Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell'endotelio vascolare

L'obiettivo generale di questo semplice biotest basato su cellule è quello di rilevare, quantificare e monitorare l'attività dei membri della famiglia dei fattori di crescita dell'endotelio vascolare delle ligine. Questo metodo può rispondere a domande chiave in biologia vascolare, virologia, cancro e oftalmologia, dove le ligine della famiglia VEG-FR irradiano processi chiave in queste malattie. Il vantaggio principale di questo test è che consente di valutare le ligine della famiglia VEG-FM in termini di capacità di legarsi e reticolare i loro diversi recettori senza richiedere cellule epiteliali specializzate.

Coltura della linea cellulare secernente IL3 WEHI-3D pipettando da cinque volte dieci a seste cellule nella faccia logaritmica di crescita in quattro o dieci fiasche T175 contenenti 50 millimetri di terreno di coltura fresco. Incubare per sette giorni o fino a quando le cellule non hanno superato la loro fase logaritmica di crescita di circa 24-48 ore. Decantare il liquido e le cellule dai flaconi.

E centrifugare a 1.000 G per 15 minuti per rimuovere cellule e detriti cellulari. Quindi rimuovere il 90% superiore di supernaytent e filtrarlo attraverso un'unità filtrante da 0,22 micron. Aliquotare il terreno condizionato in aliquote da un millilitro per la preparazione del saggio.

Aliquote da 50 millilitri per la produzione di terreno di coltura per il passaggio di linee cellulari dipendenti dal fattore A e volumi da 200 millilitri per la conservazione a lungo termine a 20 gradi Celsius. Conservare i volumi più piccoli a 20 gradi Celsius. Cellule BAF3 di controllo della coltura in terreni di coltura contenenti il 10% di terreno condizionato WEHI-3D.

e cellule VegFR2-EPoR-BAF3 nello stesso terreno più un milligrammo per millilitro G418. Cellule di passaggio da una a 15 diluizioni da cellule che crescono in fase logaritmica. Raccolta di cellule BAF3 o VegFR2VPoR-BAF3 di controllo per colture in fase log media.

Pipettando delicatamente per rimuovere le cellule dal fondo della centrifuga del pallone a 750 Gs per cinque minuti per recuperare il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato tonico di topo e centrifugare nuovamente a 750 Gs per cinque minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte per rimuovere il mezzo contenente IL3.

Lavare le celle una volta utilizzando un terreno senza terreno condizionato DEHI-3D. È importante lavare via il terreno di coltura contenente IL3 per assicurarsi che non rimangano ulteriori fattori di crescita, che potrebbero generare un risultato falso positivo o un'elevata attività di fondo. Dopo la centrifugazione e l'eliminazione dei supernayten, risospendere le cellule nello stesso terreno privo di IL3 ad una concentrazione di 7,4 volte 10 per le quarte cellule per millilitro.

Infine, mescolare volumi uguali di blu di tripano in PBS con una popolazione cellulare e caricare in un ematocitometro. Conta almeno 100 celle. Le cellule che assorbono il colorante sono considerate morte o morenti.

È fondamentale che le cellule utilizzate per il test abbiano un'elevata vitalità per garantire che siano in grado di rispondere alle condizioni del test. Utilizzare una pipetta automatizzata P20 ben calibrata e puntali autoclavati per aggiungere 1.000 cellule in 13,5 microlitri di terreno carente di IL ai pozzetti di una piastra a 72 pozzetti. Fare attenzione a mescolare la sospensione cellulare durante l'aliquotazione per garantire che la sedimentazione cellulare per gravità non influisca sulla concentrazione cellulare.

Utilizzare una pipetta P2 ben calibrata per aggiungere 1,5 microlitri di terreno privo di IL3 in triplicato ai pozzetti di controllo. Complesso da mescolare. Allo stesso modo, aggiungere il terreno condizionato WEHI-3D al 10% e il controllo VegFA no IL3 da 100 nanogrammi per millilitro ai pozzetti desiderati.

Infine aggiungere 1,5 microlitri dei campioni di prova in triplicato. Riempire i pozzetti inutilizzati della piastra per micropozzetti con acqua sterile, PBS o terreno. Mettere la carta velina imbevuta d'acqua in un contenitore permeabile al gas per creare una camera umidificata che consenta lo scambio di gas.

Incubare le piastre di analisi nelle camere in un'atmosfera umidificata al 10% di anidride carbonica per 16 ore. Dopo 16 ore di incubazione, analizzare le piastre utilizzando un microscopio a fase invertita standard con un ingrandimento da 40 a 100x. In questo momento è possibile discriminare tra campioni positivi e negativi.

I pozzetti senza il supporto di fattori di crescita o con il solo terreno avranno un numero ridotto di cellule rotonde, nonché cellule morte o morenti e detriti cellulari. Mentre le cellule incubate con terreno contenente IL3 o ligina per VegFR2 sono grandi e traslucide e non vi è alcuna o minima evidenza di granularità nel citoplasma cellulare o detriti cellulari nella coltura. Aggiungere 10.000 cellule lavate in 135 microlitri di terreno carente di IL3 ai pozzetti di una piastra standard da 96 pozzetti.

Utilizzare una pipetta P20 calibrata per aggiungere 15 microlitri di campioni di prova e controlli ai pozzetti. Incubare la miscela di cellule, fattori di crescita e/o agenti inibitori come prima per 48 ore. Al termine del periodo di incubazione, valutare il numero di cellule vitali nei pozzetti utilizzando i metodi descritti nella parte scritta del protocollo.

Di seguito sono rappresentati i risultati di un test in cui il bioassay VEGF-R2 EPoR BAF3 viene utilizzato per quantificare l'attività delle tre ligine umane sdraiate con specificità per VEGF-R2. VEGF-A165, VEGF-C e VEGF-D. L'attività è stata quantificata in presenza di bevacizumab, un anticorpo monoclonale inibitorio contro VEGF-A165 o in presenza di trastuzumab, un anticorpo non neutralizzante.

I dati sono stati normalizzati rispetto alla risposta al solo VEGF-A165. Come previsto, bevacizumab ha bloccato l'effetto di VEGF-A165 nel test, ma non ha avuto alcun effetto sull'attività di VEGF-C e VEGF-D. Le cellule esposte all'IL3 erano altamente vitali.

Quelli invece esposti all'assenza di fattori di crescita aggiuntivi mostrano una scarsa vitalità. Quando si tenta questa procedura, è importante tenere presente che si tratta di una serie di agenti di controllo in terreni condizionati che devono essere generati prima del test. Questa tecnica ha aperto la strada alla rinascita della biologia vascolare, della virologia, del cancro e dell'oftologia per esplorare il ruolo di VEG-FM nelle ligine.

Dopo aver visto questo video dovreste avere una buona comprensione di come preparare le cellule del biosaggio, di eseguire il biotest e di condurre le analisi quantitative o semiquantitative dell'attività della ligina VEG-FM.