Name: TRUE silenziamento genico: Proiezione di un Heptamer di tipo piccolo RNA guida Library per potenziali agenti terapeutici cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri un protocollo per lo screening di librerie sgRNA di tipo heptamer per identificare potenziali farmaci terapeutici contro le neoplasie del sangue. Questo metodo facilita la scoperta di nuovi agenti antitumorali mirati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da adattabile e senza soluzione di continuità la tecnologia dei programmi di trasferimento attraverso la R &amp; S, il Giappone Scienza e tecnologia Agenzia, il Fondo di promozione di ricerca di scienza dalla Promozione e l&#39;aiuto reciproco Corporation per Private Schools of Japan target-driven, e il numero JSPS KAKENHI sovvenzione 24.300.342 e 15H04313 .

1. Costruzione di un Heptamer tipo sgRNA libreria <ol><li> Selezionare un sottoinsieme di 16.384 (4) 7 sequenze 7-NT a meno che la libreria di fondo scala deve essere costruito. NOTA: Le sequenze possono essere casuale e / o progettati per indirizzare RNA cellulari specifici. Per questi ultimi, per strutture forcella simile al T-braccio tRNA in un RNA bersaglio con l&#39;ausilio di un idoneo programma di computer e / o visivo, e selezionare le sequenze complementari a sequenze 7-nt immediatamente a valle delle strutture forcella 4,10, 17,18. </li><li> Sintetizzare ciascuno dei heptamers selezionati come completamente 2&#39;- O -methylated, 5&#39;- e 3&#39;-RNA fosforilata con un sintetizzatore di DNA / RNA. Utilizzare il metodo fosforammidito sul vetro a pori controllati (CPG) di supporto, e lasciare la 5&#39;-terminale 4,4&#39;-dimethoxytrityl (DMT) gruppo protettore sulla nell&#39;ultimo ciclo (l&#39;aggiunta di fosfato al 5 &#39;) della sintesi 23. NOTA: sy personalizzatonthetic RNA può essere ottenuto anche da fornitori di oligonucleotidi. </li><li> Dopo il completamento dell&#39;ultimo ciclo di sintesi, trasferire il CPG con l&#39;oligonucleotide sintetizzato dalla colonna ad una fiala di vetro con tappo a vite di teflon-liner, aggiungere 1 ml di 29% di idrossido di ammonio, e incubare a 55 ° C per 8 ore per fendere l&#39;oligonucleotide dalla CPG e rimuovere i gruppi protettivi dalle basi e fosfati. </li><li> Evaporare idrossido di ammonio con un evaporatore centrifugo a 40 ° C e ri-sciogliere il oligonucleotide in 0,2 ml di 0,1 M n-hexylammonium acetato. </li><li> Purificare il oligonucleotide sintetico attraverso fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione usando una colonna di polistirene-divinilbenzene con un tampone contenente 10-50% acetonitrile / 0,1 M n-hexylammonium acetato. Eseguire la colonna a 2,0 ml / min per 25 min a 80 ° C. </li><li> Aggiungere 0,25-0,5 ml di acido acetico concentrato al campione frazionata (1-2 ml) per ottenere una soluzione al 20% di acido acetico, e incubate questa soluzione per 1 ora a temperatura ambiente per rimuovere il gruppo DMT. </li><li> Essiccare il campione con un evaporatore centrifugo a 40 ° C, ri-sciogliere in idrossido di ammonio 1 ml di 29%, e incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere la catena laterale di fosfato al 5 &#39;. </li><li> Ridurre il volume (1 ml) del campione a circa 0,3 ml con un evaporatore centrifugo a 40 ° C. </li><li> Dializzare campione intero concentrato contro acqua distillata (500 ml) utilizzando un tubo di dialisi di peso molecolare cut-off 1.000 a 4 ° C durante la notte. </li><li> Trasferire il campione dializzato dal tubo di dialisi ad una provetta da 1,5 ml con una pipetta, asciugare con un evaporatore centrifugo a 40 ° C, e successivamente ri-sciogliere in acqua acqua per iniezione-grade, il cui volume dovrebbe essere abbastanza piccolo per ottenere una soluzione superiore a 100 mM. </li><li> Misurare una densità ottica del campione di RNA a 260 nm con uno spettrofotometro e regolarne la concentrazione 100micron con l&#39;aggiunta di acqua acqua-per-iniezione-grade. Conservare la soluzione di RNA al di sotto dei -20 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Proiezione della Biblioteca sgRNA per vitalità cellulare <ol><li> Preparare 10 3 cellule / 99 ul / pozzetto (ad esempio, HL60 e RPMI-8226) su un piatto a 96 pozzetti in mezzi RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% e la soluzione di penicillina-streptomicina 1%. Preparare pozzetti contenenti i media solo per sottrazione del fondo. Per eliminare gli effetti di bordo, aggiungere acqua sterile per svuotare i pozzi che circondano i pozzetti dei campioni. </li><li> Aggiungere 1 ml di heptamer-tipo sgRNA (100 micron) disciolto in acqua acqua-per-iniezione-grade in ciascun pozzetto. Analizzare ogni sgRNA in triplice copia. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore umidificato per 3 giorni. </li><li> Aggiungere un volume appropriato di soluzione commercialmente disponibile WST-8 in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C nella stessa incubatore per 1 a 4 ore. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza di unT 450 nm con un lettore di micropiastre. NOTA: Nella maggior parte dei casi, la linearità tra assorbanza e il numero di cellule vitali sembra essere mantenuto a meno che il valore di assorbanza supera 1,0. </li></ol> 3. Valutazione di effettiva sgRNAs mediante citometria di flusso <ol><li> Preparare 10 3 cellule / 99 ul / pozzetto (ad esempio, HL60) su un piatto a 96 pozzetti in mezzi RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% e la soluzione di penicillina-streptomicina 1%. Preparare almeno 10 pozzetti per una sgRNA da testare. Per eliminare gli effetti di bordo, aggiungere acqua sterile per svuotare i pozzi che circondano i pozzetti dei campioni. </li><li> Aggiungere 1 ml di heptamer-tipo sgRNA (100 micron) disciolto in acqua acqua-per-iniezione-grade in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore umidificato per 3 giorni. </li><li> Raccogliere le cellule trattate con la stessa sgRNA da almeno 10 pozzetti in una provetta a 5 ml con una pipetta. Spin la provetta per 5 minuti in una centrifuga a 300 xg, e scartare i media. </li><li> Aggiungere 2 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) per il tubo, e risospendere le cellule. Spin la provetta per 5 minuti in una centrifuga a 300 xg, e scartare PBS. Aggiungere 150 ml di 1x annessina V tampone di legame al tubo, e risospendere le cellule. </li><li> Aggiungere 2 ml di ficoeritrina (PE) coniugata soluzione annessina V e 1 ml di soluzione di 7-aminoactinomycin D (7AAD) al tubo, mescolarle bene e incubare la provetta per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Analizzare il campione utilizzando un citofluorimetro 24. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

L'Università di Farmacia e Scienze della Vita Applicate di Niigata ha una domanda di brevetto in corso su un sottoinsieme di sgRNA di tipo eptamero.

Nella maggior parte dei casi, gli sgRNA di tipo eptamero completamente 2'-O-metilato, 5' e 3'-fosforilato disciolti in acqua per preparazioni iniettabili (nella concentrazione di 100 μM) sembrano essere stabili al di sotto di -20 °C per almeno un anno, a giudicare dalla loro attività di indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali. Tuttavia, la loro stabilità cambierebbe a seconda della loro sequenza, qualità e purezza. In alcuni casi, il 5'- o 3'-fosfato di una parte delle molecole di sgRNA sembra essere rimosso s...

TRUE silenziamento genico (denominato dopo tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silenziamento genico) è una delle tecnologie silenziamento genico RNA-diretto 1. Questa tecnologia è stata sviluppata sulla base di proprietà di tRNase Z L (o 3 &#39;tRNase), tRNA 3&#39; endoribonuclease lavorazione: può fendere qualsiasi RNA bersaglio in qualsiasi luogo previsto sotto la direzione di una guida piccoli RNA artificiale (sgRNA) riconoscendo un pre-tRNA-like o micro-pre-tRNA-come struttura formata tra l&#39;RNA bersaglio e la sgRNA 2-9. sgRNA, che di solito è 7-31 nt di lunghezza, è classificato in quattro gruppi, 5&#39;-mezzo-tRNA, RNA heptamer, 14-nt RNA lineare e RNA gancio. Abbiamo dimostrato l&#39;efficacia di TRUE silenziamento genico con l&#39;introduzione di vari sgRNAs artificialmente progettati in cellule viventi 10-15. Abbiamo anche dimostrato che sgRNAs possono essere presi dalle cellule without eventuali reagenti di trasfezione e può downregulate i loro livelli di RNA di riferimento e / o indurre l&#39;apoptosi nelle cellule tumorali umane 16 - 18. TRUE silenziamento genico sembra funzionare sul intracellulare e sistema di rete di regolazione genica intercellulare tramite tRNase Z L e sgRNAs naturali 19 - 21. Abbiamo costruito una libreria sgRNA contenente 156 heptamer tipo sgRNAs per la ricerca di potenziali sgRNAs heptamer tipo terapeutici per i tumori del sangue 22. Abbiamo proiettato per l&#39;effetto sulla vitalità delle cellule di mieloma e leucemia umana, e trovato che 20 di essi può efficientemente indurre apoptosi in almeno una delle linee di cellule di cancro. E 4 di loro hanno dimostrato di ridurre i tassi di crescita del tumore negli esperimenti di xenotrapianto del mouse. Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue. Il protocollo comprende comeper costruire la biblioteca sgRNA, come valutare l&#39;effetto di ogni sgRNA sulla vitalità delle cellule, e come valutare ulteriormente le sgRNAs efficaci mediante citometria di flusso. Analisi per l&#39;RNA bersaglio cellulare di sgRNA e la valutazione delle sgRNAs efficaci in modelli di xenotrapianto mouse possono essere eseguite secondo metodi convenzionali 17,22, anche se questi non sono inclusi in questo protocollo.

<table><tbody><tr><td>Personalizzato eptamero RNA</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Prep HC cartuccia</td><td>Transgenomica</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per iniezione</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina Soluzione</td><td>mista Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 Kit per conteggio cellulare a 180</td><td></td>pozzetti-8</tr><tr><td></td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 solution</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubo a fondo tondo</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso 7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

true silenziamento genico: proiezione di un heptamer di tipo piccolo rna guida library per potenziali agenti terapeutici cancro

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE silenziamento genico (chiamato dopo tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silenziamento genico) è uno dei geni RNA-regia tacere tecnologie, che utilizza un artificiale piccola guida RNA (sgRNA) per guidare tRNA 3 &#39;endoribonuclease elaborazione, tRNase Z L , di riconoscere un RNA bersaglio. sgRNAs possono essere presi dalle cellule senza reagenti di trasfezione e possono downregulate i loro livelli di RNA di riferimento e / o indurre l&#39;apoptosi nelle cellule tumorali umane. Abbiamo verificato una libreria sgRNA contenente 156 heptamer tipo sgRNAs per l&#39;effetto sulla vitalità delle cellule di mieloma e leucemia umana, e trovato che 20 di essi può efficientemente indurre apoptosi in almeno una delle linee di cellule di cancro. Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue. Il protocollo comprende come costruire la libreria sgRNA, come valutare l&#39;effetto di ogni sgRNA sulla vitalità delle cellule, e come further valutare le sgRNAs efficaci mediante citometria di flusso. Circa 2.000 colpi ci si aspetterebbe da versare lo screening della libreria sgRNA su vasta scala composta da 16.384 heptamers.

I sei heptamer tipo sgRNAs 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;-ACACACA-3&#39; (H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3&#39; (H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287), e 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) sono stati sintetizzati chimicamente come 2&#39;- O metil RNA contenente 5&#39;- e 3&#39;-fosfati. Questi sgRNAs sono stati esaminati per gli effetti sulla vitalità di una linea cellulare di leucemia uma...

Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue.

TRUE silenziamento genico: Proiezione di un Heptamer di tipo piccolo RNA guida Library per potenziali agenti terapeutici cancro

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

L'obiettivo generale di questo screening è individuare potenziali farmaci terapeutici contro i tumori del sangue. Iniziare la procedura selezionando un sottoinsieme di sequenze eptameriche. Le sequenze possono essere casuali oppure progettate per colpire specifiche RNA cellulari. Per colpire specifiche RNA cellulari, utilizzare un programma informatico appropriato per individuare strutture a forcina simili al braccio T in un RNA bersaglio. Selezionare sequenze complementari di sette nucleotidi immediatamente a valle della forcina. Utilizzando il metodo fosforammidite su vetro poroso controllato, o supporto CPG, sintetizzare ciascuno degli eptameri selezionati come RNA completamente metilato in posizione 2'-O, fosforilato alle estremità 5' e 3', mediante un sintetizzatore DNA-RNA. Lasciare il gruppo protettivo DMT terminale in posizione 5' nell'ultimo ciclo della sintesi. Al termine dell'ultimo ciclo, trasferire il CPG con l'oligonucleotide sintetizzato dalla colonna a un vial di vetro con tappo a vite rivestito in teflon. Aggiungere 1 mL di idrossido di ammonio al 29% e incubare il vial a 55

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Qui si usa una libreria umano esiRNA in un high-throughput schermo per geni coinvolti nella divisione cellulare. Dimostriamo come impostare e condurre un esiRNA schermi, e come analizzare e convalidare i risultati.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

Qui usiamo una libreria umano LentiPlex raggruppati e tradizionali metodi di sequenziamento per identificare gli obiettivi gene promuovere la sopravvivenza delle cellule. Dimostriamo come impostare e deconvolute uno schermo LentiPlex e convalidare i risultati.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L'invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento...

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

Il raggiungimento di un livello di sistemi di comprensione dei processi cellulari è un obiettivo di biologia cellulare moderna. Descriviamo qui le strategie per multiplazione reporter luciferasi di varia funzione cellulare end-point per interrogare la funzione del gene utilizzando genoma scala librerie di RNAi.

Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.

Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

Scopri un protocollo per lo screening di librerie sgRNA di tipo heptamer per identificare potenziali farmaci terapeutici contro le neoplasie del sangue. Questo metodo facilita la scoperta di nuovi agenti antitumorali mirati.

TRUE silenziamento genico: Proiezione di un Heptamer di tipo piccolo RNA guida Library per potenziali agenti terapeutici cancro

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