Registrazione del mouse ultrasuoni Vocalizations per valutare Comunicazione Sociale

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di registrare e analizzare le vocalizzazioni ultrasoniche di cuccioli di topo o adulti, e quindi di rendere i dati disponibili al pubblico nel database mouseTube. In precedenza avevamo identificato le mutazioni nell'autismo, quindi ora vogliamo capire il ruolo di questi geni. Stiamo utilizzando modelli murini e, in particolare, stiamo osservando la vocalizzazione ultrasonica dei topi.

Questo modello può aiutare a comprendere le domande chiave nel campo delle neuroscienze. Ad esempio, come le mutazioni genetiche influenzano la comunicazione sociale in un modello murino per disturbi neuropsicotici come l'autismo. Il vantaggio principale di questo protocollo è che le vocalizzazioni di indirizzamento del mouse sono suscitate in modo affidabile.

Dovrebbe favorire una standardizzazione delle informazioni di contesto per migliorare il confronto tra gli studi. Questo metodo migliorerà anche le conoscenze sulla comunicazione intrasonica tra i topi utilizzando il database mouseTube. Dopo aver preparato i topi e ottenuto i cuccioli appena nati, allestisci una gabbia per registrare i loro richiami.

Usa una scatola insonorizzata o una scatola di polistirolo. Innanzitutto, imposta un termometro per monitorare la temperatura interna. Successivamente, attraverso un foro nella parte superiore della scatola, abbassare un microfono a ultrasuoni a condensatore in modo che la membrana del microfono si trovi a circa 12-15 centimetri dal pavimento.

Ora collega il microfono alla scheda audio di un computer. Metti il cucciolo non sperimentale in un supporto per cuccioli di plastica pulito all'interno della scatola di registrazione e chiudilo. Fai in modo che il suono di registrazione di picco utilizzi tutta l'ampiezza disponibile senza distorsioni.

Non modificare questa impostazione durante l'esperimento. Ora, per le misurazioni sperimentali, posiziona il cucciolo il più delicatamente e rapidamente possibile in un bicchiere di plastica pulito. Quindi, posiziona il cucciolo sotto il microfono e chiudi la scatola il più delicatamente e silenziosamente possibile.

Quindi, effettua una registrazione a 16 bit e 300 kilohertz per ottenere un set di dati di alta qualità. Dopo un massimo di cinque minuti di registrazione, rimuovere il cucciolo. Prendi nota del suo tatuaggio sulla zampa e poi misura la sua temperatura cutanea con un termometro digitale.

Ora, fai un piccolo segno sul cucciolo usando inchiostro a base d'acqua e rimettilo nel suo nido. Tra un test e l'altro, lavare la tazza con etanolo al 10% e lasciarla asciugare completamente. Per una gabbia di prova per adulti, utilizzare una gabbia in plexiglas che si inserisce in una scatola insonorizzata illuminata con luce bianca a bassa intensità.

Pulisci la gabbia con acqua saponata, asciugala e riempila con due centimetri di lettiera fresca. Fissa il microfono in un angolo della gabbia e regola l'angolazione del microfono per catturare i suoni dall'intera gabbia. Quindi, posiziona una videocamera sopra la camera insonorizzata in modo che veda la superficie della gabbia di prova senza che il microfono oscuri un angolo.

Utilizzando una coppia di animali non sperimentale, impostare il guadagno della registrazione come prima. Per l'esperimento, introduci prima un animale nella gabbia per ricoprire il ruolo di occupante. Lasciarlo abituare per 20 minuti.

Durante questo periodo può essere effettuata una registrazione di base. Quindi, avvia le registrazioni video e audio e presenta il secondo animale dello stesso sesso per ricoprire il ruolo di nuovo arrivato. Sincronizza le registrazioni attivando un segnale acustico quando il secondo tocca la gabbia.

Registra le interazioni degli animali per tutto il tempo necessario, ad esempio quattro minuti. Per prepararsi a questo test, la mattina presto del giorno del test, prelevare strisci vaginali da ogni femmina per determinare il loro stato nel ciclo dell'estro. Tieni la femmina per la coda e lascia che afferri la griglia della gabbia.

Usando una pipetta, sciacquare più volte la vagina iniettando e raccogliendo 20 microlitri di PBS. Presta attenzione al PBS quando viene espulso dalla vagina. Quando è leggermente nuvoloso, contiene abbastanza cellule.

Fallo con attenzione per evitare di creare muco. Distribuire il campione su un vetrino. È possibile esaminarne fino a quattro contemporaneamente.

Lasciare asciugare i campioni prima di procedere. Sotto una cappa aspirante, incubare i vetrini in un bagno di soluzione di May-Grunwald 0,1 molare in PBS per tre minuti. Quindi, trasferire i vetrini in un bagno PBS per un minuto.

Quindi, trasferire i vetrini in un bagno del 5% in peso in volume Giemsa R in PBS. Dopo 10 minuti, sciacquare i vetrini con PBS fresco per un altro minuto. Quindi, esamina i vetrini macchiati.

Se il campione mostra solo grandi cellule epiteliali cornificate che non hanno nuclei e si colorano di blu, la femmina è in pieno estro. Solo tali femmine possono essere utilizzate per il test. Ora, installa la gabbia di prova con l'uomo come occupante.

Lascialo abituare per 10 minuti e, se necessario, fai una registrazione audio di base. Quindi, avvia le registrazioni video e audio e presenta la femmina in pieno estro. Sincronizzare i record come prima utilizzando un segnale acustico.

Quindi, lascia che gli animali interagiscano per tutto il tempo necessario, ad esempio un periodo di quattro minuti. Al termine della registrazione, rimetti i topi nelle rispettive gabbie. Per caricare i dati sul sito web mouseTube dell'Institut Pasteur, effettuare prima l'accesso.

Verificare se la deformazione del mouse registrata esiste nel database di mouseTube facendo clic sul pulsante Strappi. In caso contrario, chiedi agli amministratori di crearlo. Quindi, crea soggetti animali.

Inserire i codici identificativi degli animali registrati. Riuniscili in gruppi per facilitare il recupero dei dati in un secondo momento. Quindi, fornisci una descrizione del protocollo utilizzato.

A questo punto, crea un esperimento per ogni sessione di registrazione. Specificare il protocollo, il gruppo di individui che è stato registrato, l'hardware e il software utilizzati e le loro specificità. L'esperimento raccoglie tutti i metadati corrispondenti ai file di vocalizzazione.

Quindi, crea il collegamento ai file di vocalizzazione. Innanzitutto, seleziona l'esperimento all'interno dell'elenco. Quindi, copia e incolla l'URL del file di vocalizzazione nel campo corrispondente della colonna File da collegare.

È possibile che il link che stai inserendo a questo database non sia effettivamente corretto. Assicurati che il server che ospita i tuoi file di vocalizzazione sia accessibile dall'esterno del tuo istituto per i membri della comunità. In Dettagli, nella sezione Note, per fornire secondo necessità.

Ad esempio, specificare che è stato inserito un collegamento a un file video che accompagna un file audio. Infine, dopo aver effettuato le voci, convalidale. Non è necessario compilare ogni casella per ogni file.

Se necessario, modificare i collegamenti inseriti. Sono stati caratterizzati topi privi di espressione di Shank2, un gene associato a disturbi dello spettro autistico. Questi topi hanno mostrato una comunicazione vocale atipica, inizialmente osservabile come una diminuzione del tasso di chiamata nelle interazioni femminili.

Successivamente, è stato valutato il repertorio standard di cinque richiami che passano dall'infanzia all'età adulta. Le misurazioni sono state effettuate per la prima volta con i cuccioli di P2. Il repertorio vocale non è cambiato nei cuccioli P6.

Al P10, il repertorio vocale era sempre lo stesso. Fino a questo punto, non c'era molto deficit mostrato dai topi nulli Shank2. Tuttavia, in età adulta, le differenze correlate al genotipo sono diventate evidenti.

Quando i maschi hanno interagito con le femmine in estro, c'è stato un notevole aumento della percentuale di richiami brevi e non strutturati effettuati dai maschi mutanti. Nei modelli di richiamo uditi tra femmine, le femmine nulle di Shank2 emettevano più richiami brevi e non strutturati, così come richiami meno complessi e meno richiami di salto di frequenza quando accoppiati con femmine normali. Topi Shank2 null accoppiati, maschi o femmine, vocalizzavano con una frequenza di picco inferiore rispetto alle coppie di compagni di cucciolata wild-type.

La sincronizzazione dell'analisi degli eventi comportamentali e dell'emissione di vocalizzazioni ha permesso l'identificazione di menomazioni nel contesto dell'emissione di vocalizzazioni ultrasoniche in topi mutanti. I topi nulli di Shank2 vocalizzavano meno spesso quando erano in contatto fisico con i nuovi arrivati, e più specificamente quando annusavano la regione anogenitale. Altre vocalizzazioni sono state udite quando i nuovi arrivati si trovavano nel campo visivo dei topi nulli Shank2.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare le vocalizzazioni ultrasoniche del mouse e caricare i dati nel database di mouseTube. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di registrare un numero sufficiente di precondizionati individuali data l'altezza e la vitalità interna nella barriera vocale del topo.