.

Analizza l'immagine salvata per i segnali di legame utilizzando il software associato. È possibile caricare un elenco di array con il modello di spotting. Sovrapponilo alla scansione per facilitare la navigazione nel posizionamento dei marcatori della griglia.

Quindi, utilizza il software per analizzare le intensità spot e salvare i risultati come file di testo delimitato da tabulazioni da esportare in un foglio di calcolo o in un altro pacchetto statistico. Analizza i dati calcolando l'intensità media del segnale meno lo sfondo. Prendi una media di quattro dei sei punti replicati per ogni campione, tralasciando il segnale più alto e il segnale più basso.

Quindi, produci un grafico a linee del segnale medio medio meno lo sfondo rispetto alle otto concentrazioni proteiche. Smussare la linea risultante utilizzando la regressione non lineare. L'array PAA è stato utilizzato per valutare la specificità di legame con il recettore delle emoagglutinine del virus dell'influenza A.

L'array includeva controlli non sialilati negli stessi micropozzetti. Come controlli positivi sono state utilizzate lectine vegetali con specificità note per i composti stampati. La lectina ECA si legava al galattosio beta 1-4 terminale legato all'anacetilglucosamina e non si legava allo stesso composto se il galattosio terminale era ricoperto con acido sialico.

Per testare l'acido sialico legato all'alfa 2-6, è stata utilizzata la lectina SNA. Come previsto, l'SNA si lega solo agli acidi sialici legati all'alfa 2-6, ma con notevoli differenze di affinità per le ripetizioni lacNAc del colorante legate al PAA rispetto a quelle non legate al PAA. Successivamente, è stata testata un'emoagglutinina H5 derivata da un virus Vietnam/1203/04 che riconosce solo gli acidi sialici legati all'alfa 2-3.

Il profilo di legame dell'emoagglutinina H5 ha mostrato la specificità attesa con una maggiore avidità per le strutture legate al PAA. Infine, è stata testata l'emoagglutinina H1 proveniente da un ceppo stagionale umano di H1N1. Come previsto, questa emoagglutinina si lega solo a strutture contenenti acido sialico legate all'alfa 2-6.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può rivelare le specificità di legame e l'avidità relativa dei virus influenzali all'interno di un singolo test. Questa tecnica migliorerà notevolmente l'efficienza dei test di legame dell'influenza e ridurrà il consumo di preziosi prodotti biologici.