Name: Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: laumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri un protocollo di immunostaining per embrioni di afide del pisello che aumenta la permeabilità dei tessuti e riduce lo sfondo. Questo metodo ottimizzato migliora la penetrazione degli anticorpi e la rilevazione delle proteine.

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Siamo grati a Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) per aver fornito l'anticorpo monoclonale 4D9, a Technology Commons (TechComm) del College of Life Science NTU per la microscopia confocale, a Hsiao-Ling Lu per la correzione delle bozze del manoscritto e a Chen-yo Chung per aver aiutato le riprese. CC ringrazia in particolare Charles E. Cook per aver fornito suggerimenti strategici e per l'editing critico del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (101-2313-B-002-059-MY3 e 104-2313-B-002-022-MY3 per GWL e CC) e dalla National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 per CC; 103R4000 per GWL).

1. Cultura di Afidi NOTA:. Il ceppo di laboratorio del partenogenetica vivipara pisello afide Un pisum sono stati originariamente raccolti nel centro di Taiwan ed è stato allevato su piante ospiti (sativum giardino di piselli Pisum o fava favino) sotto-giorno lungo fotoperiodo per più di 300 generazioni (una generazione: ~ 10 giorni). <ol><li> Germinazione dei semi <ol><li> Mettere a bagno i semi di piante ospiti in acqua di rubinetto per 3-5 giorni a temperatura ambiente. Riempire con acqua fresca una volta al giorno. NOTA: In alternativa, mettendo semi di piante ospiti direttamente nel terreno umido può indurre la germinazione pure. </li><li> Crescere 10 semi in germinazione in una piccola pentola (alto 9 cm di diametro x 7 cm) con terreno nella camera di crescita sotto fotoperiodo 16 ore luce / 8 ore buio a 20 ° C. </li><li> Circa 10 giorni dopo l&#39;inizio della crescita, trasferire gli afidi sulle piante la cui altezza è più di 8 cm. </li></ol></li><li> Trasferimento di Afidi <ol&gt; <li> Mantenere ogni vaso di piante all&#39;interno di un bicchiere di vetro da 1 L, trasferire 8 afidi adulti sulle piante utilizzando un pennello, e quindi sigillare il bicchiere con una copertura permeabile all&#39;aria come maglia garza per evitare la fuoriuscita di afidi. </li><li> Incubare afidi in una camera di crescita a fotoperiodo 16 ore luce / 8 ore buio a 20 ° C. Acqua ogni vaso di piante una volta al giorno. </li><li> Per ottenere la prossima generazione di afidi, ribadire passi 1.1.3-1.2.2 dieci giorni dopo il trasferimento afide primario. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione e fissazione di ovaie <ol><li> Appena preparare 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato salino (PBS) come tampone fissazione. </li><li> Riempire un pozzetto di una piastra spot con PFA (circa 500 ml), posizionare la lastra sotto un microscopio stereo a basso ingrandimento, e immergere un afide adulti all&#39;interno della PFA per la dissezione. </li><li> Sezionare ovaie tenendo la testa e all&#39;addome, con un set di pinze, tagliare aperto dorsalecuticole dell&#39;addome, e trascinando le ovaie lontano dalla cavità addominale. </li><li> Fissare tre coppie di ovaie in una provetta da 1,5 ml contenente 1 ml di PFA a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Buffer fissazione decantare con un trasferimento pipetta (vetro o monouso) e poi lavare le ovaie con 0,2% TritonX-100 in PBS 1x (PBST) 3 volte per 10 minuti ciascuno. Lieve tremante di un mixer / rotatore (angolo di rotazione: 60 ° (F60) / Velocità di rotazione: 8 giri) è consigliato sia per la fissazione e il lavaggio. </li></ol> 3. Il trattamento con proteinasi K (PK) per aumentare la permeabilità dei tessuti embrionali NOTA: il trattamento PK viene applicata agli embrioni da estensione di banda germe in avanti (fase 11 di sviluppo). Per gli embrioni più giovani, questo passaggio è facoltativo. <ol><li> In serie diluire la soluzione stock di PK (10 mg / ml) con PBS 1x alla concentrazione di lavoro 1 ug / ml. </li><li> Incubare ovaie con 1 mg / ml di PK (circa 500 ml) per 10 minuti con lieve agitazione. </li><li> Decantare PK solution e quindi lavare le ovaie con 700 ml di glicina (2 mg / ml) 3 volte per 5 minuti ciascuno. </li><li> Lavare le ovaie con lo 0,2% PBST due volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Fissare le ovaie ancora con tampone fissazione per 15 minuti a temperatura ambiente con lieve agitazione. </li><li> Gettare il surnatante e lavare le ovaie con lo 0,2% PBST due volte per 10 minuti ciascuno. </li></ol> 4. Metanolo incubazione per Soppressione della perossidasi endogena (POD) di attività NOTA: Il metanolo incubazione non si applica agli embrioni sottoposti a Colorazione falloidina o anticorpi epitopi che sono il metanolo sensibili. <ol><li> Di serie disidratare ovaie con diversa percentuale di metanolo in PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) incubando ovaie a ciascuna concentrazione della soluzione di metanolo per 10 min con blanda agitazione. </li><li> Disidratare ovaie con 100% di metanolo per 1 ora a temperatura ambiente con lieve agitazione. NOTA: I risultati soddisfacenti di colorazione potrebbero ancora essere ottenuti da tessuti di afidi che sono stati memorizzati nel 100% di metanolo a -20 &amp;# 176; C per un mese. </li><li> Di serie reidratare ovaie con diversa percentuale di metanolo in PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) incubando ovaie a ciascuna concentrazione della soluzione di metanolo per 10 min con blanda agitazione. </li></ol> 5. anticorpi colorazione <ol><li> Diluire la soluzione 10x blocco dal set tampone-DIG (DIG-B) a 1x. NOTA: La soluzione di saturazione 1x DIG-B è più efficace per ridurre la colorazione di fondo del reagente standard blocco composto 5% (v / v) di siero di capra normale (NGS) e 0,5% (v / v) di albumina di siero bovino (BSA ) in 0,2% PBST. </li><li> Incubare le ovaie con la soluzione 1x DIG-B di blocco per da 2,5 a 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con lieve agitazione. NOTA: Per tre coppie di ovaie in una provetta da 1,5 ml, 200 ml è il volume minimo per il blocco di campione e colorazione anticorpale. </li><li> Decantare il surnatante e sostituirlo con soluzione fresca 1x DIG-B blocco contenente l&#39;anticorpo primario adeguato dilutistechiometrica. Colorare le ovaie per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con lieve agitazione. NOTA: Per l&#39;esperimento descritto qui, utilizzare i seguenti diluizioni ottimali di anticorpi primari: (1) ApVas1 anticorpo: 1: 500 per la colorazione cromogenico, 1:50 per immunofluorescenza; (2) anti-α tubulina anticorpo: 1: 500; (3) l&#39;anticorpo monoclonale 4D9: 01:25. </li><li> Lavare le ovaie con lo 0,2% PBST 4 volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Incubare ovaie con soluzione di saturazione 1x DIG-B per 1 ora a temperatura ambiente con lieve agitazione. </li><li> Decantare il surnatante e sostituirlo con fresco soluzione DIG-B blocco 1x contenente anticorpo secondario in adeguato rapporto di diluizione. Colorare le ovaie per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con lieve agitazione. <ol><li> Utilizzare i seguenti rapporti di diluizione di anticorpi secondari: (1) Per immunofluorescenza: 1: 500 per Alexa Fluor 633 capra anti-IgG di coniglio o Alexa Fluor 488 capra anti-IgG di topo; (2) Per la colorazione cromogeno: 1: 200 per IgG anti-coniglio di capra biotinilato. NOTA: L&#39;anticorpo secondario biotinilato è applicata per interagire con l&#39;avidina-biotina-complesso (ABC) nella (cromogenico) rilevazione substrato a base, attraverso cui i segnali di colorazione sono notevolmente amplificati. </li><li> Per immunofluorescenza, effettuare colorazione al buio perché l&#39;anticorpo secondario è sensibile alla luce. </li></ol></li><li> Lavare anticorpo secondario con lo 0,2% PBST 4 volte per 10 minuti ciascuno. </li></ol> 6. nucleare e F-actina Colorazione NOTA: Questo si applica solo per immunofluorescenza. <ol><li> Stain ovaie con lo 0,2% PBST contenente DAPI (2 ng / mL) e falloidina-TRITC (100 nM) per 2 ore a RT nel buio. </li><li> Lavare le ovaie con lo 0,2% PBST 4 volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Incubare ovaie con il mezzo di montaggio O / N a 4 ° C con lieve agitazione. </li></ol> 7. Sviluppo di segnale NOTA: Questo si applica solo per la colorazione cromogenico. <ol><li> Preparare 100 ml direagente avidina-biotina-complesso (ABC) per migliorare i segnali con l&#39;aggiunta di 1 ml di reagente A (avidina) in 98 ml di 0,2% PBST, mescolando bene con dolce pipettaggio, e l&#39;aggiunta di 1 ml di Reagente B (biotina coniugato con perossidasi di rafano ), seguita da miscelazione immediata. Incubare la miscela per 30 min a temperatura ambiente con delicata agitazione. </li><li> Incubare ovaie (comprese le camere di uovo dissociati) nella miscela dei reagenti A e B per 30 minuti a RT con lieve agitazione. </li><li> Lavare la miscela dei reagenti A e B con lo 0,2% PBST 4 volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Trasferimento ovaie sommersi in PBST a un pozzo sul piatto posto con un contagocce di plastica. </li><li> Preparare la soluzione di substrato di 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB): sciogliere una compressa DAB più un&#39;altra contenente urea perossido di idrogeno in 1 ml di DDH 2 O tramite vortex vigorosa per 1 min. NOTA: DAB, un substrato di precipitazione di perossidasi, è un cromogeno popolare per immunocolorazione. Produce un brproprio e insolubile precipitato dopo essere ossidato dalla perossidasi. Segnali deboli può essere migliorata con l&#39;aggiunta di cloruro di nichel per la soluzione di substrato (concentrazione finale 0,05-0,08%). </li><li> Rimuovere la soluzione PBST rimanente nel pozzo e riempire con 100 microlitri della soluzione di substrato DAB per lo sviluppo del segnale. </li><li> Monitorare l&#39;intensità dei segnali in un microscopio stereo a basso ingrandimento. </li><li> Arrestare reazioni rimuovendo la soluzione DAB, seguita da riempimento con PBS 1x immediatamente. Ripetere il lavaggio due volte. </li><li> Trasferimento ovaie di nuovo al tubo 1,5 ml e poi lavare con PBS 1x o PBST due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Incubare ovaie in un mezzo a base di montaggio glicerolo (70% glicerolo) O / N a 4 ° C con lieve agitazione. </li></ol> 8. Montaggio del afide Embrioni NOTA: Lo spessore di embrioni afidi varia tra stadi di sviluppo. Strategie di montaggio sono quindi modificati per adattarsi precoce (germaria e palchi 0-10), Mid (stadi11-18), e in ritardo embrioni (stadi 19-20), di cui sia dimostrato in Figura 2B - D. Messa in scena embrionali seguito Miura et al. 12 <ol><li> Trasferimento ovaie insieme con mezzo di montaggio per vassoio di cella con un contagocce di plastica e osservare i campioni al microscopio stereo a basso ingrandimento. </li><li> Tagliare i calici associati al ovidotto laterali con perni di insetti e quindi trasferire una ovariole isolato di un bicchiere vuoto bene con un contagocce. Portare il volume finale di 50-100 microlitri con mezzo di montaggio. </li><li> Trasferire un ovariole sul vetrino con un contagocce di vetro e poi sezionare camere uovo con perni di insetti. NOTA: per gli embrioni di età superiore a 6 fase di sviluppo, la separazione di camere d&#39;uovo è suggerito; per germaria e le prime due camere uovo di età inferiore ai 6 fase, la separazione è opzionale. </li><li> Riposizionare una camera di uovo sezionato ad un vetrino pulito con un contagocce di vetro. </li><li> Metti un coprioggetto (dimensioni: 22 x 22mm) sui germaria sezionato o camere d&#39;uovo (che contiene gli embrioni in fasi 1-10 di sviluppo) lentamente per evitare le bolle. <ol><li> Camere di Monte d&#39;uovo (che contiene gli embrioni in fasi 11-18 di sviluppo) su una diapositiva con unilaterale ponte coprioggetto e inserire un altro vetrino (dimensioni: 18 x 18 mm) sulla parte superiore del campione. </li><li> Camere di Monte d&#39;uovo (che contiene gli embrioni di età superiore ai 19 della fase di sviluppo) su una diapositiva con doppia faccia ponte coprioggetto e inserire un altro vetrino (dimensioni: 18 x 18 mm) sulla parte superiore del campione. </li></ol></li><li> Riempire lo spazio sotto il vetrino superiore con supporti di montaggio per evitare l&#39;essiccamento del campione. </li><li> Lievemente rotolare l&#39;embrione facendo scorrere il vetrino per ottenere il giusto orientamento per l&#39;osservazione. </li><li> Sigillare attorno al bordo del coprioggetto (compresi i coprioggetti ponte) con smalto. </li></ol> Analisi 9. Imaging <ol><li> Fotografia contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini di tutto il montaggio degli embrioni con un compound microscopio dotato ottica DIC e una lente obiettivo secca (10X, 20X, 40X) collegato ad una telecamera. Installare il software per il trasferimento delle immagini tra la fotocamera e il computer utilizzando le istruzioni del produttore. </li><li> Acquisire le proiezioni degli embrioni fluorescente con confocale a scansione laser microscopio 14. Seguire le istruzioni del produttore per fotografare, z-stacking, e 3D proiettando con software di imaging. <ol><li> Ruotare la slitta a testa in giù, trovare il campione montato con 10X obiettivo, e il giro della zona del campione con una multa penna-based oliato. NOTA: Questo rende più facile l&#39;identificazione del campione durante la ricerca di esso attraverso gli obiettivi di un microscopio confocale. </li><li> Aggiungere una goccia di olio sulla parte superiore della zona coprioggetto cui lato opposto è etichettato come descritto in 9.2.1. </li></ol></li><li> Trova il piano focale a 40X obiettivo ad immersione in olio poi passare a un obiettivo ad immersione in olio 63X. Spostare manualmente il controllo del fuoco multa e farewn per catturare la migliore piano focale. NOTA: Per osservare i dettagli strutturali di germaria e dei primi embrioni, si consiglia di utilizzare 40X obiettivi o quelli con maggiore ingrandimento. </li><li> Eseguire la scansione del embrione in diversi canali di eccitazione e ottenere un&#39;immagine z-stack. NOTA: Per i tessuti afide del pisello, ridurre lo spessore di ogni sezione ottica fino a 1,5 micron o inferiore. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo identificato condizioni ottimali critiche dell&#39;immunocolorazione successo nel pisello afide A. Pisum, un organismo modello emergente per studi di genomica e di sviluppo 3,15. Condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e ridurre la colorazione di fondo migliorato l&#39;intensità e la specificità dei segnali. Si differenziano dai protocolli standard per immunocolorazione in altri modelli animali nei passaggi per la creazione di pori nella membrana cellulare e ...

Gli afidi sono insetti hemipteran con piccoli (1-10 mm) corpi morbidi. Si nutrono di piante succhiando linfa floema con apparato boccale di piercing. Inoltre, si basano su un batterio endosimbiontica obbligato, Buchnera aphidicola, per sintetizzare aminoacidi essenziali che sono carenti nella dieta linfa floematica. Afidi hanno una storia di vita complesso che comprende partenogenetica riproduzione vivipara durante la primavera e l&#39;estate fotoperiodo lungo il giorno e sessuale riproduzione ovipara innescato dal fotoperiodo breve-day, durante il quale essi definite un numero limitato di uova svernanti 1,2. In primavera queste uova si schiudono per produrre la prima generazione di tutto al femminile afidi (fundatrices), dopo molti cicli di riproduzione partenogenesi fino all&#39;autunno. La partenogenesi congiunturale afidi, dove le fasi asessuata e sessuale si alternano nel ciclo di vita annuale, è stato considerato come un 1,2 novità evolutiva. Nei afidi vivipari partenogenetiche, Embriogenesi avviene entro le camere di uova dei tubuli ovariche (ovarioli). Al contrario, gli embrioni sessuali ovipare sviluppano nelle uova fecondate. A parte la plasticità riproduttiva, gli afidi possono visualizzare transgenerazionale ala polyphenism: in risposta a segnali di sovraffollamento e minacce predatori, le femmine asessuate unwinged possono vivipare produrre prole alato per la migrazione a lunga distanza. Pubblicazione della sequenza del genoma del afide del pisello Acyrthosiphon pisum -la prima sequenza del genoma di un basale insetti permette emimetaboli un&#39;ulteriore esplorazione della plasticità riproduttiva, ala polyphenism, e altre funzioni, tra cui le interazioni insetto-pianta, vectoring virale e simbiosi di afidi su un molecolare base 3. Oltre al genoma sequenziato, strumenti per la caratterizzazione espressione e funzione del gene sono necessari per la promozione del pisello come modello maturo organismo 4. Abbiamo descritto robusti protocolli di tutto-mount <em&gt; in ibridazione in situ per rilevare l&#39;espressione di mRNA in embrioni di afidi 5-7. RNA interference (RNAi) via a doppio filamento iniezione di RNA e l&#39;alimentazione è stato utilizzato per il silenziamento genico in ninfe afidi e negli adulti, ma condizioni stabili per gene atterramento negli embrioni non sono ancora stati segnalati 8-10. Immunocolorazione, un approccio a base di anticorpi in grado di rilevare l&#39;espressione della proteina in campioni prima e dopo RNAi smontabile, è stata eseguita su embrioni pisello afide 11-13. Tuttavia, l&#39;aumento di permeabilità dei tessuti e l&#39;eliminazione di colorazione di fondo sono ancora insoddisfacenti utilizzando protocolli standard per immunocolorazione negli embrioni vivipare asessuate del pisello. Per esempio, abbiamo scoperto che la penetrazione di anticorpi ai tessuti diminuita negli embrioni gastrulating (stadi 8-10) e che gli embrioni con germogli arti morfologicamente identificabili (fasi 13-14) erano appena permeabile all&#39;anticorpo. Inoltre, la colorazione di fondo è stato visualizzato nel viviparo asessuatanoi pisello embrioni afidi colorate usando anticorpi contro il marcatore linea germinale Vasa così come quella contro la proteina engrailed / Invected espressa nei segmenti embrionali 12,13. In realtà la colorazione di fondo era ancora chiaramente visibile in embrioni colorati con il solo anticorpo secondario. Al fine di aumentare la permeabilità senza danneggiare l&#39;integrità dei tessuti afidi, abbiamo titolato accuratamente la concentrazione di proteinasi K e determinati condizioni ottimali per la digestione tessuto su embrioni afidi. Per evitare marcatura non specifica del pisello, abbiamo cercato composti che potrebbero bloccare efficacemente embrioni e sopprimere l&#39;attività di perossidasi endogena (POD), un enzima impiegato per amplificare segnali durante la immunocolorazione. Un reagente di blocco fornita da un digossigenina (DIG) gruppo di tamponi based, piuttosto il siero di capra normale usato tradizionalmente (NGS) / albumina di siero bovino (BSA), ha ridotto significativamente la colorazione di fondo. Inoltre, il metanolo è stato trovato per INHIbit dell&#39;attività POD endogena più efficacemente di perossido di idrogeno (H 2 O 2). I dettagli riguardanti queste condizioni specifiche di afidi per immunocolorazione sugli embrioni verranno descritti nelle sezioni seguenti.

<table><tbody><tr><td>30% di idrogeno perxidasi (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Per lo sbiancamento della perossidasi endogena degli embrioni.</td></tr><tr><td>4' 6-diamidino-2-fenil-indolo dicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Per l'etichettatura del DNA a doppio filamento. TOSSICO. Indossare guanti, erogare in piccole aliquote e tassare per ridurre al minimo l'esposizione</td></tr><tr><td>4D9 anticorpo monoclonale di topo anti-ingrailed/invected</td> Studi <td>sullo sviluppo banca degli ibridomi</td><td>AB_528224</td><td>Per etichettare i segmenti in via di sviluppo dell'embrione.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio ApVas1</td><td>Il nostro laboratorio</td><td>N/A</td><td>Per la marcatura della proteina Vas1 specifica della linea germinale dell'afide negli embrioni. Questo anticorpo è stato prodotto dal nostro laboratorio.</td></tr><tr><td>Austerlitz Spilli per insetti</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Per separare ogni camera dell'uovo da un ovariolo. Taglia 000, SMALTATO NERO.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi.</td></tr><tr><td>Fotocamera collegata al microscopio composto</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Per la fotografia di embrioni di afidi.</td></tr><tr><td>Vassoio colorimetrico 8 celle</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Per lo sviluppo del segnale di colorazione degli embrioni di afidi. Diametro 95 x 57 mm, profondità cella 2 mm.</td></tr><tr><td>Microscopio composto con ottica DIC Leica</td><td>Microsystems</td><td>DMR</td><td>Per la fotografia di embrioni di afidi montati sui vetrini.</td></tr><tr><td>Set di tamponi DIG Wash and Block</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi. Abbiamo diluito la soluzione bloccante 10x in 1x come reagente bloccante.</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Per la dissezione delle ovaie dagli afidi. Codice produttore n. 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Contagocce in vetro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per il trasferimento di ovaie di afidi dalla piastra di splot alle provette. 150 mm di lunghezza totale e 5 3/4" di lunghezza della punta.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Per la pulizia degli embrioni di afidi e il montaggio.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Per bloccare l'attività enzimatica della proteinasi K (PK).</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG coniugato Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Per il rilevamento di anticorpi primari dal topo.</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG coniugato Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Per il rilevamento di anticorpi primari dal coniglio.</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI apparecchiature da laboratorio</td><td>RM-2M</td><td>Per migliorare la reazione dei reagenti con le ovaie.</td></tr><tr><td>Microscopia confocale a scansione laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Per la fotografia di embrioni di afidi montati sui vetrini con tag florecente.</td></tr><tr><td>metanolo&nbsp;</td><td>Burdick e Jackson</td><td>AH2304</td><td>Per lo sbiancamento della perossidasi endogena degli embrioni.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>Per il montaggio di embrioni. Bordi rettificati SUPERFROST, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Per il montaggio di embrioni sui vetrini. Dimensioni 18 x 18 mm. Spessore n. 1 (da 0,13 a 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Per il montaggio di embrioni sui vetrini. Dimensioni 22 x 22 mm. Spessore n. 1 (da 0,13 a 0,16 mm)</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale di topo anti-alfaTubulina (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Per l'etichettatura della distribuzione dell'alfa-tubulina delle cellule.</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per sigillare i vetrini coprioggetti sui vetrini.</td></tr><tr><td>Siero di capra normale (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Per la fissazione delle ovaie degli afidi.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Per l'etichettatura della distribuzione di F-actina sugli embrioni.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Come soluzione isotonica per ovaie afidi.</td></tr><tr><td>Contagocce</td><td>in plastica N/A</td><td>N/A</td><td>Per il trasferimento delle ovaie degli afidi dalla provetta al vassoio cellulare. Formato 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Per creare pori (punzonatura) sulla membrana cellulare e facilitare l'accesso degli anticorpi.</td></tr><tr><td>Piastra spot in Pyrex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per la dissezione e le reazioni cromatiche delle ovaie degli afidi al microscopio. Ogni cavità con diametro 22 mm e&nbsp; profondità 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidina (DAB) compresse&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Per lo sviluppo di segnali substrati. Chiamato anche set di compresse con substrato di perossidasi DAB.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Per la dissezione e l'osservazione delle ovaie degli afidi.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Per la creazione di pori (punzonatura) sulla membrana cellulare.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (IgG di coniglio)</td><td>Laboratori vettoriali</td><td>PK-6101</td><td>Per il miglioramento del segnale. Compresi gli anticorpi secondari IgG di capra biotinilata, i reagenti A e B.</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio VECTASHIELD</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>Per la pulizia di embrioni di afidi e il montaggio.</td></tr></tbody></table>

individuazione di condizioni critiche per immunostaining nel pisello afide embrioni: l&#39;aumento del tessuto permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Il Acyrthosiphon pisum pisello afide, con un genoma sequenziato e abbondante plasticità fenotipica, è diventata un modello emergente per studi di genomica e di sviluppo. Come altri afidi, Un. Pisum propagarsi rapidamente tramite riproduzione vivipara partenogenetica, dove gli embrioni si sviluppano all&#39;interno di camere d&#39;uovo in maniera catena di montaggio nel ovariole. In precedenza abbiamo stabilito una solida piattaforma di tutto il montaggio ibridazione in situ che consente il rilevamento di espressione di mRNA negli embrioni afidi. Per analizzare l&#39;espressione della proteina, però, i protocolli stabiliti per immunocolorazione i ovarioli di afidi vivipari asessuati non ha prodotto risultati soddisfacenti. Qui riportiamo condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e la diminuzione colorazione di fondo, entrambi i quali erano i problemi quando l&#39;applicazione di approcci consolidati. Ottimizzazioni includono: (1) incubazione di proteasi K (1 mg / ml, 10 min), che è stato trovato f essenzialeo la penetrazione degli anticorpi negli embrioni metà e in fase avanzata di afidi; (2) la sostituzione di siero normale di capra / albumina sierica bovina con un reagente bloccante fornito da un digossigenina (DIG) a base di tamponamento impostato e (3) l&#39;applicazione di metanolo piuttosto perossido di idrogeno (H 2 O 2) per candeggio perossidasi endogena; che ha ridotto in modo significativo la colorazione di fondo nei tessuti afidi. Queste condizioni critiche ottimizzate per immunostaining permetteranno efficace rilevazione dei prodotti genici negli embrioni di A. Pisum e altri afidi.

In questo studio, abbiamo eseguito tutto il monte-immunocolorazione sugli embrioni di afidi pisello asessuati (Figura 1A). Queste femmine producono prole per partenogenesi e vivipare. Questi embrioni di sesso femminile si sviluppano all&#39;interno di camere d&#39;uovo dei tubuli ovariche (ovarioli) (Figura 1B e Figura 2A). Prima di microscopia, i ovarioli sezionato sono gli obiettivi di colorazione; tuttavia, è necessar...

Viene presentato un protocollo di immunocolorazione a montaggio intero su embrioni di afidi, in cui vengono affrontate le condizioni critiche per ridurre la colorazione di fondo e aumentare la permeabilità tissutale. Queste condizioni sono state sviluppate specificamente per il rilevamento efficace dell'espressione proteica nei tessuti embrionali degli afidi.

Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l&#39;aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di immunomarcatura è rilevare l'espressione proteica negli embrioni di afide. Vengono identificate condizioni critiche che aumentano la permeabilità del tessuto e riducono la marcatura di fondo, entrambe problematiche persistenti nella marcatura dei tessuti embrionali degli afidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce condizioni specifiche per una penetrazione efficace degli anticorpi e per la riduzione della marcatura di fondo, aspetti che di solito non sono descritti in un protocollo standard di immunomarcatura.Abbiamo avuto per la prima volta questa idea di misurazione mentre studiavamo come vengono specificate le cellule germinali in un afide del pisello, un modello di insetto utilizzato per studi genomici e ambientali. La ceppa di laboratorio dell'afide del pisello, a. pisum, è stata originariamente raccolta nel centro di Taiwan ed è stata allevata su piante ospiti per oltre 300 generazioni.Per far germinare, immergere i semi delle piante ospiti in acqua del rubinetto per tre-cinque giorni a temperatura ambiente. Rabboccare con acqua fresca una volta al giorno. Coltivare dieci semi in germinazione in un vasetto piccolo con terriccio nella camera di crescita con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio, a 20 gradi Celsius.Circa 10 giorni dopo l'inizio della crescita, l'altezza delle piante è solitamente superiore a otto centimetri. Mantenere ogni vaso di piante all'interno di un becher di vetro da un litro e trasferire gli afidi adulti sulle piante utilizzando un pennello. Quindi, sigillare il becher con un coperchio permeabile all'aria, come una maglia di garza, per impedire agli afidi di scappare.Incubare gli afidi in una camera di crescita con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio, a 20 gradi Celsius, innaffiando ogni giorno un vaso di piante. Riempire un pozzetto di una piastra per gocce con circa 500 microlitri di paraformaldeide al 4 percento. Posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico a basso ingrandimento ed immergere un afide adulto nella paraformaldeide per la dissezione.Dissezionare le ovaie tenendo la testa e l'addome con un paio di pinzette, tagliando la cuticola dorsale dell'addome e staccando le ovaie dalla cavità addominale. Successivamente, fissare tre coppie di ovaie in un tubo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di paraformaldeide a temperatura ambiente per 20 minuti, con agitazione delicata su un agitatore. Rimuovere il buffer di fissazione con una pipetta di vetro, quindi lavare le ovaie con PBST tre volte per 10 minuti, con agitazione delicata.Per trattare gli ovari, incubarli prima con Proteinasi K per 10 minuti con agitazione delicata per aumentare la permeabilità dei tessuti embrionali. Al termine dell'incubazione, eliminare la soluzione di Proteinasi K, quindi lavare gli ovari con 700 microlitri di glicina per tre volte, per cinque minuti ciascuna. Successivamente, lavare gli ovari con PBST due volte, per 10 minuti ciascuna.Fissare nuovamente le ovaie con il buffer di fissazione per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Per sopprimere l'attività della perossidasi endogena, disidratare in serie le ovaie con diverse percentuali di metanolo in PBST allo 0,2 percento, nei rapporti volumetrici di uno a tre, uno a uno e tre a uno, quindi incubare ulteriormente le ovaie con metanolo al 100 percento per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, reidratare in serie le ovaie, come indicato nel protocollo descritto nel testo.Per tre paia di ovaie in un tubo da 1,5 millilitri, 200 microlitri è il volume minimo per il blocco del campione e la colorazione con anticorpi. Incubare le ovaie con la soluzione di blocco DIG-B 1x per quattro ore a temperatura ambiente, oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius, con agitazione delicata. Al termine dell'incubazione, eliminare il soprannatante e sostituirlo con una soluzione di blocco DIG-B 1x fresca, contenente l'anticorpo primario al rapporto di diluizione appropriato.Colorare le ovaie per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius con un leggero agitazione. Dopo aver lavato le ovaie come descritto nel protocollo testuale, scartare il soprannatante e sostituirlo con una soluzione di bloccaggio DIG-B 1x fresca contenente l'anticorpo secondario al rapporto di diluizione appropriato, quindi colorare le ovaie come in precedenza. Per la colorazione immunofluorescente, eseguire la colorazione al buio, poiché l'anticorpo secondario è sensibile alla luce.Lo spessore degli embrioni di afide varia in base alle fasi di sviluppo. Le strategie di montaggio vengono quindi modificate per adattarsi agli embrioni precoci, medi e tardivi. Trasferire le ovaie, insieme al mezzo di montaggio, nel vassoio cellulare utilizzando una pipetta di plastica e osservare i campioni al microscopio stereoscopico con ingrandimento basso.Tagliare i callosi associati all'ovidotto laterale utilizzando aghi per insetti, quindi trasferire un'ovariole isolata in una camera di vetro vuota mediante una pipetta. Portare il volume finale a 50-100 microlitri utilizzando mezzo di montaggio. Successivamente, trasferire un'ovariole sul vetrino con una pipetta di vetro.Dissezionare le camere ovariche utilizzando spilli per insetti. Per embrioni con uno stadio di sviluppo superiore allo stadio sei, si consiglia la separazione delle camere ovariche. Per i germari e le prime due camere ovariche, la separazione è facoltativa.Spostare una camera ovarica dissezionata su un vetrino pulito utilizzando una pipetta di vetro. Per gli embrioni nelle fasi da uno a 10 dello sviluppo, posizionare lentamente un coprioggetto sulle germaridi o sulle camere ovariche dissezionate per evitare bolle d'aria. In alternativa, per gli embrioni nelle fasi da 11 a 18 dello sviluppo, montare le camere ovariche su un vetrino con un ponte di coprioggetto su un solo lato, quindi posizionare un altro coprioggetto sopra il campione.Per embrioni con uno stadio di sviluppo superiore allo stadio 19, montare le camere dell'uovo su un vetrino utilizzando un ponte costituito da un'ansa biconica, e posizionare un altro coperchio sopra il campione. Successivamente, riempire lo spazio sotto il coperchio superiore con un mezzo di montaggio per evitare che il campione si secchi. Arrotolare leggermente il coperchio superiore per ottenere l'orientamento corretto per l'osservazione.Infine, sigillare i bordi dei vetrini, inclusi i vetrini ponte, con smalto per unghie prima di eseguire l'analisi delle immagini, come descritto nel protocollo testuale. Qui sono mostrate una coppia di ovari dissezionati da un adulto femmina. Un ovariole è composto da un germario, da uno a due siti O e da cinque a sette embrioni, tutti alloggiati all'interno di camere ovariche in modo simile a una catena di montaggio.Dopo la fissazione con paraformaldeide, si raccomanda vivamente la digestione delle ovaie in una soluzione di Proteinasi K a una concentrazione di un microgrammo per millilitro per 10 minuti. I risultati della colorazione mostrano che l'intensità del segnale aumenta significativamente negli embrioni trattati con Proteinasi K. L'incubazione degli embrioni nella soluzione di blocco proveniente da un kit di tamponi basato sul DIG riduce maggiormente la colorazione di fondo rispetto a quella ottenuta con siero di capra normale e albumina sierica bovina.L'attività endogena della perossidasi può inoltre causare una colorazione di fondo elevata. Questi studi mostrano che l'immersione degli embrioni di afide nel metanolo può sopprimere l'attività della perossidasi in modo molto più efficiente rispetto al trattamento degli embrioni con perossido di idrogeno. Le condizioni critiche evidenziate in questo studio possono essere applicate per la rivelazione del segnale sia nelle cellule germinali che nelle cellule somatiche.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire con successo l'immunomarcatura su embrioni di afidi, inclusi l'amplificazione dell'intensità del segnale e la riduzione della colorazione di fondo. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di manipolare con delicatezza ogni embrione per ottenere una buona forma degli embrioni.Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e DAPI può essere estremamente pericoloso e che si devono sempre adottare precauzioni, come l'uso di guanti, durante l'esecuzione di questa procedura. Al termine di questa procedura, possono essere eseguite altre analisi come l'ibridazione *in situ* per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se l'RNA messaggero è localizzato insieme al suo prodotto proteico nelle cellule embrionali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia ambientale degli insetti, come il modo in cui vengono specificate le cellule germinali e come vengono determinate le cellule uovo in diverse fasi riproduttive negli afidi.

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Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: laumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo (Video) | JoVE Journal

Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l'aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

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