Name: Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri come isolare cellule staminali tumorali dall'osteosarcoma umano mediante l'assay di formazione di sarcofere. Questo protocollo visivo dettagliato facilita la ricerca di terapie mirate contro i tumori solidi.

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Questo studio è stato supportato dalla proposta di sovvenzione ITT (Istituto Toscano Tumori) 2010.

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

CSC hanno diverse proprietà che permettono l&#39;identificazione di questo particolare sottoinsieme cellulare nella massa tumorale. Sulla base di queste caratteristiche, come la resistenza acquisita citotossica agenti chemioterapici per la sovraespressione di ATP-binding cassette multidrug trasportatori di efflusso 28, 32, 33, o per la upregulation dell&#39;espressione di enzimi detossificanti come ALDH 32, per l&#39;espressione di un particolare marcatore di superficie, come CD133, CD44, CD34, CD90, e altri 30, 34, 35, 41, diversi metodi per isolare CSC sono stati sviluppati 42-44. Una di queste tecniche è il saggio formazione sfera, che si basa sulla capacità di CSC di crescere in condizioni non aderenti. La capacità delle cellule staminali dei tessuti e CSC per formare sfere è stato descritto in studi sulla identificazione delle cellule staminali neurali da Reynolds et al. 37. Successivamente, Gibbs et al. 38 usEd questi studi per iniziare a isolare CSC da tumori solidi, in particolare, dai sarcomi ossei. Abbiamo deciso di utilizzare il metodo di dosaggio formazione sfera illustrato da Gibbs et al. Isolare CSC da linee cellulari ottenute da biopsie OSA OS convenzionali. Abbiamo adattato il metodo originale per migliorare i risultati di questo test e facilitare la sua riproducibilità per altre linee cellulari di cancro. Con riferimento alla costituzione del saggio formazione sfera, abbiamo verificato che placcatura 40.000 cellule / pozzetto è una buona pratica per mantenere le cellule in isolamento all&#39;inizio del saggio. Questo accorgimento è molto importante per evitare la possibilità che le colonie sferiche provengono da aggregazione cellulare e non dalla capacità particolare ed esclusiva di un singolo CSC di crescere in condizioni non aderenti e formare una colonia sferica. Questa capacità è un punto particolarmente critico di questo test. Abbiamo inoltre attestato che per ottenere una buona velocità di formazione sfera, È sufficiente aggiornare aliquote di fattori di crescita ogni 3 d e non tutti i giorni come descritto nel metodo originale. In questo studio, abbiamo anche stabilito e ampiamente descritto un buon metodo per isolare le colonie sferiche che si sono formate quando coltivate in condizioni non aderenti. Questo passaggio è fondamentale in questo saggio perché è molto importante cercare di isolare il maggior numero di sfere possibile che si formano in ciascun pozzetto senza danneggiarle. E &#39;anche importante isolare solo le sfere e non le singole cellule, che possono rimanere in sospensione per la durata del test. Per superare questi punti critici, abbiamo sviluppato un particolare metodo di isolamento, che, come sopra indicato, ha dato buoni risultati per isolamento CSC. Ovviamente, c&#39;è la possibilità che non tutte le sfere che formano possono essere recuperati, ma la percentuale di perdita è molto bassa. In effetti, abbiamo anche la possibilità di utilizzare un filtro con 40 micron pori per isolare sfere dopo diventano grandi (moduloed circa 100 - 200 cellule). Questo isolamento arresta formazione sfera, ma permette alle singole celle, parte del residuo metilcellulosa, e le piccole sfere da filtrare. Tale eliminazione viene eseguita mediante filtrazione completa come descritto nel protocollo. Inoltre, la selezione delle più grandi colonie sferiche attraverso i 40 micron maglia con la conseguente perdita delle colonie sferiche più piccole permette di selezionare le CSC con la più alta capacità di formare colonie sferiche e con maggiore stemness. Tutte queste modifiche sono state eseguite per migliorare l&#39;analisi e per aiutare i ricercatori che studiano CSC di comprendere e riprodurre la fase più critica del metodo originale del saggio formazione sfera. Tra gli studi in materia di metodi in vitro per la CSC isolamento, questo studio ha lo scopo di mostrare come questo saggio formazione sfera adattato potrebbe essere un buon metodo per isolare CSC dalinee cellulari OSA. Gli adattamenti del metodo originale e la tecnica dettagliata isolamento descritti migliorare la sua efficacia. In breve tempo, buon numero di CSC può essere ottenuto e utilizzato per diversi esperimenti. Pertanto, è possibile confermare rapidamente i fenotipi staminali-simili e, in particolare, per studiare il fenotipo doppio stelo-like che caratterizza OS-CSC. Così, questo test modificato potrebbe essere una buona tecnica per isolare CSC e studiare la loro biologia. In futuro, questo metodo, con ulteriori adattamenti, può anche essere utilizzata per isolare CSC da altre linee cellulari tumorali finiti ottenuti da biopsie di tumori solidi rare. La possibilità di isolare CSC da tumori solidi rare come OS, non solo permette il miglioramento degli studi su questo particolare cancro, ma si estende anche a studi di diversi tipi di cancro per sviluppare metodi migliori per il loro isolamento e futuri studi di biologia questo importante sottoinsieme cellulare. Pertanto, come abbiamohanno fatto in questo studio, è importante migliorare i metodi di isolamento CSC attraverso lo studio di CSC biologia, con l&#39;obiettivo finale di trovare bersagli molecolari e di sviluppare una terapia antitumorale molto specifico diretto contro questo particolare sottoinsieme cellulare, che è probabilmente responsabile il mantenimento del tumore primario, lo sviluppo della sua ricorrenza, e l&#39;origine di metastasi in diversi organi. Lo studio di CSC biologia è importante anche per la ricerca di terapie che potrebbero essere incisivo nella cura di tumori, come il sistema operativo, per i quali il tasso di sopravvivenza dopo il trattamento neoadiuvante rimane molto povera.

I sarcomi sono un gruppo eterogeneo di tumori rari del tessuto connettivo maligni provenienti prevalentemente dal mesoderma embrionale 1. I diversi tipi includono sarcomi ossei e sarcomi dei tessuti molli. sarcomi ossei, un gruppo di tumori primari relativamente poco diffusa, costituiti da diversi sottotipi, tra osteosarcoma (OS). OS, uno dei tumori più comuni primari dell&#39;osso, è un tumore maligno mesenchimali che esibisce vasta clinica, istologica e eterogeneità molecolare 2, 3. Sfortunatamente, OS verifica prevalentemente nei bambini e nei giovani adulti 4, 5 e rappresenta il 60% i sottotipi istologici comuni di sarcoma osseo nell&#39;infanzia 6, 7. OS colpisce di solito le aree scheletrici, che sono caratterizzati da una crescita ossea rapida (ad esempio, la metafisi delle ossa lunghe). Tra i istologicamente differenti sottotipi di OS, OS convenzionale, chiamato anche midollare o OS centrale, ha un alto grado di malignità e sha contingentere del 80% 8. Questo 80% è composto da 60% OS convenzionale osteoblastica, 10% OS chondroblastic, e il 10% OS fibroblastico 6, 8-10. Altri sottotipi OS includono anaplastico, telangectasico, gigante ricco di cellule e piccoli OS cellule. Nonostante i progressi della chirurgia e chemioterapia combinata nella gestione del sistema operativo, il risultato rimane scarsa, con un tasso di sopravvivenza a lungo termine del 65-70% nei pazienti senza metastasi 11, 12. Ricorrenze lontane si verificano di frequente come metastasi polmonari o, meno frequentemente, come le metastasi alle ossa lontane e recidive locali 13. Le metastasi sono spesso resistenti ai trattamenti convenzionali. Questa resistenza è la ragione per cui la sopravvivenza libera da malattia a 10 anni è di circa il 30% nei pazienti con malattia metastatica alla diagnosi 14, 15. Come con tessuto normale, tessuto del cancro è composto da un insieme eterogeneo di tipi cellulari. Le cellule all&#39;interno del tumore sembrano corrispondere a diversi stadi di sviluppo. All&#39;interno di ogni ntessuto ormal risiede una sottopopolazione di cellule con la capacità di selfrenew, fornendo così progenitori e cellule mature per omeostasi tissutale. Analogamente, il cancro è composto di una popolazione eterogenea di cellule simili a diversi stadi di sviluppo, con differenti gradi di proliferazione e potenziale oncogeno. Un sottoinsieme di queste cellule tumorali, definito cellule staminali tumorali (CSC), costituisce una riserva di Portante in cellule con la capacità esclusiva di selfrenew e mantenere il potenziale maligno dei tumori, generando così le diverse linee cellulari che costituiscono la massa tumorale 16. Nel 1990, gli studi sulla leucemia mieloide acuta fornito la prima prova convincente per l&#39;esistenza di CSC sottopopolazioni 17, 18. CSC da allora sono stati isolati da un gran numero di tumori solidi 19, diventando così uno degli argomenti più studiati nella ricerca sul cancro. CSC può infatti derivare da cellule staminali normali da mutazioni nei geni che rendono il normalele cellule staminali cancerose 20-23. Mutazioni multiple trasformando e le interazioni con il microambiente potrebbe anche contribuire a progenitori sane e cellule mature che acquisiscono la capacità selfrenewal e l&#39;immortalità che caratterizzano CSC. Ci sono diverse ipotesi su questa trasformazione. Progenitori sane, le cellule mature sane e cellule tumorali, possono dedifferentiate alle cellule staminali, ottenendo un fenotipo staminali come attivando geni selfrenewal-associata 24-28. Nonostante i numerosi studi recenti, le origini del CSC sono ancora da scoprire. Una caratteristica particolare del CSC è che la loro capacità di resistere alla approccio multi-terapia, che consiste di chirurgia e chemioterapia combinata con diversi farmaci. Recenti studi hanno dimostrato che la CSC può anche acquisire resistenza agli agenti chemioterapici citotossici. Le possibili spiegazioni per questa resistenza sono la sovraespressione di ATP-binding cassette (ABC) multidrug transporter (vale a dire,MDR1 e BCRP1), sovraespressione di chemioterapia metabolizzare enzimi come l&#39;aldeide deidrogenasi 1 (ALDH1), e / o cambiamenti nella cinetica del ciclo cellulare 30-33. La conseguenza diretta di tutti questi concetti che sono stati descritti finora è che una terapia del cancro sarebbe efficace solo se la sottopopolazione CSC sono stati completamente eliminato, mentre recidiva locale o metastasi a distanza potrebbero verificarsi se anche un solo CSC sopravvissuto. La scoperta di CSC nei sarcomi umani 34, in particolare OS 35, o in qualsiasi altro tumori ossei e dei tessuti molli, ha una grande importanza clinica in quanto offre una possibile spiegazione del perché molti trattamenti sembrano essere efficaci inizialmente, ma i pazienti in seguito ricaduta. Pertanto, la speranza per il futuro battaglia contro OS convenzionale è quello di trovare nuove e specifiche terapie mirate basata sullo sviluppo di farmaci innovativi diretti a OS-CSC grazie alla caratterizzazione molecolare di questo subpopolazione e allo studio della biologia CSC. Nel 1992, Reynolds e colleghi, che stavano indagando se un sottogruppo di cellule staminali era presente nel cervello dei mammiferi adulti, sviluppato un metodo per isolare le cellule sospettate di essere cellule 36, 37 stem-like. Questo metodo si basa sulla capacità particolare di queste cellule a formare colonie sferiche se coltivate in condizioni non aderenti. Tecniche simili sono state impiegate da Gibbs e colleghi nel 2005 per studiare una sottopopolazione di cellule staminali simil-in sarcomi dell&#39;osso 38. Per isolare e caratterizzare OS-CSC da colture cellulari primarie di diversi tipi di sistema operativo convenzionale, abbiamo deciso di adattare questa tecnica per linee di cellule del sistema operativo. Qui, descriviamo questo metodo adattato del dosaggio formazione ambito, denominato &quot;assay sarcosphere&quot;, che può essere utilizzato per isolare OS-CSC da linee cellulari primarie derivate finite da biopsie umane di OS convenzionale. Noi descriviamo anche tutte le tecniche used per convalidare la radice come CSC fenotipo delle linee cellulari isolate da questo test: 1) valutazione dell&#39;espressione dei geni che caratterizzano pluripotenti cellule staminali embrionali (ESC) e del gene CD133, che è un marker di CSC; 2) (CFU) saggio formanti colonia unità; 3) valutazione della capacità di queste cellule di differenziarsi in osteoblasti e adipociti sotto opportune condizioni di differenziazione; 4) studio dei marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali (MSC) (vale a dire, CD44, CD105 e Stro-1) per immunofluorescenza e mediante analisi di citometria di flusso; 5) valutazione dell&#39;attività ALDH di queste cellule.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco con Ca2+ e Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco&nbsp; senza Ca2+ e Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Tripsina suina 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione di riserva: Polvere</td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione stock: Collagenasi in polvere</td></tr><tr><td>da Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>Solvente: Soluzione tampone, pH 7,4. Concentrazione di riserva: Polvere</td></tr><tr><td>di dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F-12 Prosciutto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>Solvente: dH2O. Concentrazione di riserva: Polvere</td></tr><tr><td>2-Fosfo-L-ascorbico acido trisodico</td><td>sale Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione di riserva: 5 mg/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Glicerolo fosfato sale disodico pentaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione di riserva: 1 M</td></tr><tr><td>Insulina. Solvente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td> ricombinante umano<td>: NaOH 0,1 M. Concentrazione di riserva: 10 mM</td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Solvente: DMSO. Concentrazione di riserva: 500 mM</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>Solvente: DMSO. Concentrazione di riserva: 200 mM</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>Solvente: DMSO. Concentrazione delle scorte:&nbsp; 1 mM / 100 &micro;M. Conservare in azoto liquido per mantenere l'attività biologica</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino Sud America&nbsp;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (PEN-STREP) 10.000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>Solvente: dH2O. Concentrazione standard: 2%</td></tr><tr><td>Putresceina dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>Solvente: dH2O. Concentrazione standard: Polvere</td></tr><tr><td>apo-Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione di riserva: 25 mg/mL</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico umano (EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>Solvente: DPBS pH 7,4. Concentrazione di stock: 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-Solvente umano di base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td>: <td>DPBS + 0,2% BSA. Concentrazione di stock: 25 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Acido Selenoso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione di base: 30 mM</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Solvente: ETOH. Concentrazione stock: 10 mM</td></tr><tr><td>Blu di toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich 198161</td><td></td><td>Solvente: Ultrapuro dH2O. Concentrazione stock: Olio</td></tr><tr><td>in polvere Rosso O</td><td>ICN Biochemicals</td><td>155984</td><td>Solvente: 2-Propanolo. Concentrazione madre: Polvere</td></tr><tr><td>Naftolo AS-MX Fosfato Sale disodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>Solvente: DMSO. Concentrazione di riserva: Powder</td></tr><tr><td>Fast Blue BB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>Solvente: Tris HCL, pH 9.0. Concentrazione di riserva: Polvere</td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>Solvente: Tris HCL, pH 9,1. Concentrazione di riserva: Albumina</td></tr><tr><td>sierica bovina in polvere, Frazione V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione stock: 2%</td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>ICN Biochemicals</td><td>100375</td><td>Solvente: Ultrapuro dH2O. Concentrazione stock: Polvere</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione delle scorte: 0,2%. Pericolo - Utilizzare solo sotto cappa chimica</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>Solvente: DPBS . Concentrazione di stock: 200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>Pericolo - Utilizzare solo sotto cappa chimica</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Monoclonale di topo [SN6] a CD105 (FITC)</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>Liquido. Applicazione:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria a flusso (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Monoclonale di topo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Da [F10-44-2] a CD44 (PE/Cy7&reg;) )</td><td>Abcam</td><td>ab46793</td><td>Liquido. Applicazione:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria a flusso (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD45&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Monoclonale di topo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Da [MEM-28] a CD45 (PerCP))&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65952</td><td>Liquido. Applicazione:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria a flusso (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Anticorpo umano CD105 purificato)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10500</td><td>solvente: DPBS. Concentrazione del brodo: Liofilizzato. Applicazione: Colorazione in immunofluorescenza (IF)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Anticorpo anti-CD44)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione del brodo: Liofilizzato. Applicazione: Colorazione in immunofluorescenza (IF)</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Topo anti-STRO-1)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>398401</td><td>solvente: DPBS. Concentrazione del brodo: Liofilizzato. Applicazione:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria a flusso (Flow Cyt)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Colorazione in immunofluorescenza (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (IgG anti-coniglio (Alexa Fluor 488 IgG anti-coniglio d'asino (H+L))</td><td>Solvente Invitrogen</td><td>A-21206</td>: <td>DPBS. Concentrazione del brodo: Liofilizzato. Applicazione: Colorazione in immunofluorescenza (IF)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione del brodo: Liofilizzato. Applicazione:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria a flusso (Flow Cyt)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Colorazione in immunofluorescenza (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 Phalloidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>Solvente: DPBS. Concentrazione del brodo: Liofilizzato. Applicazione: Colorazione in immunofluorescenza (IF)</td></tr><tr><td>AutoMACS&trade; Tampone di corsa MACS Tampone di separazione</td><td>Miltenyi</td><td>130.091.221</td><td>Liquido. Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>QIAzol&reg; Reagente di lisi</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>Pericolo - Utilizzare solo sotto cappa chimica</td></tr><tr><td>QUANTITECT&reg; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Kit di Trascrizione Inversa</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorophorm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Liquido. Pericolo - Utilizzare solo sotto la cappa chimica</td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Cappa chimica</td><td>ARREDI TECNICI &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Villa</td><td>Modello&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; DINAMICO_</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopia confocale a scansione laser LSM 5109 Meta&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>iCycler PCR Termociclatore&nbsp;</td><td>BIORAD</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>CyFlow&reg; SPAZIO&nbsp;</td><td>(PARTEC)</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Micrposcopio Invertito Axiovert 200M&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento ,</td><td>Nalgene</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipet-Aid originale</td><td>pbiBrand</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>EPPENDORF</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in vetro</td><td>SIGMA</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>VICTOR3&commercio; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>PERKIN ELMER_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubi conici&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (15 e 50 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>352096 (per 15 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 352070 (per 50 mL)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare multipozzetto a fondo piatto trasparente a 24 pozzetti</td><td>BD FALCON</td><td>353047</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti multipli con attacco ultra basso a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti</td><td>CORNING</td><td>3471</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (5 e 10 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>357543 (per 5 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 357551 (per 10 ml)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringa (5 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>B|BRAUN</td><td>4617053V</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra Petri 100X20 mm &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>R&ouml; hren Tubes&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (3,5 mL, 55x12mm, PS)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>55.484</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra Petri 60X15 mm &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353004</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Crioviali 1,5 mL&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>NALGENE</td><td>5000-1020</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Palloni per colture cellulari 25 cm&sup2; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353014</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro a rete in nylon,</td><td>idrofilo MERCK</td><td>NY4104700</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Portafiltro Swinnex</td><td>MERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzetta Perry&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Lancetta</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Stupido</td><td>_</td><td>_</td><td>_</td></tr></tbody></table>

istituzione di cancer stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Gli attuali miglioramenti nella terapia contro osteosarcoma (OS) hanno prolungato la vita dei pazienti affetti da cancro, ma il tasso di sopravvivenza di cinque anni rimane scarsa quando si è verificato metastasi. L&#39;(CSC) teoria Cancer Stem Cell ritiene che ci sia un sottogruppo di cellule tumorali all&#39;interno del tumore che hanno caratteristiche staminali-simili, compresa la capacità di mantenere il tumore e di resistere chemioterapia multifarmaco. Pertanto, una migliore comprensione della biologia del sistema operativo e la patogenesi è necessaria al fine di promuovere lo sviluppo di terapie mirate per sradicare questo particolare sottoinsieme e per ridurre la morbilità e la mortalità tra i pazienti. Isolando CSC, che stabilisce colture cellulari di CSC, e studiare la loro biologia sono importanti passi per migliorare la nostra comprensione della biologia del sistema operativo e la patogenesi. La creazione di OS-CSC di derivazione umana da biopsie di OS è stato reso possibile utilizzando diversi metodi, tra cui la capacità di creare colture di cellule staminali 3-dimensionale sotto nonadherecondizioni NT. In queste condizioni, CSC possono creare colonie galleggianti sferici formate da cellule staminali derivate; queste colonie sono denominate &quot;sfere cellulari&quot;. Qui, si descrive un metodo per stabilire le culture CSC da colture cellulari primarie di OS convenzionale ottenuti da biopsie del sistema operativo. Descriviamo chiaramente i vari passaggi necessari per isolare e caratterizzare CSC.

La presenza di cellule staminali tumorali (CSC) in sarcomi ossei è stato recentemente collegato a loro patogenesi. In questo articolo, vi presentiamo l&#39;isolamento di CSC da colture cellulari primarie ottenute da biopsie umane di osteosarcoma convenzionale (OS) con la capacità di CSC di crescere in condizioni non aderenti.

Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

L'obiettivo generale di questo saggio è isolare cellule staminali tumorali da una linea cellulare finita ottenuta da osteosarcomi umani. Il principale vantaggio di questo lavoro consiste nel mostrare chiaramente ad altri ricercatori nel campo dell'oncologia come isolare, in vitro, le cellule staminali tumorali. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per studiare terapie contro l'osteosarcoma e altri tumori solidi.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo argomento avranno difficoltà se non sanno come isolare le colonie di sarcoma. Una dimostrazione visiva è fondamentale, poiché il passaggio di isolamento è complesso da eseguire e da comprendere. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questa tecnica quando avevamo letto dell'assay di formazione di sfere.Descritto da Gypsum e collaboratori. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Gaia Palmini, studentessa di dottorato, e dal dott. Roberto Zonefrati, tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, preparare tutti i mezzi di coltura necessari.Buffer di digestione e altre soluzioni necessarie per la procedura. Successivamente, stabilire una linea cellulare finita di osteosarcoma isolando l'osteosarcoma da un agoaspirato o da un campione bioptico chirurgico confermato, quindi sottocolturando le cellule ottenute come descritto nell'articolo di testo allegato.Una volta stabilita la coltura cellulare di osteosarcoma e quando la piastra è vicina alla confluenza, rimuovere il mezzo per aspirazione e trattare le cellule con tripsina per staccarle dalla piastra. Trasferire le cellule in una provetta pulita e pipettare delicatamente su e giù la sospensione cellulare al fine di disperdere eventuali aggregati cellulari.Successivamente, prelevare dieci microlitri della sospensione cellulare e trasferirli in una camera di emocitometro. Posizionare la camera di emocitometro sotto un microscopio a contrasto di fase e calcolare la concentrazione delle cellule nella sospensione. Quindi, aggiungere 280.000 cellule a 35 millilitri di mezzo di crescita per sferoidi sarcosferici, contenente metilcellulosa, e mescolare delicatamente la soluzione utilizzando una pipetta, per disperdere eventuali aggregati.Trasferire cinque millilitri della miscela cellulare in ogni pozzetto di piastre a sei pozzetti con superficie ultra bassa adesiva. Una volta seminate, utilizzare un microscopio invertito per osservare l'aspetto delle cellule e verificare se sono adeguatamente isolate. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al cinque percento.Ogni tre giorni, aggiungere nei singoli pozzetti alcolati freschi di beta FGF ed EGF per rinnovare la concentrazione dei fattori di crescita. Valutare l'andamento del saggio delle sarcosfere osservando le cellule al microscopio ai giorni 7, 14, 20, 21 e 28. Quando si osserva la presenza di grandi sarcosfere nere, raggruppate tutte al centro del pozzetto, interrompere la coltura e iniziare il processo di desolazione.Quando è il momento di isolare il sarcosfera, utilizzare una pipetta sterile da 1.000 microlitri per trasferire il mezzo contenente i sarcosfere in una siringa dotata di un supporto sterile per filtro a membrana. Dopo aver rimosso completamente il mezzo contenente i sarcosfere, aggiungere cinque millilitri di mezzo di crescita nel pozzetto e risciacquare accuratamente, raccogliendo eventuali sfere rimanenti.Quindi, utilizzare un microscopio per verificare se tutti i sarcosfere sono stati recuperati. In caso contrario, lavare nuovamente la pozzetta finché la raccolta delle sfere non è completa. Successivamente, filtrare la sospensione attraverso il porta filtro a membrana per gravità, in modo da non danneggiare le sfere e assicurarsi che nessuna sarcosfera passi attraverso il filtro.Durante questo processo, rimuovere eventuali bolle d'aria utilizzando delicatamente una pipetta di vetro sterile. Una volta filtrati tutti i sarcosfere, lavare l'unità di filtrazione aggiungendo direttamente dieci millilitri di mezzo di crescita alla siringa e lasciandolo filtrare senza pressione, per assicurarsi di eliminare le cellule singole. Dopo che la sospensione di sarcosfere è stata filtrata, è necessario scartare il filtro del liquido e prestare particolare attenzione al recupero dei sarcosfere che si trovano intrappolati nel filtro a rete.A questo punto, smontare l'unità del filtro, rimuovendola dalla siringa, e posizionarla in una capsula di Petri da 100 millimetri. Rimuovere il filtro reticolato dal supporto del filtro a membrana utilizzando una pinzetta sterile peri.E trasferire il filtro in una nuova piastra di Petri da 60 millimetri. Quindi, lavare il filtro reticolare agitandolo delicatamente, aggiungendo contemporaneamente cinque millilitri di mezzo di crescita, al fine di rilasciare le sarcosfere dall’intrico della membrana.Successivamente, posizionare la membrana in una pozzetta e verificare mediante osservazione al microscopio che non ci siano più sfere impigliate nella membrana. Lavare nuovamente la membrana, quindi riesaminarla al microscopio se sono ancora presenti sfere intrappolate. Quando nella membrana non restano più sfere, incubarla in mezzo di crescita per far sviluppare le sarcosfere in un monostrato.Monitorare la crescita delle cellule staminali tumorali dell'osteosarcoma, ottenute dai sarcosfere. Fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza di circa il 90% in una piastra di Petri da 60 millimetri. Oltre ai numerosi protocolli standard presenti in questo articolo, i metodi per valutare la capacità di differenziazione, l'attività di ALDH, la citometria a flusso, l'immunofluorescenza e l'analisi di RTPCR sono descritti in dettaglio nel protocollo testuale allegato.I campioni di osteosarcoma vengono ottenuti mediante aspirato con ago o mediante sezione chirurgica. Se trattati correttamente, richiedono circa un mese per raggiungere la confluenza in una piastra di Petri da 100 millimetri. Dopo l'espansione, le cellule vengono seminate in piastre a sei pozzetti con superficie ultra bassa di adesione, per avviare il saggio di sarcosfera.Questa piastra mantiene le cellule in uno stato sospeso e ne impedisce l'adesione al substrato. Dopo sette giorni, si osservano diverse piccole colonie sferiche circondate da cellule singole. Dopo 28 giorni, si osservano diverse grandi sarcosfere.Una volta isolate le colonie sferiche, le cellule tumorali con caratteristiche di cellule staminali possono essere espanse a partire da singoli sarcosferei, collocandoli su piastre normali per l'adesione. Le colorazioni immunofluorescenti hanno mostrato un fenotipo simile a quello delle cellule staminali mesenchimali, poiché le cellule espanse risultavano positive per CD44 e CD105 e moderatamente positive per Stro-1. La RT-PCR ha inoltre confermato positivamente il fenotipo delle cellule staminali embrionali mediante l'espressione di tre geni marcatore delle cellule staminali embrionali.Nanog, Oct 3/4 e Sox2. E il gene CD133, un marcatore per le cellule staminali tumorali dell'osteosarcoma. La tecnica dettagliata di isolamento qui mostrata in questo video aprirà la strada ad altri ricercatori nello studio delle cellule staminali tumorali, mostrando loro come comprendere e riprodurre i passaggi più critici del saggio di formazione di sfere.Questo saggio modificato è una buona tecnica per isolare cellule staminali tumorali e studiarne la biologia. Questo metodo, con ulteriori adattamenti, può essere utilizzato anche per isolare cellule staminali tumorali da altre linee cellulari tumorali finite, ottenute mediante biopsie di tumori solidi.In conclusione, l'isolamento di cellule staminali tumorali da diversi tipi di tumori permetterà lo studio della loro biologia, con l'obiettivo finale di identificare bersagli molecolari e sviluppare terapie antitumorali altamente specifiche dirette contro particolari sottogruppi cellulari.

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L'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC) direttamente da tessuti umani è necessaria per la loro caratterizzazione biologica. Questo manoscritto descrive una metodologia per l'isolamento di CSC prostata da tessuti umani, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei problemi passi difficili.

Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicati nel tumore recidiva a causa di chemioresistenza. Abbiamo ottimizzato un protocollo per la selezione ed espansione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma ovarico. Trattando le cellule con il cisplatino chemioterapico e coltura in una cellula staminale promuovere media che arricchiscono per le culture CSC non aderenti.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore dalle cellule tumorali che hanno avuto l'ecosmia torace dal paziente xenografti derivati dal paziente mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, usando l'antigene leucocito umano-1 (HLA-1) come marcatore negativo, e per l'ulteriore convalida e caratterizzazione di queste cellule tumorali hLA-1-negative.

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

Fenotipi cellulari tumorali dormienti e attivi sono stati caratterizzati usando la formazione immagine fase quantitativa. Analisi di proliferazione, la migrazione e la morfologia delle cellule sono state integrate e analizzate in un metodo semplice.

Una fase di time-lapse, privo di etichetta, quantitativa Imaging Studio delle cellule tumorali umane dormienti e attivo

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Lo scopo di questa metodologia è quello di identificare le cellule staminali tumorali (CSC) nelle linee cellulari del cancro e nei campioni tumorali umani primari con il protocollo di formazione della sfera, in modo robusto, utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipica con citometria di flusso e occidentale Macchia.

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Il presente protocollo descrive il metodo per stabilire un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente (PDX) utilizzando tessuto di osteosarcoma umano.

Istituzione di un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente con tessuti di osteosarcoma umano

Scopri come isolare cellule staminali tumorali dall'osteosarcoma umano mediante l'assay di formazione di sarcofere. Questo protocollo visivo dettagliato facilita la ricerca di terapie mirate contro i tumori solidi.

Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

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