La conversione epigenetico come un metodo semplice e sicuro per ottenere cellule che secernono insulina da adulti fibroblasti cutanei

L'obiettivo generale di questa procedura è convertire i fibroblasti in cellule secernenti insulina senza indurre pluripotenza o utilizzare vettori retrovitali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa e in particolare nella terapia cellulare del diabete. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere un interruttore nel fenotipo senza indurre uno stato pluripotente stabile nelle cellule di conversione e senza vettori retrovirali.

A dimostrare la procedura sarà Georgia Pennarossa, post-doc nel nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, aggiungere 1,5 millilitri di gelatina suina sterile allo 0,1% alle piastre di Petri da 35 millimetri e lasciare ricoprire per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le biopsie della pelle umana con PBS integrato con una soluzione antimicotica antibiotica al 2%.

Successivamente, posizionare le biopsie in una capsula di Petri da 100 millimetri e tagliarle in frammenti di circa due millimetri cubi con bisturi sterili. Quindi, posizionare cinque o sei frammenti di pelle nella capsula di Petri da 35 millimetri pre-rivestita. Aggiungere una gocciolina di terreno fibroblastico su ogni frammento e coltivarli a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Dopo sei giorni di incubazione, scartare con cura i frammenti di tessuto. I fibroblasti dovrebbero iniziare a crescere dai frammenti di tessuto e iniziare a formare un monostrato cellulare. In questa procedura, coltivare i fibroblasti a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% fino alla confluenza dell'80%.

Quindi piastrate le cellule in nuovi piatti di coltura. Coltivali a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica e mantieni il rapporto di passaggio tra uno a due e uno a quattro, a seconda del tasso di crescita. Quindi, aggiungere lo 0,1% di gelatina suina alle piastre di coltura cellulare e lasciare ricoprire per due ore.

Rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso da 10 a 30 minuti prima di placcare i fibroblasti. Quindi, rimuovere il terreno di coltura dei fibroblasti dalle piastre di coltura. Lavare le cellule tre volte con PBS integrato con soluzione antimicotica antibiotica all'1%.

Quindi, aggiungere uno strato sottile di soluzione di tripsina-EDTA. Incubarlo a 37 gradi Celsius fino a quando il monostrato cellulare inizia a staccarsi dal fondo della piastra di coltura tissutale e le cellule si dissociano. Successivamente, diluire la sospensione cellulare con nove parti di terreno di coltura per fibroblasti per neutralizzare l'azione della tripsina.

Quindi, contare le cellule utilizzando una camera di conteggio al microscopio a temperatura ambiente. Calcolare il volume del terreno di coltura dei fibroblasti necessario per risospendere le cellule e ottenere la concentrazione cellulare di 7,8 volte 10 al 4° fibroblasto per centimetro quadrato. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 150 g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con un volume calcolato di terreno di coltura per fibroblasti. Successivamente, piastrellate le cellule su piastre pre-rivestite di gelatina allo 0,1% e coltivatele per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Il giorno zero, immediatamente prima dell'uso, preparare la soluzione madre di 5-aza-CR sciogliendo 2,44 milligrammi di 5-aza-CR in 10 millilitri di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM.

Sterilizzarlo mediante filtrazione. Successivamente, diluire un microlitro di soluzione madre di 5-aza-CR in un millilitro di terreno di coltura per fibroblasti. Per aumentare la plasticità cellulare, 24 ore dopo la placcatura cellulare rimuovere il terreno di coltura dai fibroblasti seminati.

Aggiungere una soluzione madre micromolare 5-aza-CR e coltivare per 18 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Il primo giorno, prepara HP medio fresco. Dopo l'incubazione con un micromolare 5-aza-CR, rimuovere il terreno e lavare le cellule tre volte con il terreno HP per assicurarsi che il 5-aza-CR venga risciacquato via.

Quindi, incuabare i fibroblasti trattati con 5-aza-CR con HP medium per tre ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Per monitorare l'efficacia del trattamento con 5-aza-CR, verificare la presenza di eventuali cambiamenti morfologici. Le cellule dovrebbero perdere la tipica morfologia allungata dei fibroblasti e acquisire una forma rotonda o ovale più piccola con nuclei ingranditi.

Dal primo al sesto giorno, preparare il terreno basale pancreatico e la soluzione madre di activina A. Quindi, coltivare i fibroblasti trattati con 5-aza-CR in terreno basale pancreatico integrati con una soluzione madre di activina A per sei giorni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e cambiare il terreno ogni giorno. Dal settimo all'ottavo giorno, preparare una soluzione madre di acido retinoico aggiungendo 16,6 millilitri di DMSO a 50 milligrammi di acido retinoico.

Colture di cellule in terreno basale pancreatico integrato con soluzione madre di activina A e soluzione madre di acido retinoico per due giorni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e cambio del terreno ogni giorno. Dal nono al 36° giorno, coltivare le cellule e il terreno basale pancreatico integrato con la soluzione madre ITS, B27 e BFGS e cambiare il terreno ogni giorno per i primi 15 giorni e rinfrescare il terreno a giorni alterni dal giorno 16 in poi. Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Questa figura mostra i cambiamenti morfologici che avvengono durante la differenziazione endocrina del pancreas. Dopo sette giorni di induzione, le cellule umane si organizzano gradualmente in cluster. In risposta all'aggiunta di acido retinoico, si riorganizzano in uno schema reticolare e si raggruppano in aggregati distinguibili.

Queste formazioni progrediscono con il tempo, reclutando cellule e aggregando colonie 3D ingrandite. Infine, le colonie diventano strutture sferiche che tendono a staccarsi e fluiscono liberamente nel terreno di coltura, ricordando le tipiche isole pancreatiche in vitro. Dopo 36 giorni di induzione pancreatica, i livelli globali di metilazione del DNA delle cellule umane convertite epigeneticamente sono tornati a quelli osservati nei fibroblasti non trattati.

La co-localizzazione di PDX1 con CPEP si osserva alla fine del periodo di conversione, mentre questi marcatori endocrini pancreatici sono completamente assenti nei fibroblasti non trattati. Questo grafico mostra la quantità di rilascio di insulina dalle cellule convertite epigeneticamente in risposta all'esposizione di 20 millimolari di D-glucosio e 20 millimolari di L-glucosio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 38 giorni se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa ricerca ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa per esplorare la terapia cellulare del diabete nell'uomo. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione su come convertire i fibroblasti in cellule secernenti insulina senza indurre pluripotenza né utilizzare vettori retrovirali.