Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l'aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

L'obiettivo generale di questo protocollo di immunocolorazione è quello di rilevare l'espressione proteica negli embrioni di afidi. Vengono identificate condizioni critiche che aumentano la permeabilità dei tessuti e diminuiscono la colorazione di fondo, entrambi problemi di lunga data quando si colorano i tessuti embrionali degli afidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce condizioni specifiche per un'efficace penetrazione degli anticorpi e la riduzione della colorazione di fondo, che di solito non sono descritte in un protocollo di immunocolorazione standard.

Abbiamo avuto questa idea per la prima volta di questa misura quando stavamo studiando come le cellule germinali sono specificate in un afide del pisello, una varietà di modello di insetto, per la genomica e gli studi ambientali. Il ceppo di laboratorio dell'afide del pisello, a. pisum, è stato originariamente raccolto nel centro di Taiwan ed è stato allevato su piante ospiti per più di 300 generazioni.

Per germogliare, immergi i semi delle piante ospiti in acqua di rubinetto per tre-cinque giorni a temperatura ambiente. Riempire l'acqua fresca una volta al giorno. Coltiva dieci semi in germinazione in un piccolo vaso con terra nella camera di crescita in un periodo fotografico di 16 ore di luce, otto ore di buio, a 20 gradi Celsius.

Circa 10 giorni dopo l'inizio della crescita, l'altezza delle piante è solitamente superiore agli otto centimetri. Tenete ogni vaso di piante all'interno di un bicchiere di vetro da un litro e trasferite gli afidi adulti sulle piante usando un pennello. Quindi, sigillare il becher con una copertura permeabile all'aria, come una rete di garza, per evitare la fuoriuscita degli afidi.

Incubare gli afidi nella camera di crescita in un fotoperiodo di 16 ore di luce, otto ore di buio, a 20 gradi Celsius, annaffiando ogni vaso di piante una volta al giorno. Riempire un pozzetto di una piastra spot con circa 500 microlitri di paraformaldeide al 4%. Posizionare la piastra sotto uno stereomicroscopio a basso ingrandimento e immergere un afide adulto nella paraformaldeide per la dissezione.

Sezionare le ovaie tenendo la testa e l'addome con una serie di pinze, tagliando la cuticola dorsale dell'addome e trascinando le ovaie lontano dalla cavità addominale. Quindi, fissare tre paia di ovaie in una provetta da 1,5 millilitri contenente un millilitro di paraformaldeide a temperatura ambiente per 20 minuti, agitando leggermente su un mixer. Eliminare il tampone di fissazione con un contagocce di vetro, quindi lavare le ovaie con PBST tre volte per 10 minuti, agitando leggermente.

Per trattare le ovaie, incubarle prima con proteinasi K per 10 minuti agitando leggermente per aumentare la permeabilità dei tessuti embrionali. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione di proteinasi K, quindi lavare le ovaie con 700 microlitri di glicina tre volte per cinque minuti. Successivamente, lavare le ovaie con PBST due volte per 10 minuti.

Fissare nuovamente le ovaie con un tampone di fissazione per 15 minuti a temperatura ambiente agitando leggermente. Per sopprimere l'attività della perossidasi engoenosa, disidratare in serie le ovaie con diverse percentuali di metanolo nello 0,2% di PBST con rapporti di volume da uno a tre, uno a uno e tre a uno, quindi incubare ulteriormente le ovaie con metanolo al 100% per un'ora a temperatura ambiente con un leggero agitamento. Quindi, reidratare in serie le ovaie, come indicato nel protocollo di testo.

Per tre paia di ovaie in una provetta da 1,5 millilitri, 200 microlitri è il volume minimo per il blocco del campione e la colorazione degli anticorpi. Incubare le ovaie con la soluzione bloccante 1x DIG-B per quattro ore a temperatura ambiente, o durante la notte a quattro gradi Celsius, agitando leggermente. Dopo l'incubazione, scartare il surnatante e sostituirlo con una soluzione bloccante DIG-B fresca 1x, contenente l'anticorpo primario al rapporto di diluizione appropriato.

Colorare le ovaie per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione. Dopo aver lavato le ovaie come descritto nel protocollo di testo, scartare il surnatante e sostituirlo con una soluzione bloccante DIG-B fresca 1x contenente l'anticorpo secondario al rapporto di diluizione appropriato e colorare le ovaie come prima. Per la colorazione immunofluorescente, eseguire la colorazione al buio, poiché l'anticorpo secondario è sensibile alla luce.

Lo spessore degli embrioni di afidi varia tra le fasi di sviluppo. Le strategie di montaggio vengono quindi modificate per adattarsi agli embrioni precoci, medi e tardivi. Trasferire le ovaie, insieme al terreno di montaggio, nel vassoio cellulare con un contagocce di plastica e osservare i campioni sotto uno stereomicroscopio a basso ingrandimento.

Tagliare i calli associati all'ovidotto laterale usando spilli per insetti, quindi trasferire un ovariolo isolato in un pozzetto di vetro vuoto con un contagocce. Portare il volume finale a un valore compreso tra 50 e 100 microlitri utilizzando il mezzo di montaggio. Quindi, trasferire un ovariolo sul vetrino con un contagocce di vetro.

Sezionare le camere delle uova usando spilli per insetti. Per gli embrioni di età superiore al sesto stadio di sviluppo, si suggerisce la separazione delle camere delle uova. Per la germaria e le prime due camere delle uova, la separazione è facoltativa.

Riposizionare una camera di uova sezionata su un vetrino pulito utilizzando un contagocce di vetro. Per gli embrioni nelle fasi da uno a 10 di sviluppo, posizionare lentamente un vetrino copritore sulla germaria sezionata o sulle camere delle uova per evitare bolle. In alternativa, per gli embrioni allo stadio da 11 a 18 di sviluppo, montare le camere delle uova su un vetrino con un ponte di scorrimento su un lato e posizionare un altro vetrino coprioggetti sopra il campione.

Per gli embrioni di età superiore allo stadio 19 di sviluppo, montare le camere delle uova su un vetrino con un ponte di scorrimento coprioggetti su entrambi i lati e posizionare un altro vetrino coprioggetti sopra il campione. Quindi, riempire lo spazio sotto il vetrino coprioggetto superiore con un supporto di montaggio per evitare di asciugare il campione. Arrotolare leggermente il vetrino coprioggetto superiore per ottenere il giusto orientamento per l'osservazione.

Infine, sigillare il bordo dei vetrini, compresi i vetrini copri ponte, con smalto per unghie prima di eseguire l'analisi dell'immagine, come descritto nel protocollo di testo. Qui è mostrato un paio di ovaie sezionate da una femmina adulta. Un ovariolo è composto da un germario, da uno a due O-site, più da cinque a sette embrioni, tutti alloggiati all'interno di camere uovo in catena di montaggio.

Dopo la fissazione con paraformaldeide, si raccomanda vivamente la digestione delle ovaie in soluzione di proteinasi K a una concentrazione di un microgrammo per millilitro per 10 minuti. I risultati della colorazione mostrano che l'intensità del segnale è significativamente aumentata negli embrioni digeriti con Poteinasi K. L'incubazione degli embrioni nella soluzione bloccante di un set di tamponi a base di DIG riduce la colorazione di fondo maggiore rispetto a quella degli embrioni nel siero di capra normale e nell'albumina sierica bovina.

L'attività endogena della perossidasi può anche provocare un'elevata colorazione di fondo. Questi studi rivelano che immergere gli embrioni di afidi nel metanolo può sopprimere l'attività della perossidasi in modo molto più efficiente rispetto al trattamento degli embrioni con perossido di idrogeno. Le condizioni critiche rivelate in questo studio possono essere applicate per il rilevamento del segnale sia nelle cellule germinali che nelle cellule somatiche.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire con successo l'immunocolorazione su embrioni di afidi, incluso l'aumento dell'intensità del segnale e la riduzione della colorazione di fondo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare delicatamente ogni embrione per ottenere una buona forma di embrioni.

Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e DAPI può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come i guanti, durante l'esecuzione di questa procedura. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come l'ibridazione in situ per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se l'RNA del messanger è localizzato con il suo prodotto proteico nelle cellule embrionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia ambientale degli insetti, come ad esempio come vengono specificate le cellule germinali e come vengono determinate le cellule uovo in fasi riproduttive distinte negli afidi.