Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

L'obiettivo generale dell'applicazione di questi approcci di immunoprecipitazione della cromatina a cellule staminali embrionali in differenziamento o a tessuti embrionali cardiaci è scoprire la regolazione epigenetica dello sviluppo cardiaco. Poiché la regolazione fine della trascrizione genica durante lo sviluppo del cordone embrionale è controllata da componenti epigenetici, l'immunoprecipitazione della cromatina rappresenta un approccio adeguato per comprendere questo processo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo mirare specificamente un locus e analizzare i marcatori epigenetici presenti su quel particolare frammento di DNA. Questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione epigenetica dello sviluppo cardiaco. Può inoltre essere applicato ad altri organi o a qualsiasi tipo cellulare.

Questa è Imen. È una studentessa di dottorato nel laboratorio e oggi eseguirà l'esperimento. Questa procedura utilizza cellule staminali embrionali o cellule ES.

Corpi embrionoidi generati da cellule staminali embrionali e tessuti cardiaci embrionali isolati da embrioni di topo a 9,5 giorni. Fissare le cellule e i tessuti. Utilizzare formaldeide al 1% in PBS per le cellule e tampone di permeabilizzazione PB2 per i tessuti embrionali.

Posizionare i tubi su un agitatore orbitale a una velocità di 60 RPM a temperatura ambiente per esattamente 10 minuti. Arrestare la reazione di cross-linking aggiungendo glicina fino a una concentrazione finale di 125 millimolare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente sull’agitatore orbitale a una velocità di 60 RPM. Per iniziare questa procedura, risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS.

E i tessuti embrionali in un millilitro di PB2. Centrifugare a 1000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprannatante e aggiungere il rispettivo tampone per un secondo lavaggio.

Aggiungere inibitori della proteasi ai tamponi PB1 e PB2 su ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tampone PB1 integrato con inibitori della proteasi al pellet cellulare e aspirare e rilasciare più volte con una pipetta per risospendere le cellule. Allo stesso modo, risospendere i tessuti embrionali in un millilitro di tampone PB2 integrato con inibitori della proteasi.

In seguito, utilizzare una siringa da un millilitro con ago da 21 gauge per omogeneizzare le cellule o i tessuti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta pulita da 1,5 millilitri. Incubare le cellule e i tessuti omogeneizzati a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Centrifugare a 3000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e risospendere ogni pellet in 300 microlitri del rispettivo buffer di sonica, integrato con inibitori delle proteasi. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta certificata priva di RNasi, DNasi e pirogeni per prevenire qualsiasi degradazione del DNA e incubare per 15-30 minuti sul ghiaccio.

Per frammentare la cromatina, sottoporre i campioni a sonificazione a quattro gradi Celsius utilizzando il programma di sonificazione appropriato per ogni materiale. Regolare la durata della sonificazione in base al fatto che il DNA verrà utilizzato per PCR o per sequenziamento. Successivamente, centrifugare i lisati cellulari sonificati per 10 minuti.

Trasferire il sopranatante, che rappresenta la cromatina in soluzione, da ogni campione in una provetta pulita da 1,5 millilitri e scartare il pellet. Prelevare un'aliquote di 1,5 microlitri da ogni campione e diluirla 1:10 con acqua. Valutare la densità ottica di tutti i campioni mediante spettrofotometro nano per determinare la concentrazione proteica.

Prima dell'immunoprecipitazione della cromatina, preparare le perle coniugate con proteina A lavandole come descritto nel testo del protocollo. In un tubo pulito da 1,5 millilitro, unire l'anticorpo prodotto contro le istoni modificati o i fattori di trascrizione, 20 microlitri delle perle coniugate con proteina A lavate e un millilitro del buffer C integrato con inibitori delle proteasi. Incubare i campioni su un agitatore rotante a 40 giri al minuto per almeno due ore a quattro gradi Celsius.

Lavare i complessi di perle con anticorpo tre volte con un millilitro di tampone C come descritto nel testo del protocollo. Preparare due provette, una contenente 150 microgrammi di cromatina e complessi di perle con anticorpo e l'altra contenente 150 microgrammi di cromatina e 20 microlitri di perle lavate. Aggiungere un millilitro di tampone C integrato con inibitori delle proteasi a ciascuna provetta e incubare i campioni su una ruota rotante a 40 RPM durante la notte a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'immunoprecipitazione notturna, posizionare i campioni nel supporto magnetico e recuperare il surnatante contenente il cromatina con anticorpo non legato. Eluire la proteina legata all'anticorpo aggiungendo 150 microlitri di tampone D1 ai materiali lavati. Incubare i campioni per 20 minuti a 50 gradi Celsius in un blocco riscaldante.

Dopo 20 minuti, rimuovere i campioni dal blocco riscaldante e posizionarli sul portaprovette magnetico. Recuperare il soprannatante in una provetta pulita da 1,5 millilitri e scartare le perle. Per invertire il crosslink, aggiungere cloruro di sodio 5 molar al soprannatante per ottenere una concentrazione finale di 200 millimolar.

Preparare un campione di input di cromatina in una provetta pulita da 1,5 millilitro. Utilizzare la stessa quantità di cromatina presente nel campione di immunoprecipitazione, portando a un volume finale di 150 microlitri con acqua libera da RNasi e DNasi e aggiungere cloruro di sodio 5 M fino a una concentrazione finale di 200 millimolare. Incubare i campioni tutta la notte a 65 gradi Celsius.

Il giorno seguente, rimuovere i campioni dal blocco riscaldante. Aggiungere EDTA a una concentrazione finale di 12,5 millimolare e Proteinasi K a una concentrazione finale di 250 microgrammi per millilitro e digerire a 55 gradi Celsius per due ore. Iniziare questa procedura preparando le perle.

Portare innanzitutto le perle a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Quindi vortexare accuratamente le perle e pipettare rapidamente un millilitro di perle in un tubo pulito da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo con le perle sul magnete per due o tre minuti, in modo che la soluzione si chiarifichi, e scartare il soprannatante.

Rimuovere il tubo dal magnete. Aggiungere un millilitro di EDTA 0,5 M e mescolare mediante breve vortex. Lavare le perle due volte in questo modo e scartare il soprannatante dopo l'ultimo lavaggio.

Rimuovere il tubo dal magnete. Aggiungere un millilitro di tampone E e risospendere lentamente le perle. Trasferire l'intera miscela in 50 millilitri di tampone E. Posizionare su un agitatore e lasciare mescolare lentamente a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, testare le perle leganti il DNA utilizzando un marcatore di DNA da un KB e tre diversi rapporti tra volume di perle e volume di DNA. È stato determinato che il rapporto 2,5/1 funziona meglio per il legame del DNA. Per utilizzare le perle nella purificazione del DNA, aggiungere 425 microlitri o 2,5 volumi di perle a ciascun campione di DNA e risospendere lentamente aspirando e dispensando circa 10 volte.

Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Posizionare sul magnete per cinque minuti. Quindi aspirare e scartare il soprannatante.

Lavare due volte con etanolo all'80% appena preparato, aggiungendo 600 microlitri in ogni provetta. Attendere un minuto, quindi aspirare e scartare il soprannatante. Eseguire una breve centrifugazione delle provette.

Posizionare i tubi sul magnete. Rimuovere le ultime gocce di etanolo e lasciare asciugare per un minuto a temperatura ambiente. Rimuovere il campione dal magnete ed eluire il DNA aggiungendo 20 microlitri di acqua priva di DNasi e RNasi. Vortexare.

L'elettroforesi su gel di agarosio ha rivelato le dimensioni dei frammenti di DNA ottenuti dopo la retro-cross-link di tutto il DNA sonificato estratto da cellule staminali embrionali di topo, corpi embrionoidi e tessuto cardiaco embrionale. Un esperimento di immunoprecipitazione della cromatina è stato progettato per analizzare la regolazione epigenetica dei geni coinvolti nella transizione epitelio-mesenchimale in cellule di tipo selvaggio o geneticamente mutate, durante la differenziazione delle cellule staminali verso un destino cellulare mesodermico. Il legame delle istoni modificati è stato monitorato mediante PCR dei promotori o degli enhancer dei geni E-Cadherina e Twist.

È stata eseguita una immunoprecipitazione sequenziale della cromatina su cromatina estratta da quattro linee cellulari di cellule staminali embrionali umane, utilizzando anticorpi contro un marcatore di attivazione della cromatina seguiti da anticorpi contro un marcatore di repressione. Questi marcatori vengono modificati quando le cellule sono esposte a morfogeni, ma risultano variabili a seconda delle linee cellulari di cellule staminali embrionali umane. Probabilmente a causa dei blastocisti originari da cui derivano.

L'immunoprecipitazione della cromatina può essere applicata anche alla cromatina estratta da specifiche regioni cardiache embrionali. Questa figura mostra regioni genomiche dei geni cardiaci Nkx2.5 e TBx5 arricchite per l'istone modificato e una regione genomica del gene specifico del marcatore Shox2 non arricchita e non espressa nel ventricolo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di valutare l'efficienza della sonica prima di iniziare il protocollo di immunoprecipitazione. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come Eth-ek-se-ek, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio indagando lo stato precedente della cromatina, se aperto o chiuso, oppure monitorando l'organizzazione dei nucleosomi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare qualsiasi regolazione epigenetica delle decisioni riguardanti il destino cellulare in qualsiasi tipo cellulare o organo embrionale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come possono essere eseguiti i saggi di immunoprecipitazione della cromatina.