Name: Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Scopri un metodo semplice per registrare l'attività afferente da terminali neuronali meccanosensibili nei follicoli piliferi del topo. Questa tecnica combina imaging cellulare vivo ed elettrofisiologia per studiare la meccanosensazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Il lavoro è stato in parte finanziato dal progetto UK Medical Research Council G0601253 a G.S.B. e R.W.B.

Mouse post mortem raccolta dei tessuti deve utilizzare approvato metodi etici. Nel Regno Unito, dislocazione cervicale è un metodo approvato governo per topi adulti (un elencato metodo di pianificazione 1 negli animali del Regno Unito (Procedure Scientifiche) Act, 1986 e la direttiva europea 2010/63 / UE). Questa normativa viene applicata localmente presso l&#39;Università di Aberdeen da parte del benessere degli animali e etica Review Board, che ha esaminato e approvato tutte le procedure utilizzate nella seguente protocollo. Nota: Questi metodi sono stati utilizzati per la ricerca riportata nel Banks et al 7. 1. Orecchie Preparazione per Elettrofisiologia <ol><li> Prima dissezione, preparare una soluzione salina fisiologica standard, come Liley (1956) e saturare con 90% O 2/5% di CO 2. Salina di Liley (mM) comprende: NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) e glucosio(11). </li><li> Umanamente eutanasia un topo adulto senza danneggiare il teschio vicino alle orecchie. Qui usiamo topi C57 / Bl6J e MF1 ma qualsiasi ceppo standard di laboratorio mouse può essere utilizzato. Idealmente, usare i topi che sono &lt;25 g se la registrazione elettrica deve essere combinato con l&#39;etichettatura tintura styryl, come l&#39;etichettatura nei topi più grandi è meno affidabile, essendo spesso si trova solo in zone circoscritte ristrette. </li><li> Rimuovere la testa con grandi forbici o cesoie ossee. </li><li> Posizionare il lato testa dorsale fino a gasato Liley di in una vasta fondo piatto dissezione (50 centimetri di solito è conveniente) sul palco di un microscopio dissezione stereo. Regolarmente (~ 10 min) chiusa o immergere la testa con soluzione salina gasati. </li><li> incise con cura e separare la pelle alla base dell&#39;orecchio esterno (padiglione auricolare) con le forbici springbow e # 3 pinze, esponendo la cartilagine del condotto uditivo esterno (EAM). Identificare i rami del trigemino (divisione mandibolare, MDV) e grandi nervi auricolari che emergono from del cranio in caverna della mandibolare progetto comune e attraverso la base di cartilagine per innervare la concava (anteriore) e convesse (posteriore) gli aspetti della pelle Pinna, rispettivamente. </li><li> Vicino al cranio, identificare dove i due rami del nervo uscita nel solco tra la mascella e il processo mastoide. Massimizzare la loro lunghezza tirando delicatamente il padiglione auricolare via dal cranio e tagliare i nervi più vicino al cranio il più possibile. </li><li> Rimuovere la pinna dalla testa con le forbici springbow, avendo cura di evitare i monconi distali dei nervi divisi e minimizzando la quantità di denso pelage alla base dell&#39;orecchio che viene rimosso. </li><li> Trasferire la pinna di una gomma flessibile in silicone (PDMS) Piatto -lined riempito di liquido Gassed di Liley. Aprire il EAM dividendolo nel punto più stretto (anteriore-la maggior parte). Appiattire il padiglione auricolare, pelle anteriore (concava) rivolto verso il basso e il pin per il PDMS con attenzione ai bordi con ~ 6-8 intervalli regolari molto sottili (~ 0,2 mm di diametro) perni di insetti. </li><li> Remil sobrio la pelle della faccia posteriore del padiglione auricolare completamente e rimuovere parzialmente la cartilagine pinna per via smussa con # 3 pinze, assicurando la pelle anteriore è lasciata intatta. </li><li> Con la punta di un bel perno insetto afferrato con # 3 pinze, si estende dolcemente i rami (di solito 2) del MDV che emergono posteriormente tra la pelle e cartilagini EAM. Pin questi per il PDMS con i migliori possibili perni di insetti, impalare il tessuto connettivo adiacente loro estremità tagliate e non nervose tronchi stessi. </li><li> Rimuovere la maggior parte del tessuto connettivo circostante che li circonda, evitando accuratamente i danni da eccesso di trazione o taglio. </li></ol> 2. registrazione elettrofisiologica Set Up <ol><li> Pin la pelle pinna alla base PDMS-allineati di una camera di registrazione con sottili perni di insetti intorno ai bordi (~ 6-8 per orecchio), mettendo i nervi puliti alla base dell&#39;orecchio vicino due elettrodi di aspirazione - uno per la registrazione (ad prendere il nervo) e l&#39;otlei un elettrodo indifferente (per fornire il segnale di folle ad un amplificatore differenziale, vedi 7). </li><li> Per l&#39;elettrodo di registrazione, corrispondere accuratamente l&#39;apertura e diametro interno dell&#39;apertura allo spessore combinato dei due nervi, in modo da adattarsi perfettamente quanto possibile e a grande lunghezza possibile. </li><li> Disegnare i nervi nella elettrodo aspirazione delicata da una siringa 2 ml attaccato all&#39;altra estremità di tubi in gomma siliconica. Assicurarsi che i nervi sono diritti, non piegata o raddoppiato. </li><li> Sviluppare un alto elettrica in forma di resistenza / impedenza utilizzando forte aspirazione per disegnare il tessuto connettivo o un tessuto adiposo in modo da formare un tappo che sigilla ermeticamente l&#39;apertura intorno al nervo. </li><li> Riempire l&#39;altro elettrodo (indifferente) con soluzione salina per aspirazione, se necessario (si riempia per capillarità). </li><li> Posizionare fili registrazione identiche (argento o platino) nel foro interno degli elettrodi di registrazione per contattare la soluzione salina e il nervo(Registrazione) o ristretta, end ribruciate (indifferente) dell&#39;elettrodo. Ogni elettrodo è saldato individualmente a diversi nuclei di cavo schermato a due fili. Posizionare la vasca (terra) elettrodo (Ag / AgCl pellet) nel bagno, lo ridusse allo schermo del cavo due core collegato agli elettrodi di registrazione. </li><li> Feed l&#39;attività elettrica dei due elettrodi nei canali separati di un amplificatore differenziale, filtro (banda superato 0,2-2 kHz), e vista schermo di un oscilloscopio. Controllare che il canale A (registrazione) e il canale B (indifferenti) livelli di rumore elettrico aspetto simile. In questa fase può non essere possibile vedere i normali potenziali d&#39;azione spontanei del canale A prima che i due elettrodi sono bilanciati. </li><li> Risarcimento eventuali differenze di rumore di fondo tra gli elettrodi, aumentando l&#39;impedenza della registrazione (canale A) o elettrodi (canale B) indifferenti. A tale scopo, succhiando areolare (adiposo) tessuto connettivo più in nessuna delle due elettrodi, e /o applicare una maggiore forza di aspirazione sulla siringa 50 ml. <ol><li> Una volta &#39;bilanciata&#39; in questo modo, tornare alla differenziali (AB) la registrazione e cercare potenziali spontanei di azione (AP) nella traccia o quando accarezzando i capelli ai margini del padiglione auricolare. Se si vede alcuna attività (spiking), ri-controllare la perfetta aderenza del nervo nell&#39;elettrodo registrazione e il tessuto connettivo areolare nel elettrodo indifferente - di solito il più stretto (maggiore resistenza) la guarnizione e il più uguale all&#39;impedenza nei due elettrodi, meglio è. Con la pratica, si otterrà una buona qualità (&gt; 2: 1) Segnale: rumore. </li></ol></li><li> Registrare il electroneurogram tramite un software di interfaccia laboratorio e di elettrofisiologia in esecuzione su un computer. Un&#39;uscita audio di spiking è molto utile e può essere ottenuto alimentando il neurogram attraverso un amplificatore audio e altoparlante audio associato. Regolare la soglia di essere appena sopra il rumore di fondo (identificato dall&#39;assenza di bianco-nOise &#39;sibilo&#39;). </li><li> Per aumentare droga o fluorescente accesso tintura styryl alle terminazioni lanceolate, togliere via lo strato adiposo sub-dermica vicino al margine Pinna, aprendo una finestra su di ~ 5 mm x 5 mm di esporre il derma e la base dei follicoli (Figura 1A, B ). </li><li> Pin indietro una piega di ~ 1 mm pelle dell&#39;orecchio adiposo-eliminato al margine di primo piano (a livello della finestra appena prodotto, se del caso), lasciando un evidente gap soluzione salina tra gli strati della pelle apposto. Delicatamente ictus i peli sporgenti lungo il bordo ripiegato con uno spillo o una pinza sottile a terra, senza toccare la pelle, per individuare la zona di uscita massima di AP sul oscilloscopio e il caratteristico &#39;click&#39; e &#39;pop&#39; in uscita audio. </li></ol> 3. potenziali d&#39;azione di registrazione stimolo-evocati <ol><li> Posizionare la sonda stimolazione meccanica - 10 cm in vetro borosilicato microelettrodi Sfaccettate collegato a un Ceramic piezoelettrico attuatore - così il movimento è parallelo con la pelle piega. Posizionare la punta di circa 0,5-1 mm dalla piega della pelle, in modo che tocchi i capelli, ma non la pelle. Verificare la stimolazione efficace spostando lentamente la punta della sonda manualmente per deviare i peli e osservare / ascoltare la chiodare. </li><li> Utilizzare il software per guidare stimolazione meccanica di 1-3 peli (ad esempio 3 secondi a 5 sinusoidi Hz, ogni 10 sec. Sonda cilindrata 200-500 micron), e registrare le risposte di stimolo-evocata nei nervi. </li><li> Dare diversi identiche treni stimolazione meccanica a intervalli di 10 sec. Ottimizzare la posizione della sonda per la ripetibilità, quindi ridurre la frequenza di stimolazione in base al protocollo sperimentale (ad esempio, calo dei tassi di ripetizione da 10 sec a 30 sec). </li><li> Utilizzare il software di discriminare AP-come attività ad esempio utilizzando una semplice soglia impostata a ~ 2x l&#39;ampiezza del rumore ad alta frequenza e ~ 25% dei più grandi punti di accesso. </li><li> Contare i punti di accesso che attraversano la soglia&quot;eventi&quot;, quantificando la frequenza e le caratteristiche dei prodotti AP. </li></ol> 4. La cottura di registrazione stimolo-evocato In combinazione con N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio Dibromide Labeling <ol><li> Per esaminare gli effetti del stirilici su stimolo-evocato cottura afferenti ed etichettatura terminale, aggiungere la concentrazione appropriata di un colorante styryl di scelta, alla soluzione di balneazione e continuare con la registrazione elettrica. </li><li> Dopo il tempo di esposizione necessario (solitamente almeno 30 min), preparare la preparazione per la visualizzazione dei follicoli. Aprire il lembo cutaneo, eliminando i perni di fissaggio, ed esporre l&#39;area cutanea eliminato per rivelare l&#39;etichettatura terminale. </li><li> Lavare via tintura esterno con soluzione salina priva di tintura, rendendo 3 cambi completi di soluzione salina. </li><li> Incubare al cambio finale di soluzione salina senza colorante gasati per 10-15 minuti per consentire la contaminazione tintura più persistente a percolare da esposte membrane / esterni. </li><li> Rimuovere colorante non internalizzati rimanente membrane con un agente sequestrante (sulfobutylated beta-ciclodestrina, 1 mM, 5 min) in soluzione salina. </li><li> Trasferire la camera di registrazione alla fase di un microscopio a epifluorescenza in posizione verticale e coinvolgere la camera con il meccanismo di movimento di fase / slide. </li><li> Illuminare la preparazione con la luce di eccitazione appropriato per il colorante styryl. Utilizzare un obiettivo microscopio 10X o 25X fluorescenza per osservare l&#39;etichettatura follicolo (Figura 1). </li></ol>

<ol><li>Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transient+receptor+potential+%28TRP%29+channel+agonists+and+antagonists+on+slowly+adapting+type+II+mechanoreceptors+in+the+rat+sinus+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).</li>
<li>Fagan, B. M., Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+glutamate+receptor+mediated+transmission+at+mechanoreceptors+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin.</a> Neuroreport. 12, 341-347 (2001).</li>
<li>Price, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+sodium+channel+BNC1+is+required+for+normal+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation.</a> Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo2+is+the+major+transducer+of+mechanical+forces+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice.</a> Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).</li>
<li>Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+innervation+of+mystacial+vibrissal+follicle-sinus+complexes+in+the+rat+and+cat%3A+a+confocal+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study.</a> J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).</li>
<li>Li, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+organization+of+lanceolate+mechanosensory+complexes+at+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles.</a> eLife. 3, 01901(2014).</li>
<li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li>
<li>Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+dynamics+in+rat+fast+and+slow+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).</li>
<li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+senses%3A+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li>
<li>Drew, L. J., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3 (1), 1(2007).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li>
<li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles%3A+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li>
<li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Phys.+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo sviluppato una relativamente semplice preparazione che possono essere rapidamente sezionato, ha bassa densità follicolo pilifero e permette stimolazione meccanica relativamente selettivo di un piccolo numero di follicoli piliferi. E &#39;facilmente accessibile per la registrazione elettrofisiologica e l&#39;imaging a fluorescenza live-cellule, comprese le risposte a tingere applicazione di visualizzare i follicoli dei capelli stimolati meccanicamente, cioè i follicoli di imaging con risposte elettrofisiologiche definiti. Anche se non abbiamo fatto, questo sistema sembra anche facilmente suscettibili di sub-divisione del nervo sensitivo per singola unità (singolo assone sensoriale) registrazione e l&#39;utilizzo mirato GFP-espressione per la visualizzazione sensoriale terminale di fine morfologia. Abbiamo usato la preparazione della pelle dell&#39;orecchio per studiare le caratteristiche della internalizzazione e rilascio dei fluorescente stirilici membrana pridinium coloranti 7, una tecnica originariamente sviluppato per studiare Vesic localizzataLe riciclaggio membrana nei terminali sinaptici 8. In sinapsi, l&#39;imaging è anche facilmente combinato con registrazione elettrofisiologica simultanea di risposte nei terminali individuati 8,9. E &#39;stato in questi primi studi che abbiamo prima notato i coloranti sono stati internalizzati anche da terminazioni meccanosensoriali 10. Per i neuroni sensoriali nella cultura e nelle cellule ciliate cocleari, gran parte della etichettatura da coloranti styryl piridinio sembra coinvolgere i coloranti che passano attraverso i canali meccanosensoriali, che poi bloccano 11,12. I coloranti poi etichettare le membrane intracellulari, e questo l&#39;etichettatura è irreversibile. Tuttavia, in cellule ciliate che non vengono stimolati meccanicamente 13,14 e completamente differenziate principali terminali sensoriali nervose in situ, come terminazioni Ia in fusi muscolari 15, e nelle terminazioni lanceolate qui 7, etichettatura tintura styryl sembra riflettere endocitosi membrana, dal momento che l&#39;etichettatura è reversibile e non blocca le res meccanosensorialiponses 7,15,16. Mentre alcuni internalizzazione colorante da permeazione canale in queste terminazioni, non si può escludere del tutto, è chiaro dalla cottura continuata durante l&#39;incubazione tintura e la reversibilità della etichettatura che la grande maggioranza della etichettatura terminali differenziati in situ è di internalizzazione con riciclo delle vescicole membrana. Così, questa semplice tecnica è facilmente utilizzato per il monitoraggio elettriche ed ottiche combinato di una serie di funzioni del terminale meccanosensoriali in ex vivo tessuti. Come con la maggior parte delle tecniche pratiche, riproducibilità richiederà ripetizione e la pratica. Alcuni dei punti chiave particolare attenzione merita verrà ora descritta. Per tutta la sessione di dissezione e la registrazione, massimizzare la vitalità del tessuto e la sopravvivenza, garantendo la preparazione è costantemente perfuso con soluzione salina completamente saturato con il 95% O 2/5% di CO 2. Assicurarsi che i capelli follicoli non vengono spostati durante questo processo, which stimolerà sensoriale cottura finale. Utilizzare un sistema continuo flusso laminare perfusione o accuratamente gas bolla attraverso il bagno di organo con tubi raffinata ad una distanza dalla preparazione, o accuratamente aggiornare soluzioni ogni 20-30 minuti, mantenendo la preparazione di sotto della superficie salina in ogni momento. elettrodi di registrazione di aspirazione sono realizzate modificando taglienti pipette elettrodo borosilicato normalmente utilizzate per la registrazione intracellulare. In primo luogo, accuratamente rompere le punte affilate con # 3 pinze per dare il diametro interno adeguato per soddisfare i nervi e il fuoco-polacco per molto breve (1 sec &lt;) l&#39;esposizione a Bunsen fiamma del bruciatore (vedi 2.4 e 2.5). Per ottenere un buon rapporto segnale-rumore durante la registrazione, è essenziale che l&#39;impedenza elettrica (resistenza) in questi due elettrodi si sia massimizzata e pari. A tale scopo, prestando attenzione a quanto segue nelle due elettrodi. Per l&#39;elettrodo di registrazione, assicurarsi che il diametro interno è una perfetta aderenza per il nervo, e la lunghezza massima di Nerve viene aspirata l&#39;elettrodo di registrazione. Provare a utilizzare il tessuto connettivo circostante il coraggio di sigillare in modo efficace l&#39;elettrodo. In alternativa, o in aggiunta, disegnare l&#39;estremità più stretta di dimensioni adeguate, piece rastremata del tessuto adiposo nel fianco del nervo. Quindi, inserire l&#39;elettrodo applicando forte aspirazione per ~ 1 min con una siringa da 50 ml attaccato al tubo. Per una punta ben chiuso, l&#39;applicazione di forte aspirazione semplicemente rafforzare l&#39;efficacia della spina e non si baserà in più liquido o del nervo. Per evitare danni al sistema nervoso, tuttavia, assicurarsi che il tessuto connettivo è ammortizzazione il nervo dalla compressione sul materiale circostante e EAM cartilagine. L&#39;elettrodo indifferente dovrebbe imitare la resistenza / impedenza dell&#39;elettrodo di registrazione più vicino possibile. Questo è aiutato da accuratamente fuoco lucidatura della punta come piccolo un&#39;apertura possibile, senza in realtà sigillarlo. Se è necessaria ulteriore resistenza, quindi inserire l&#39;estremità dell&#39;elettrodo indifferente con adipose il tessuto connettivo, come sopra descritto per l&#39;elettrodo di registrazione. Il electroceramic dà il controllo esclusive sui spostamento meccanico, sia spazialmente e temporalmente. Tuttavia, prendersi cura di effettuare i collegamenti elettrici - alte temperature li distruggono, in modo da non utilizzare saldatura a caldo. Utilizzare colla epossidica metallo-caricato, o utilizzare una presa specialista push-fit raccomandato dal fornitore. In questo modo sia tenerlo fermo e stabilire la connettività elettrica. Fissare la sonda vetro stimolante al electroceramic con resina epossidica standard. Fuoco-polacco alla fine di uno standard di 10 cm x 1,5 mm di diametro borosilicato tubo capillare di vetro usato per fare patch o elettrodi taglienti per la registrazione elettrofisiologica per ridurre al minimo il rischio di danni ai tessuti. Se è necessaria la stimolazione follicolo pilifero singolo, il fuoco-polacco la punta per misura un singolo capello, e posizionare la sonda con un singolo capello all&#39;interno del diaframma aperto. Questo dà il controllo squisito su un singolo capello. Per styryl dye etichettatura, è generalmente più uniforme in tessuti di animali più giovani. Non è del tutto chiaro perché, ma questo probabilmente riflette trauma meno meccanico e più efficace rimozione dei tessuti profondi dai tessuti più giovani. Essere approfondita nella rimozione dello strato di schiuma di polistirene espanso Simile sovrastante le basi del follicolo pilifero. Tuttavia, evitare di essere troppo forte, in quanto ciò rischia di rimozione dello strato nervose del plesso e terminali lanceolate associati. Se c&#39;è risposta elettrica poco o nessun al movimento del follicolo pilifero, ed applicazione di tintura styryl porta ad etichettatura predominante delle ghiandole sebacee (giallo / bianco), con autofluorescenza distinta della base del fusto del capello anziché terminazioni lanceolate (arancione / giallo), spazio troppo entusiasta ha danneggiato i tessuti sottostanti. Infine, utilizzando un agente colorante-chelante prima di imaging migliora notevolmente contrasto dell&#39;immagine e la qualità delle immagini finali. Questa tecnica può essere utile in una serie di ulteriori studi. questi coULD comprendono, ad esempio, lo screening per il canale meccanosensoriali (s) responsabile per le risposte di stiro-evocato, incubando la preparazione con ligandi farmacologici selettivi per i canali candidati o di screening linee del mouse con tali canali geneticamente cancellati. Quest&#39;ultimo potrebbe essere combinato con la valutazione della fluorescenza di eventuali cambiamenti nella morfologia del terminale a causa della manipolazione genetica in linee del mouse, ad esempio con l&#39;espressione GFP Npy2r-linked 17. Un ultimo esempio potrebbe essere indagare il ruolo delle vescicole sinaptiche-like (SLV) 7 in questi terminali lanceolate, esaminando l&#39;effetto di modulatori di fatturato SLV (Ca, Mg, latrotoxin, ligandi dei recettori del glutammato) sulle risposte di stiro-evocato e tintura styryl assorbimento /uscita. Così, questa nuova tecnica apre una serie di viali potenzialmente interessanti di ricerca in neuroscienze mechansensory.

I terminali lanceolate di assoni sensitivi che innervano i follicoli piliferi nei mammiferi formano palizzate intorno l&#39;epitelio capelli-albero. Il loro scopo è quello di rilevare spostamento meccanico dei peli che circondano. Essi sono un mix di rapido e lentamente adattando terminazioni che producono prevalentemente brevi sequenze di attività in risposta al movimento dei capelli. Attività cessa molto rapidamente quando il movimento si arresta, anche in presenza di spostamento continuato. Qui si descrive lo sviluppo di questo modello murino Pinna per gli studi correlativi della struttura e funzione nei terminali lanceolate. Il padiglione auricolare ha molte caratteristiche vantaggiose per lo studio di questi terminali. Innanzitutto, la pinna è essenzialmente due strati di pelle apposto back-to-back, con poco altro tessuto tra di interferire con l&#39;accesso ai follicoli e terminali. La pelle è molto sottile e facilmente sezionato a causa di minime quantità di tessuto connettivo duro. L&#39;innervazione è facilmente accessibile e identificabile. Mentre follicl capelliES sono presenti, sono relativamente poco distribuiti, facilitando la stimolazione di individui o piccoli gruppi di follicoli meccanicamente. Lo strato dermico sottostante sottile dà una buona accessibilità alle terminazioni nervose con farmaci farmacologici e coloranti. Questo li rende particolarmente ideale per gli studi di imaging usando la microscopia a fluorescenza. L&#39;acquisizione di immagini può essere sia in terminali viventi, o dopo fissazione e successiva trasformazione istologica. Le risposte dei neuroni meccanosensoriali innervano follicoli piliferi sono stati tradizionalmente studiati in roditori vibrisse 1,2 e, in misura minore, in preparazioni della pelle isolati 3,4. Questi hanno insegnato molto sui principi generali della fisiologia meccanosensoriali nelle terminazioni nervose che circondano il fusto del capello. La preparazione vibrissal permette il controllo squisito il movimento di un singolo follicolo pilifero. Tuttavia, può essere difficile decifrare l&#39;uscita a causa della sua complessità, come vibrissalfollicoli contengono almeno 8 diversi tipi di anatomicamente distinti finale meccanosensoriali 5 e l&#39;abbinamento di questi tipi morfologici a specifiche risposte elettrofisiologiche è ancora oggetto di controversia. Il / preparato nervo safeno pelle del mouse è più spesso utilizzato nel suo stato depilata di indagare le risposte tattili e dolore. L&#39;innervazione dei follicoli piliferi in una tale preparazione è meno complesso ma la densità dei follicoli piliferi, più la presenza di tre diversi tipi follicolo (guardia, punteruolo / auchene e capelli zigzag) in tale vicinanza 6, significa studiare le risposte specifiche di un singolo follicolo o solo tipo di finale è ancora impegnativo. Inoltre, questa preparazione implica una dissezione complesso. Infine, sia vibrissal e altre preparazioni pelle, è difficile visualizzare le terminazioni coinvolti mentre la ex vivo preparativi sono ancora vivi. Così, il sezionamento del tessuto è necessario anche in linee di topi GFP che esprimono. alternativamente, richiede ulteriore elaborazione istologica / immunologica come la fissazione e / o l&#39;incubazione anticorpo per immunofluorescenza. Abbiamo quindi sviluppato la preparazione padiglione auricolare e lo ha utilizzato per effettuare registrazioni elettrici da una popolazione ristretta di capelli afferenze follicolo e dimostrare che la membrana ciclismo si verifica in queste terminazioni lanceolate, rappresentati da assorbimento di coloranti styryl piridinio. Infine, abbiamo dimostrato che il colorante non interferisca con sensibilità meccanica, indicando che non blocca i canali meccanotrasduzione. I risultati di semplici protocolli di stimolazione e di analisi sono illustrati.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Polimero siliconico solido flessibile, inerte e traslucido.</td></tr><tr><td>N. 3 Pinze Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Spille per insetti</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Perni molto sottili per fissare saldamente la preparazione del padiglione auricolare al PDMS con danni minimi.</td></tr><tr><td>Preamplificatore differenziale AC</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>Amplifica le dimensioni dell'elettroneurogramma afferente in ingresso. La registrazione differenziale riduce al minimo il rumore elettrico estraneo e la deriva della linea di base.</td></tr><tr><td>Filtro passa-alto/basso</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>Condizionamento del segnale, riducendo il rumore elettrico estraneo per garantire il miglior rapporto segnale/rumore.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Imposta la soglia del rilevatore di eventi e la visualizza sull'oscilloscopio. Questo dimostra l'efficacia del rilevamento del potenziale d'azione.</td></tr><tr><td>Audio Amplifier & Speakers</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>Utile monitoraggio audio per la presenza di attivazione elettrica delle terminazioni sensoriali durante la regolazione della preparazione di stimolazione meccanica lungo il microscopio&nbsp;</td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>Usiamo questo vecchio modello, ma qualsiasi oscilloscopio standard sarà sufficiente.</td></tr><tr><td>Wafer piezoelettrico elettroceramico</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Interfaccia elettrofisiologica/computer</td></tr><tr><td>Alimentazione piezoelettroceramica</td> Uscita 0-200 V CC <td>fatta in</td><td></td> casa <td>per pilotare lo spostamento del wafer ceramico, con controllo elettronico variabile dell'uscita tramite software di registrazione/stimolazione e interfaccia computer. Utilizziamo il software Spike2 e l'interfaccia del micro computer 1401.</td></tr><tr><td>Software di elettrofisiologia</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Software di registrazione, stimolazione e analisi dei dati per l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Interfaccia di laboratorio</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 micro</td><td>Interfaccia di elettrofisiologia, tra l'amplificatore/filtri e il computer. Inserisce l'elettroneurogramma e guida anche il movimento elettroceramico.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Sonda a membrana fluorescente che si divide in modo reversibile nel foglietto esterno delle membrane cellulari. Utilizzato prevalentemente per il monitoraggio dell'endo-/esocitosi della membrana della vescicola.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>Un derivato solfonato della b-ciclodestrina che chela FM1-43 (e altri coloranti di stirilpiridinio) dalle membrane esposte, lasciando che il colorante internalizzato sia visibile più chiaramente abbassando la marcatura/fluorescenza di fondo.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Telecamera CCD monocromatica raffreddata - modello base</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini 3D Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini.</td></tr></tbody></table>

registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate endings

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Una tecnica di dissezione e la registrazione romanzo è descritto per la cottura monitoraggio afferente evocato da spostamento meccanico dei capelli nella pinna del mouse. La tecnica è molto conveniente e facilmente intrapresa con materiali comunemente presenti nella maggior parte dei laboratori di elettrofisiologia, o facilmente acquistati. La dissezione è semplice e veloce, con lo spostamento meccanico fornito da un generico wafer electroceramic controllato dal software proprietario. Lo stesso software registra anche e analizza l&#39;uscita electroneurogram. La registrazione dell&#39;attività del nervo evocata è attraverso un amplificatore differenziale commerciale collegato a microelettrodi di vetro standard fuoco lucido. consigli utili sono dati per migliorare la qualità della preparazione, la stimolazione e le condizioni di registrazione per ottimizzare la qualità di registrazione. Il sistema è adatto per saggiare le proprietà elettrofisiologiche e ottiche di terminali lanceolate di terminazioni palizzate di follicoli piliferi, nonché lai risultati da loro manipolazione farmacologica e / o genetica. Un esempio di combinazione registrazione elettrica con stimolazione meccanica e marcatura con un colorante vitale styryl piridinio è dato.

La disposizione registrazione elettrofisiologica, con il tessuto adiposo sottocutaneo rimosso per esporre i follicoli piliferi, viene mostrato nella Figura 1A. Una parte di questa zona esposta è mostrato un ingrandimento maggiore nell&#39;illuminazione campo chiaro in Figura 1B. Pieghevole margine pinna e su se stesso in questo settore espone la superficie epidermica. Ciò posiziona i peli sul bordo della piega a sporgere orizzontalmente, in una situazione ideale per la stimolazione meccanica con una sonda smussato (non mostrato). La figura 1C mostra che dopo l&#39;esposizione tintura e ritornando nuovamente il margine alla posizione dispiegata, il follicoli stimolato in questa posizione sono stati etichettati con un colorante styryl piridinio. Electroneurograms da preparazioni mostrano tipicamente corso dell&#39;attività AP anche in assenza di movimento imposto della sonda in fibra di vetro, compreso AP dalle dimensioni maggiori (Figura 2A <strong&gt; I-III). Attività avviene ad una velocità di circa 10-20 impulsi / sec (trace &#39;picchi&#39;), mostrando alcuna struttura o segni di tonicità, come auto-correlazione per gli intervalli tra periodi di stimolazione sono piuttosto piatta. Durante 5 Hz, 100 micron stimolazione meccanica dei fusti, uscita complessiva aumenta tipicamente a 20-50 impulsi / sec, o 4-10 per ciclo sinusoidale. Costruzione di istogrammi ciclo rivela quindi forte trascinamento (cosiddetta &#39;fase di chiusura&#39;) delle risposte (Figura 2BI-iii)). Questo è abbastanza ripetibile, anche se la fase della forma d&#39;onda in cui le risposte sono bloccate dipende dalla loro posizione, cioè in quale punto il movimento vibrante sonda contatta i capelli. Un semplice rilevamento di soglia (linea orizzontale che attraversa le tracce neurogram in A (i-iii)) è stato utilizzato per questa analisi. Tuttavia, la funzionalità software di registrazione può essere spesso utilizzato in modo più sofisticato perdiscriminare caratteristiche di dimensione picco e forma. Questo può quindi isolare le risposte di particolari fibre afferenti da queste caratteristiche per consentire l&#39;analisi di registrazione pseudo-single-unità da intraprendere. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> Figura 1:. Elettrofisiologiche Disposizione di registrazione e N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio Dibromide Etichettatura di follicolo pilifero terminazioni afferenti lanceolate (A) Un Pinna preparazione impostati per un esperimento elettrofisiologico che mostra la pinna orientamento, la posizione dei nervi, gli elettrodi di registrazione e l&#39;area esposta del follicolo innervazione dopo la rimozione del tessuto adiposo. (B) Diversi follicoli piliferi sono visibili nella illuminazione campo chiaro nella zona libera da tessuti adiposi sovrastanti fino al derma. Il buio, di solito bilobato, le forme sono ghiandole sebacee. ( <strong&gt; C) Visualizzazione ingrandita della zona in scatola in B) che mostra due terminazioni lanceolate etichettati con il colorante styryl N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro e ripreso dopo stimolazione meccanica mediante microscopia in epifluorescenza . Dal 7, con il permesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> Figura 2: (a) Attività stimolo-evocato Registrato dal Pinna Mouse. (Ai-III) Esempi, tratti da 3 diversi esperimenti, di attività da neurograms continui da padiglioni auricolari in soluzione salina normale di Liley. Ogni record mostra una sezione 5 secondi a circa 5 minuti dopo l&#39;inizio della registrazione, compreso un periodo 3 sec di spostamento sinusoidale comeil numero centro commerciale di fusto del capello. La stimolazione meccanica è stata ripetuta ogni 30 secondi per tutta la registrazione continua, che di solito è durato per 1-2 ore. file script personalizzati assegnati singoli eventi che hanno attraversato una soglia impostata dal cursore orizzontale (punte), così come la comparsa di ogni ciclo sinusoidale (periodo). (Aiv) Il segnale di comando per lo spostamento sinusoidale. (B) Analisi di stimolo-evocato Schiacciata attività. (Bi-III) istogrammi ciclo in 3 ° contenitori costruiti dai campioni neurogram rispettivamente (Ai-III), che mostra le risposte di terminazioni lanceolate presunti alla stimolazione meccanica da 5 Hz spostamento sinusoidale del fusto del capello da una sonda di vetro. Notare la fase di bloccaggio marcata, in diverse fasi del ciclo, a seconda della loro posizione rispetto alla posizione di partenza della sonda meccanica. (Biv) sonda normalizzato spostamento sinusoide; l&#39;ampiezza effettiva era approssimativamente 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Viene presentata una tecnica semplice e innovativa per registrare le secrezioni afferenti dovute alla stimolazione meccanica dei terminali lanceolati delle terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio del topo.

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo rapido e semplice per combinare l'immagine di cellule vive e la registrazione elettrofisiologica in terminali neuronali notoriamente difficili da raggiungere e sensibili meccanicamente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella meccanosensibilità, come il ruolo delle vescicole di tipo sinaptico o la farmacologia dei canali meccanotrasduttori candidati nei terminali completamente differenziati, in situ.Il principale vantaggio di questa tecnica è che è estremamente semplice, ma consente l'accesso visivo a terminali completamente differenziati per indagini fisiologiche. Sebbene questo metodo si concentri sull'afferenza del follicolo pilifero, può inoltre fornire informazioni su altri sistemi meccanosensoriali a bassa soglia, come i fusi muscolari, i terminali sensoriali di Merkel e i barocettori. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di nuovi bersagli farmacologici per regolare i sensori meccanici, inclusa la terapia della regolazione anomala della pressione sanguigna.Dopo aver decapitato un topo giovane adulto, posizionare la testa con il lato dorsale rivolto verso l'alto, in soluzione di Liley gassata, in una piastra con fondo largo 50 centimetri, sotto un microscopio stereoscopico per dissezione. Ogni circa 10 minuti, risciacquare accuratamente l'area di dissezione con silano gassato. Ora, praticare con attenzione un'incisione e separare la pelle alla base del padiglione auricolare utilizzando un paio di forbici a molla e una pinzetta numero tre.Esporre l'innervazione e la cartilagine del condotto uditivo esterno. Identificare i rami della divisione mandibolare del nervo trigemino e del nervo auricolare maggiore mentre emergono dal cranio nella fessura dell'articolazione mandibolare. Questi due rami nervosi si estendono attraverso la cartilagine per innervare le superfici concava e convessa della cute del padiglione auricolare.Quindi, nella regione tra la mandibola e il processo mastoideo, identificare i punti in cui i rami del nervo trigemino escono. Esporre la loro lunghezza tirando delicatamente il padiglione auricolare lontano dal cranio. Una volta esposti, recidere i nervi il più vicino possibile al cranio.Successivamente, utilizzare forbici a balestra per rimuovere il padiglione auricolare dalla testa. Evitare di tagliare le estremità distali dei nervi recisi e ridurre al minimo la quantità di pelo denso. Trasferire il padiglione auricolare in una piastra rivestita di gomma siliconica contenente soluzione di Liley aerata.Ora, aprire il condotto uditivo esterno dividendo la sua parte più stretta. Successivamente, appiattire il padiglione auricolare con la faccia concava verso il basso e fissare tale lato ai margini utilizzando puntine da insetto molto fini disposte a intervalli regolari. Poi, rimuovere completamente la cute dorsale esposta dal padiglione auricolare e dalla cartilagine sottostante mediante dissezione ottusa usando forbici.Non danneggiare la pelle anteriore durante questo passaggio. Quindi, utilizzando una pinzetta, afferrare un sottile perno per insetti ed estendere delicatamente i rami sezionati della divisione mandibolare che emergono posteriormente tra la pelle e la cartilagine del condotto uditivo esterno. Fissare questi rami nervosi alla piastra con i perni più fini possibili.Infissare il tessuto connettivo, unendo le loro estremità recise, e non i frammenti di nervo stessi. Completare la preparazione del tessuto rimuovendo la maggior parte del tessuto connettivo circostante dai rami nervosi, ma evitare di danneggiare i nervi con trazioni o tagli eccessivi. Per trattare le terminazioni meccanocettive dei follicoli piliferi con coloranti vitali o farmaci, staccare con cura la cartilagine fibroelastica schiumosa dello strato adiposo sottocutaneo lungo cinque millimetri del margine del padiglione auricolare.Pertanto, aprire una finestra quadrata, esponendo il derma e la base dei follicoli piliferi. L'uso di un topo giovane riduce l'adesione tra gli strati cutanei anteriore e posteriore e la difficoltà di rimuovere la cartilagine sottostante. Entrambi questi fattori aumentano la probabilità di ottenere una colorazione riuscita.Posizionando il preparato nella base della camera di registrazione rivestita di silicone. Utilizzando sottili perni per insetti, fissare l'orecchio lungo i bordi, disponendo i nervi puliti alla base dell'orecchio in prossimità di due elettrodi a suggione. Uno per la registrazione e l'altro, un elettrodo indifferente, per fornire il segnale neutro a un amplificatore differenziale.Per l'elettrodo di registrazione, regolare con attenzione l'apertura e il diametro interno dell'orifizio in base allo spessore del nervo selezionato per la registrazione. Una volta effettuata questa operazione, tale misura sarà solitamente costante per qualsiasi serie di esperimenti. È necessario che un tratto adeguato di nervo si adatti perfettamente all'interno.Per far entrare il nervo nell'elettrodo, utilizzare un'aspirazione delicata da una siringa da due millilitri, collegata tramite tubo di silicone. All'interno dell'elettrodo di registrazione, assicurarsi che i nervi siano dritti e non piegati o sovrapposti, ritirando e reinserendo delicatamente il nervo con un ago sottile per insetti durante l'aspirazione. A questo punto, aspirare un po' di tessuto connettivo circostante o un tessuto adiposo morbido e malleabile, al fine di formare un sigillo impermeabile all'apertura dell'elettrodo.Lo sviluppo di un'impedenza bilanciata tra gli elettrodi è essenziale per una registrazione di alta qualità e differenziale. Fondamentale a tal fine è la creazione di un sigillo resistente all'acqua e ad alta resistenza intorno al nervo. Successivamente, riempire l'elettrodo indifferente con soluzione salina mediante aspirazione, se non è già stato riempito per azione capillare spontanea.Quindi, inserire fili identici in argento per la registrazione all'interno del foro interno degli elettrodi di registrazione e indifferente. All'altra estremit&agrave;, i fili devono essere collegati a nuclei diversi di un cavo schermato a due anime. Assicurarsi che il filo nell'elettrodo di registrazione entri in contatto con la soluzione salina e sia vicino al nervo senza tuttavia compromettere il sigillo.Inserire il filo all'estremità dell'elettrodo indifferente. Successivamente, posizionare l'elettrodo di terra, un pellet di argento-cloruro di argento, nel bagno. Collegare questo elettrodo alla schermatura del cavo bifilare collegato all'elettrodo di registrazione.Visualizzare i segnali individuali su un oscilloscopio per verificare che i livelli di rumore elettrico dei due canali siano simili. I potenziali d'azione spontanei nell'elettrodo di registrazione potrebbero non essere visibili finché i due elettrodi non sono bilanciati. Per correggere le differenze di rumore di fondo, aumentare l'impedenza di un canale aspirando ulteriormente tessuto connettivo adiposo all'interno dell'elettrodo.Una volta che gli elettrodi hanno bilanciato i fondali, passare alla registrazione differenziale e cercare potenziali d'azione spontanei oppure indurre potenziali d'azione sfiorando i peli al margine del padiglione auricolare con una bacchetta di vetro levigata a fiamma. Successivamente, registrare un'elettro-neurogramma tramite l'interfaccia del computer. E inviare il neurogramma attraverso un sistema audio per rendere udibili gli impulsi appena al di sopra del rumore di fondo.Questo circuito di retroazione uditiva è molto utile durante la conduzione di esperimenti. Successivamente, confermare che l'innervazione dei follicoli vicini all'area depilata sia integra stimolando manualmente i peli. Ora, piegare uno o due millimetri del margine della pelle dell'orecchio a livello della finestra depilata per esporre i peli sottostanti.Lasciare un'intercapedine riempita di soluzione salina tra i lembi cutanei opposti. Ascoltando attentamente, accarezzare delicatamente con una bacchetta di vetro i peli che sporgono lungo il margine piegato. Non toccare la pelle.Se necessario, verificare l'oscilloscopio per valutare l'uscita. Per effettuare registrazioni controllate di potenziali d'azione evocati dallo stimolo, utilizzare una sonda meccanica costituita da vetro microelettrodico di borosilicato lungo dieci centimetri e lucidato a fiamma, fissato a un attuatore piezoelettrico in ceramica. Posizionare la sonda in modo che si muova parallelamente alla piega della pelle e tocchi i peli, non la pelle.Posizionarlo a circa mezzo millimetro fino a un millimetro sopra la superficie della pelle. Quindi, verificare manualmente la stimolazione ascoltando l'uscita audio quando la sonda si muove. Ora, configurare il software per attivare la stimolazione meccanica di una piccola area di peli.Ad esempio, impostare simulazioni di tre secondi con sinusoidi a cinque hertz ogni dieci secondi. Ciò richiede uno spostamento della sonda compreso tra 200 e 2.000 micron. Procedere quindi con stimolazioni automatizzate ripetute per verificare la coerenza delle risposte registrate nei nervi.Dovrebbero essere ottenibili risultati ripetibili. Quando i risultati sono costanti, ridurre la frequenza di ripetizione a ogni 30 secondi. Ulteriori istruzioni sono fornite nel protocollo testuale.Per studiare le proprietà dei canali meccanosensibili ed etichettare le terminazioni meccanosensibili attorno ai follicoli piliferi, aggiungere dieci micromolari di FM1-43 alla soluzione e lasciare agire per 60 minuti, continuando a stimolare i peli con la sonda oscillante. Questo colorante blocca i canali trasduttori candidati e i neuroni sensoriali in coltura e nelle cellule ciliate del coclea.Tuttavia, non blocca la scarica nell'afferente del follicolo pilifero maturo in situ. La marcatura delle terminazioni mostra che il colorante raggiunge i terminali, i quali continuano a rispondere alla stimolazione meccanica per tutta la durata dell'esposizione al colorante. Gli elettro-neurogrammi ottenuti utilizzando il protocollo descritto mostrano tipicamente un'attività di potenziali d'azione in corso, anche in assenza di stimolazione manuale, inclusi potenziali d'azione di dimensione massima.L'attività spontanea si verificava a circa 10-20 impulsi al secondo, mostrando assenza di struttura o segni di tonicità. L'autocorrelazione degli intervalli tra i periodi di stimolazione era sempre piuttosto piatta. Durante una stimolazione meccanica a cinque hertz, di 500 micron, dei fusti dei peli, l'output complessivo aumentava tipicamente a circa 50 impulsi al secondo.La costruzione degli istogrammi ciclici ha rivelato un forte incasellamento delle risposte, con quattro-dieci impulsi per ciclo sinusoidale. Questo risultato era molto ripetibile, ovviamente, la fase dell'onda alla quale le risposte erano bloccate dipendeva dal punto in cui la sonda vibrante toccava il follicolo pilifero e dalla direzione del movimento in quel punto. Successivamente è stata esplorata la farmacologia del canale dei terminali nervosi lanceolati del follicolo pilifero.I canali hanno continuato a rispondere anche quando esposti a FM1-43, che può bloccare alcuni canali meccanosensibili, come quelli presenti nei neuroni sensoriali in coltura o nelle cellule ciliate della coclea in espianto. Una volta padroneggiata questa tecnica, l'inizio della registrazione di elettro-neurogrammi può essere raggiunto in 60-90 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante sviluppare un contatto elettrico ad alta resistenza negli elettrodi e, se abbinata alla visualizzazione dei follicoli, utilizzare topi di piccole dimensioni per migliorare la penetrazione del colorante e la chiarezza ottica.Abbiamo adattato l'idea per questo metodo da una originariamente sviluppata da un collega stretto e ora professore in pensione, Clarke Slater, e dal suo studente di magistrale Nakul Kain, quando abbiamo riferito loro il possibile ruolo delle vescicole di tipo sinaptico nella meccanosensibilit&agrave; del fuso muscolare e la necessit&agrave; di un metodo migliore per visualizzarle con FM1-43. Seguendo questa procedura, &egrave; possibile eseguire metodi come la farmacologia e la marcatura con coloranti vitali per rispondere a domande quali quali siano i canali meccanotrasduttori e i terminali differenziati in situ e se la stimolazione meccanica possa modulare l'assorbimento e il rilascio del colorante regolando il riciclo delle vescicole di tipo sinaptico. Non dimenticare che la tossicit&agrave; di FM1-43 non &egrave; stata valutata e che esso va trattato come se fosse pericoloso.

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Whole-cell patch-clamp registrazioni da dendriti delle fibre nervose uditivo interno alla sinapsi nastro capelli cellule nella coclea di mammifero.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

Questo video dimostra la registrazione combinata dell'uscita afferente stimolata meccanicamente e dell'etichettatura del terminale nervoso nei follicoli piliferi di un padiglione auricolare di topo. Delinea le fasi coinvolte nella stimolazione meccanica dei terminali nervosi del follicolo pilifero prima e dopo l'esposizione a un colorante fluorescente a membrana, la registrazione elettrofisiologica dei potenziali d'azione generati e la visualizzazione dell'etichettatura del terminale nervoso...

Registrazione combinata dell'output afferente stimolato meccanicamente e della marcatura del terminale nervoso nei follicoli piliferi di topo

Questo video dimostra un protocollo per stimolare la radice del nervo uditivo e registrare correnti postsinaptiche nei neuroni olivocochlorici mediali in fette di cuneo cerebrale di topo.

Stimolazione della radice del nervo uditivo e registrazioni di corrente postsinaptica in una fetta di cuneo cerebrale di topo

Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato.

Un In Vitro Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

Qui descriviamo una nuova preparazione per l'imaging di terminali sensoriali lanceolati vivi di terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio di topo durante la colorazione e la decolorazione con coloranti di stirylpyridinio.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

I nervi afferenti mesenterici trasmettono informazioni dal tratto gastrointestinale verso il cervello riguardanti la normale omeostasi e la fisiopatologia. L'attività del nervo afferente gastrointestinale può essere valutata montando segmenti intestinali isolati con nervi afferenti attaccati in un bagno d'organo, isolando il nervo e valutando l'attività basale e stimolata.

In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

Abbiamo sviluppato una tecnica che registra simultaneamente sia electrocorticography e potenziali di campo locale in risposta a stimoli nocicettivi laser da liberi di muoversi. Questa tecnica aiuta a stabilire un rapporto diretto di electrocortical segnali a livello macroscopico e mesoscopiche che facilita l'indagine nocicettive di elaborazione delle informazioni nel cervello.

Registrazioni simultanee di potenziali di campo locale corticale ed Electrocorticograms in risposta a stimoli nocicettivi Laser da liberi di muoversi

Questo studio presenta un approccio di imaging a due fotoni in vivo per visualizzare le strutture dei terminali assonici dei meccanorecettori (LTMR) a bassa soglia nella pelle delle zampe anteriori dei topi. Utilizzando immagini ripetute ad alta risoluzione di singoli assoni, questo metodo offre una nuova piattaforma per studiare la struttura e la funzione del circuito sensoriale cutaneo durante lo sviluppo e negli adulti.

Imaging a due fotoni intravitali della morfologia degli assoni sensoriali del tatto nella pelle del topo

Scopri un metodo semplice per registrare l'attività afferente da terminali neuronali meccanosensibili nei follicoli piliferi del topo. Questa tecnica combina imaging cellulare vivo ed elettrofisiologia per studiare la meccanosensazione.

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings (Video) | JoVE Journal

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

Esplora altri video